阿司匹林抗氧化機(jī)制探討

1、阿司匹林抗氧化作用阿司匹林抗氧化作用機(jī)制的探討機(jī)制的探討 主要內(nèi)容l研究背景l(fā)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膌作用機(jī)制l實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)分組、 實(shí)驗(yàn)操作、檢測(cè)指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析l預(yù)期結(jié)果l可行性分析 研究背景研究背景 阿司匹林是臨床常用的抗炎抗血栓藥物, 其作用主要是通過抑制前列腺素的合成及環(huán)氧化酶的激活而實(shí)現(xiàn)的. 最新的研究顯示阿司匹林還具有對(duì)抗過氧化物的損傷保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性的功能, 其作用可能與誘導(dǎo)某種保護(hù)性基因表達(dá), 抑制活性氧的反應(yīng), 特別是阻止鐵介導(dǎo)的氧自由基形成有關(guān).而近期發(fā)現(xiàn)鐵蛋白可以快速結(jié)合細(xì)胞內(nèi)游離鐵,阻止其通過 Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基對(duì)細(xì)胞的氧化損傷.因此, 本研究欲證實(shí)阿司匹林的抗氧

2、化作用是通過影響內(nèi)皮細(xì)胞鐵代謝增加鐵蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的. 阿司匹林的抗氧化作用機(jī)制阿司匹林的抗氧化作用機(jī)制l鐵蛋白：鐵蛋白是一種貯存鐵元素的可溶性蛋白質(zhì)，鐵蛋白占體內(nèi)儲(chǔ)存鐵的三分之一，是檢測(cè)人體體內(nèi)是否缺鐵最靈敏的一項(xiàng)指標(biāo)。也是檢測(cè)肝臟是否存在疾患的重要指標(biāo)之一，也是常見的乙肝（乙型病毒性肝炎）檢查項(xiàng)目之一l鐵蛋白是鐵的貯存蛋白，體內(nèi)游離 的二價(jià)鐵可通 過 Fenton 反應(yīng)催化產(chǎn)生 OH造成細(xì)胞 的氧化損傷。 由于鐵在生物體內(nèi)的含量較其他金屬元素的總和還多得多，因此。它被看作是這類反應(yīng)的主要催化因子。而鐵蛋白與鐵有很高 的結(jié)合力 ，l mol 的鐵蛋 白可結(jié)合 4500 mol的鐵，貯存在鐵蛋

3、白中的鐵是三價(jià)形式 ，已喪失催化活性 。因此 ，鐵蛋白被看作是鐵的生理性螫合劑 ，具有封閉隔離游離鐵與活性氧分子的反應(yīng) ，是過氧化反應(yīng)的抑制劑-。而發(fā)現(xiàn)阿司匹林具有誘導(dǎo)鐵蛋白表達(dá)的作用 ，對(duì)于解釋其在各種炎癥及心血管疾病中良好的預(yù)防和治療效果將 有重要得意義。 阿司匹林的抗氧化作用機(jī)制阿司匹林的抗氧化作用機(jī)制lFenton 反應(yīng) 過氧化氫與催化劑Fe2+構(gòu)成的氧化體系通常稱為Fenton試劑。在催化劑作用下，過氧化氫能產(chǎn)生兩種活潑的氫氧自由基，從而引發(fā)和傳播自由基鏈反應(yīng)，加快有機(jī)物和還原性物質(zhì)的氧化。Fenton試劑一般在pH 3.5下進(jìn)行，在該pH值時(shí)羥基自由基生成速率最大。 l氧自由基的作

4、用：氧自由基的過氧化殺傷，主要是破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，破壞線粒體，斷絕細(xì)胞的能源，毀壞溶酶體，使細(xì)胞自溶。同時(shí)它對(duì)人體的非細(xì)胞結(jié)構(gòu)也有危害作用，可以使血管壁上的粘合劑遭受破壞，使完整密封的血管變得千瘡百孔，發(fā)生漏血、滲液，進(jìn)而導(dǎo)致水腫和紫癜等等。說明阿司匹林是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵代謝增加可說明阿司匹林是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵代謝增加可用于清除鐵的蛋白用于清除鐵的蛋白apo-ferritin(膜脫鐵鐵蛋膜脫鐵鐵蛋白白)的合成這類鐵蛋白由于處于未飽和狀態(tài)的合成這類鐵蛋白由于處于未飽和狀態(tài)與與Fe3+有極高的親和性抑制了有極高的親和性抑制了Fenton反應(yīng)反應(yīng)能有效地阻斷氧自由基的產(chǎn)生而達(dá)到抗能有效地阻斷氧自由

5、基的產(chǎn)生而達(dá)到抗H2O2損傷的作用損傷的作用 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膌探究阿司匹林抗氧化作用的機(jī)制；l學(xué)習(xí)內(nèi)皮細(xì)胞的原代與傳代培養(yǎng)的方法；l觀察不同濃度的阿司匹林在抗H2O2 損傷內(nèi)皮細(xì)胞過程中誘導(dǎo)鐵蛋白(Fn) 表達(dá)的情況；l培養(yǎng)我們的科研探討的思維、團(tuán)結(jié)協(xié)作和互相交流的能力。實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料lI 型膠原酶、TritOn X-100、Ferritin、Apo-ferritin、阿司匹林、消炎痛、水楊酸鈉均為Sigma 公司產(chǎn)品；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、型膠原包被的6 孔培養(yǎng)板為Roche 公司產(chǎn)品；細(xì)胞因子及內(nèi)毒素( LPS) 為北京邦定公司產(chǎn)品; M199 培養(yǎng)液( GIBC0 BRL 公司) ；小牛

