交大近代儀器分析課件第四章Fluorometry

1、第四章第四章 熒熒 光光 分分 析析 法法 ( (FluorometryFluorometry) )一、一、分子發(fā)光的類(lèi)型分子發(fā)光的類(lèi)型分子發(fā)光分子發(fā)光分子熒光分子熒光(molecular fluorescence) 分子磷光分子磷光(molecular phosphorescence)化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)生物發(fā)光生物發(fā)光(bioluminescence)二、二、基本原理基本原理1.熒光、磷光的產(chǎn)生及去活化過(guò)程熒光、磷光的產(chǎn)生及去活化過(guò)程A、基態(tài)基態(tài) 2 2 B、激發(fā)單線態(tài)、激發(fā)單線態(tài)* * C、激發(fā)三線態(tài)、激發(fā)三線態(tài)* * 能能量量 * * *A B C 單

2、線態(tài)和三線態(tài)的電子分布單線態(tài)和三線態(tài)的電子分布熒光、磷光能級(jí)圖熒光、磷光能級(jí)圖S0S1S2T1FP振動(dòng)馳豫振動(dòng)馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換系間跨越系間跨越FP輻輻 射射無(wú)輻射無(wú)輻射振動(dòng)馳豫振動(dòng)馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間跨越系間跨越2. 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜和發(fā)射光譜a. 熒光物質(zhì)分子都具有兩個(gè)特征光譜熒光物質(zhì)分子都具有兩個(gè)特征光譜： 激發(fā)光譜激發(fā)光譜(excitation spectrumexcitation spectrum) 發(fā)射光譜發(fā)射光譜(fluorescence spectrumfluorescence spectrum) 激發(fā)光譜激發(fā)光譜：指：指不同激發(fā)波長(zhǎng)不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物

3、質(zhì)發(fā)射的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)某一波長(zhǎng)的相對(duì)效率的相對(duì)效率。F ex 熒光光譜熒光光譜：表示在所發(fā)射的熒光中：表示在所發(fā)射的熒光中各種波長(zhǎng)各種波長(zhǎng)組分組分的相對(duì)強(qiáng)度的相對(duì)強(qiáng)度. F fl b.激發(fā)光譜和熒光光譜的用途激發(fā)光譜和熒光光譜的用途v定量分析：在作定量分析時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)和定量分析：在作定量分析時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)應(yīng)選在最大發(fā)射強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的激發(fā)熒光波長(zhǎng)應(yīng)選在最大發(fā)射強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)處，分別稱(chēng)為最大激發(fā)波長(zhǎng)波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)處，分別稱(chēng)為最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大熒光波長(zhǎng)。和最大熒光波長(zhǎng)。v定性分析：在一定條件下，每一種熒光物定性分析：在一定條件下，每一種熒光物質(zhì)都有兩個(gè)特征的光譜質(zhì)都有

4、兩個(gè)特征的光譜激發(fā)光譜和熒光激發(fā)光譜和熒光光譜；光譜；c. 光譜特征光譜特征1）Stokes shift E=h/ E 最大熒光波長(zhǎng)最大熒光波長(zhǎng) 最大激發(fā)波長(zhǎng)最大激發(fā)波長(zhǎng)2）熒光光譜和激發(fā)光譜大致成鏡像對(duì)稱(chēng)熒光光譜和激發(fā)光譜大致成鏡像對(duì)稱(chēng)熒光光譜熒光光譜激發(fā)光譜激發(fā)光譜S0振動(dòng)能級(jí)振動(dòng)能級(jí)S1*振動(dòng)能級(jí)振動(dòng)能級(jí)300400500nmF硫酸奎寧的激發(fā)光（紅）譜和熒光光譜（藍(lán)）3）. 熒光光譜的形狀通常與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)熒光光譜的形狀通常與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)S0S0S1*S1*S2*S0e.g.3. 熒光產(chǎn)生的條件熒光產(chǎn)生的條件a. 熒光效率（熒光量子產(chǎn)率熒光效率（熒光量子產(chǎn)率 ）= =發(fā)射熒光的分子數(shù)發(fā)射

5、熒光的分子數(shù)激發(fā)態(tài)的分子數(shù)激發(fā)態(tài)的分子數(shù)發(fā)射的光子數(shù)發(fā)射的光子數(shù)吸收的光子數(shù)吸收的光子數(shù)b. 熒光與有機(jī)物結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光與有機(jī)物結(jié)構(gòu)的關(guān)系 * （ 104）躍遷類(lèi)型躍遷類(lèi)型 n * （ 102） * 能產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光能產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光在具有剛性平面結(jié)構(gòu)的在具有剛性平面結(jié)構(gòu)的 電子共軛體系的分子中電子共軛體系的分子中 電子共軛度電子共軛度分子平面度分子平面度量子產(chǎn)率量子產(chǎn)率熒光越易產(chǎn)生熒光越易產(chǎn)生e.g.聯(lián)二苯聯(lián)二苯= 0.2 c芴芴 = 1.0c.c.影響熒光強(qiáng)度的外部因素影響熒光強(qiáng)度的外部因素溫度升高，熒光效率和熒光強(qiáng)度將降低；溫度升高，熒光效率和熒光強(qiáng)度將降低；溶劑極性越大，熒光波長(zhǎng)將會(huì)長(zhǎng)移