6、血清、胰蛋白酶、30%H2O2、兔抗人因子血清等為國(guó)產(chǎn)制品。 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定, 使用膠原包被的6孔培養(yǎng)板并加入內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子( 10ng/ml) 進(jìn)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿2/ 3 板底并融合成單層時(shí)進(jìn)行傳代, 接種于22mm11mm 蓋玻片上。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞呈鋪路石樣鑲嵌單層排列, 鑒定使用辣根過氧化物酶法( PAP 法) 檢測(cè)因子相關(guān)抗原。 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分組使用傳23 代的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作l在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中加入0.1mmol/L、 0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/

7、L、3.0mmol/L的阿司匹林, 孵育24 小時(shí)后收獲細(xì)胞測(cè)鐵蛋白含量；l僅用1mmol/L 的阿司匹林處理細(xì)胞,分別在4、8、16 和24小時(shí)收獲細(xì)胞測(cè)定鐵蛋白含量；l用0.1mmol/L的去鐵胺及50umol/L的FeCl3預(yù)先孵育細(xì)胞6小時(shí)后加入1mmol/L 的阿司匹林,24小時(shí)后收獲細(xì)胞測(cè)鐵蛋白含量。 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作l以上各對(duì)照組加入等體積的M199液培養(yǎng)相同時(shí)間后收獲細(xì)胞測(cè)鐵蛋白。l最后將濃度分別為0.1mmol/L、1.0mmol/L、3.0mmol/L的阿司匹林及1.0mg/ml的Ferritin( 已 飽和鐵) 、1.0mg/ml 的apo-ferritin( 去鐵蛋白)

8、 加入細(xì)胞中預(yù)先孵育8小時(shí)后, 再加入濃度為0.5mmol/ L 的H2O2 , 對(duì)照組僅加入0.5mmol/L的H2O2, 孵育24小時(shí)。l實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化, 計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù), 測(cè)上清夜中MDA 含量及細(xì)胞 LDH釋放率。 檢測(cè)指標(biāo)檢測(cè)指標(biāo)l細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白濃度(OD)l細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH) 釋放率l培養(yǎng)液中丙二醛( MDA) l細(xì)胞存活率l細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白濃度細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白濃度 使用鐵蛋白ELISA試劑盒, 取胞漿蛋白質(zhì)懸液50ul, 按說明書進(jìn)行操作, 并在450nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀上讀取OD值。以各標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為縱軸, 鐵蛋白濃度為橫軸, 繪制鐵蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。 l培養(yǎng)

9、液中細(xì)胞乳酸脫氫酶培養(yǎng)液中細(xì)胞乳酸脫氫酶 (LDH) 釋放率釋放率 LDH 采用常規(guī)生化法, 分別將測(cè)得的培養(yǎng)液中LDH及細(xì)胞裂解懸液中LDH值通過下列公式計(jì)算LDH釋放率, 以校正因?yàn)楦鹘M細(xì)胞數(shù)的差異而對(duì)培養(yǎng)液中LDH值的影響。公式如下: 培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中MDAl采用常規(guī)生化法, 按試劑盒( 晶美公司) 說明書操作l細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率 0.5%臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞, 死細(xì) 胞被染成淡藍(lán)色, 而活細(xì)胞拒染, 分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)目, 根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率: 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 l測(cè)定結(jié)果以 表示, 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析, 兩兩比較用q檢驗(yàn).sx 預(yù)期結(jié)果預(yù)期結(jié)果l不同劑量的阿司

10、匹林誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鐵蛋白的表達(dá)： 鐵蛋白表達(dá)的量與阿司匹林濃度之間顯示出劑量依賴的關(guān)系。l不同處理時(shí)間阿司匹林誘導(dǎo)鐵蛋白的表達(dá)： 鐵 蛋白的表達(dá)隨AS 處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高, 兩者間有時(shí)間依賴關(guān)系。l細(xì)胞內(nèi)鐵對(duì)阿司匹林誘導(dǎo)鐵蛋白表達(dá)的影響： 去鐵胺(DFO) 能消除AS 誘導(dǎo)鐵蛋白增加的作用, 鐵蛋白濃度下降，比單用AS( 1. 0mmol/L) 組鐵蛋白濃度低；加入FeCl3后鐵蛋白增加，具有明顯促進(jìn)AS誘導(dǎo)鐵蛋白增加的作用。 預(yù)期結(jié)果預(yù)期結(jié)果l阿司匹林誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞抗H2O2 氧化損傷的作用：正常細(xì)胞加入0. 5mmol/L 的H2O2孵育24小時(shí)后細(xì)胞絕大部分死亡, LDH釋放率及MDA 明顯增高；但加入0. 1mmol/L 的AS 能抵抗H2O2的損傷作用, 細(xì)胞存活率及LDH釋放率及MDA與損傷組比較有顯著性差異，且隨AS 劑量的增大, 抗H2O2損傷的作用增強(qiáng)。Ferritin ( 已飽和鐵) 組對(duì)細(xì)胞無保護(hù)作用, 而未含鐵的apo-ferriein則對(duì)細(xì)胞有明顯保護(hù)作用, 其結(jié)果類似 0. 1mmol/L 的阿司匹林。 可行性分析可行性分析l材料的可行性 本實(shí)驗(yàn)使用的藥品,培養(yǎng)基質(zhì)均為實(shí)驗(yàn)常用品,容易獲得l方法的可行性 1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:Jaffe內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法及辣根 過氧化物酶法( PAP法)鑒定