6、；溶劑極性越大，熒光波長(zhǎng)將會(huì)長(zhǎng)移；溶劑粘度越小，熒光強(qiáng)度越?。蝗軇┱扯仍叫?，熒光強(qiáng)度越??；pHpH值的影響，熒光物質(zhì)都有它最適宜的值的影響，熒光物質(zhì)都有它最適宜的pHpH范圍范圍; ;熒光熄滅劑的影響熒光熄滅劑的影響散射光的干擾散射光的干擾4. . 定量分析方法定量分析方法a. 熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的關(guān)系熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的關(guān)系IF = k1（I0-I）II0= 10-bcIF = 2.3k1 I0 bcbc0.05I0一定IF = kc式中表明式中表明：（IF只與只與I0有關(guān)有關(guān)）I0IF紫外可見(jiàn)分光光度法紫外可見(jiàn)分光光度法I0II0不一定不一定靈敏度靈敏度：熒光法熒光法 紫外可見(jiàn)分光光度法紫

7、外可見(jiàn)分光光度法b. 定量方法定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法：c IF cx IFx 比例法：比例法：csIFs IFo = k csIFx - IFo = k cxcx =IFx IFoIFs - IFo三、三、熒光分析儀器熒光分析儀器光源光源第一單色器第一單色器樣品池樣品池第二單色器第二單色器檢測(cè)器檢測(cè)器放大器和放大器和記錄儀記錄儀I0IF四、四、熒光新技術(shù)熒光新技術(shù)激光熒光分析（光源：激光）；激光熒光分析（光源：激光）；時(shí)間分辨熒光分析（熒光壽命的差異）；時(shí)間分辨熒光分析（熒光壽命的差異）；同步熒光分析（選擇波長(zhǎng)差值，同時(shí)掃描兩波譜）同步熒光分析（選擇波長(zhǎng)差值，同時(shí)掃描兩波譜）膠束增敏熒

8、光分析膠束增敏熒光分析膠束增敏熒光分析膠束增敏熒光分析膠束溶液膠束溶液表面活性劑溶液表面活性劑溶液親水集團(tuán)（極性）親水集團(tuán)（極性）疏水集團(tuán)（非極性疏水集團(tuán)（非極性）膠束直徑膠束直徑：3-6nm（膠體溶液膠體溶液）膠束溶液對(duì)熒光物質(zhì)的作用膠束溶液對(duì)熒光物質(zhì)的作用增溶增溶增穩(wěn)增穩(wěn)增敏增敏水溶液中的正膠束水溶液中的正膠束極性極性非極性非極性作用原理作用原理 非極性的有機(jī)物與膠束的非極性尾部有親和作用，使熒光分子非極性的有機(jī)物與膠束的非極性尾部有親和作用，使熒光分子定位于膠束的親脂性?xún)?nèi)核中，這也對(duì)熒光分子起到了一定的保護(hù)作定位于膠束的親脂性?xún)?nèi)核中，這也對(duì)熒光分子起到了一定的保護(hù)作用，減弱了熒光質(zhì)點(diǎn)之間

9、的碰撞，減少了分子的無(wú)輻射躍遷，增加用，減弱了熒光質(zhì)點(diǎn)之間的碰撞，減少了分子的無(wú)輻射躍遷，增加了熒光效率，從而增加了熒光強(qiáng)度。了熒光效率，從而增加了熒光強(qiáng)度。五、五、化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)發(fā)光（化學(xué)發(fā)光（chemiluminescencechemiluminescence）：）： 不是由不是由光、熱和電能光、熱和電能而是由化學(xué)反應(yīng)激而是由化學(xué)反應(yīng)激發(fā)物質(zhì)所產(chǎn)生的光輻射發(fā)物質(zhì)所產(chǎn)生的光輻射1. 化學(xué)發(fā)光分析的基本原理化學(xué)發(fā)光分析的基本原理A + B C* + DC* C +h 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件：化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件：化學(xué)反應(yīng)必須快速放出足夠的能量，而這一化學(xué)能化學(xué)反應(yīng)必須快速放出足夠的

10、能量，而這一化學(xué)能又能被反應(yīng)分子吸收，形成一種激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物；又能被反應(yīng)分子吸收，形成一種激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物；處于激發(fā)態(tài)的分子或原子必須能釋放出光子，或者處于激發(fā)態(tài)的分子或原子必須能釋放出光子，或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量到另一分子上而使此分子被激發(fā)，能夠轉(zhuǎn)移它的能量到另一分子上而使此分子被激發(fā)，當(dāng)這一分子再回到基態(tài)時(shí)釋放出光子。當(dāng)這一分子再回到基態(tài)時(shí)釋放出光子。2. 化學(xué)發(fā)光的類(lèi)型化學(xué)發(fā)光的類(lèi)型氣相化學(xué)發(fā)光氣相化學(xué)發(fā)光液相化學(xué)發(fā)光液相化學(xué)發(fā)光3. 化學(xué)發(fā)光分析儀器化學(xué)發(fā)光分析儀器進(jìn)樣方式進(jìn)樣方式分立取樣式分立取樣式流動(dòng)注射式流動(dòng)注射式分立取樣式分立取樣式反應(yīng)室反應(yīng)室光電倍增管光電倍增管高壓電源高壓電源放大器放大器顯示器顯示器優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可以記錄化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的全過(guò)程，可以記錄化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的全過(guò)程， 適用于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究適用于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究流動(dòng)注射式流動(dòng)注射式光電倍增管光電倍增管高壓電源高壓電源記錄儀記錄儀wabpsvF優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：易操作，重現(xiàn)性好，可控制進(jìn)樣量和易操作，重現(xiàn)性好，可控制進(jìn)樣量和 進(jìn)樣速度。進(jìn)樣速度。熒光法的基本原理（熒光、磷光的發(fā)生過(guò)程）、熒光法的基本原理（熒光、磷光的發(fā)生過(guò)程）、激發(fā)光譜和熒光光譜、分