動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

1、1會(huì)計(jì)學(xué)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)2牛牛文庫(kù)文檔分享（一）貼附型細(xì)胞：（一）貼附型細(xì)胞：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞貼附貼附: :是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式在方式結(jié)果結(jié)果: : 基于貼附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組基于貼附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須貼附貼附于一于一固相表面固相表面才能才能生生存存和和生長(zhǎng)生長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)：培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后, ,同樣需要貼附

2、于同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而屬于貼附型細(xì)胞屬于貼附型細(xì)胞貼附貼附( (錨定或錨著錨定或錨著) )依賴型依賴型( (性性) )細(xì)胞細(xì)胞牛牛文庫(kù)文檔分享細(xì)胞在體內(nèi)、外的貼附方式存在差異細(xì)胞在體內(nèi)、外的貼附方式存在差異體內(nèi)：體內(nèi)：貼附是全方位貼附是全方位, ,外形具有復(fù)雜的立體特征外形具有復(fù)雜的立體特征體外：體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同貼附的固相表面：貼附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料玻璃、聚苯乙烯塑料按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分

3、為四大類型四大類型 牛牛文庫(kù)文檔分享1 1、成纖維細(xì)胞型：、成纖維細(xì)胞型：牛牛文庫(kù)文檔分享名稱：名稱：成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞來(lái)源：來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織真正的成纖維細(xì)胞：心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，真正的成纖維細(xì)胞：心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮血管內(nèi)皮形態(tài)：形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出三角形，胞質(zhì)向外伸出2323個(gè)長(zhǎng)短不等的突起，個(gè)長(zhǎng)短不等的突起，中有卵圓形核中有卵圓形核生長(zhǎng)特點(diǎn)：生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞-

4、-細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起牛牛文庫(kù)文檔分享2 2、上皮細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型牛牛文庫(kù)文檔分享名稱：名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同來(lái)源：來(lái)源：來(lái)源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞來(lái)源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞, , 如：皮膚及其衍生物如：皮膚及其衍生物, ,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡, , 上皮性腫瘤上皮性腫瘤形態(tài)：形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不規(guī)則多角形，中類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核有圓形核 生長(zhǎng)特點(diǎn)：生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相

5、連成片，相靠易相連成片，相靠緊密相連成薄層緊密相連成薄層鋪石鋪石狀生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)狀生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)牛牛文庫(kù)文檔分享3 3、游走細(xì)胞型：、游走細(xì)胞型：呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。其他細(xì)胞相區(qū)別。4 4、多形型細(xì)胞：、多形型細(xì)胞：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。 牛牛文

6、庫(kù)文檔分享（二）懸浮型細(xì)胞：（二）懸浮型細(xì)胞：見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類細(xì)胞容易大量繁殖。類細(xì)胞容易大量繁殖。來(lái)源：來(lái)源：血，脾或骨髓，血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞血，脾或骨髓，血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點(diǎn)：特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好，細(xì)胞圓形、單個(gè)或小細(xì)胞在懸浮中生長(zhǎng)良好，細(xì)胞圓形、單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便( (不需消不需消化化) )，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺

7、點(diǎn)：缺點(diǎn)：純化不方便，不能通過離心將死、活細(xì)胞分離純化不方便，不能通過離心將死、活細(xì)胞分離牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享12牛牛文庫(kù)文檔分享細(xì)胞貼壁過程牛牛文庫(kù)文檔分享14 2. 2.接觸抑制接觸抑制 細(xì)胞接觸細(xì)胞接觸停止移動(dòng)停止移動(dòng) 正常細(xì)胞成單層生長(zhǎng)正常細(xì)胞成單層生長(zhǎng) 腫瘤細(xì)胞無(wú)接觸抑制腫瘤細(xì)胞無(wú)接觸抑制，可，可以堆積生長(zhǎng)。以堆積生長(zhǎng)。 接觸抑制可作為區(qū)分正常細(xì)胞接觸抑制可作為區(qū)分正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的標(biāo)志之一與癌細(xì)胞的標(biāo)志之一牛牛文庫(kù)文檔分享15 3. 3.密度抑制密度抑制 細(xì)胞增殖，密度加大，培養(yǎng)液細(xì)胞增殖，密度加大，培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分消耗，細(xì)胞代謝物增營(yíng)養(yǎng)成分消耗，細(xì)胞代謝物增多，導(dǎo)致發(fā)生

8、密度抑制，細(xì)胞多，導(dǎo)致發(fā)生密度抑制，細(xì)胞分裂停止分裂停止牛牛文庫(kù)文檔分享培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程（一）單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程（二）細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程（三）每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過程牛牛文庫(kù)文檔分享（一）單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程牛牛文庫(kù)文檔分享（二）細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程培養(yǎng)細(xì)胞的生命期：培養(yǎng)細(xì)胞的生命期：是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。包括殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。包括原代培養(yǎng)期、傳代期及衰退原代培養(yǎng)期、傳代期及衰退期。期。牛牛文庫(kù)文檔分享細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線牛牛文庫(kù)文檔分享1 1原代培養(yǎng)期：原代培養(yǎng)期：從體內(nèi)取出組織從體內(nèi)取出組織, ,接種培養(yǎng)到第一次傳代階段（接種培養(yǎng)到第一次傳代階段（初代

9、培養(yǎng)）初代培養(yǎng)）特點(diǎn)特點(diǎn)：1-41-4周、細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)、可見細(xì)胞分周、細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)、可見細(xì)胞分裂、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上與體內(nèi)原組織相似裂、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上與體內(nèi)原組織相似性大、多呈性大、多呈二倍體核型二倍體核型細(xì)胞群是異質(zhì)的，細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)細(xì)胞群是異質(zhì)的，細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。胞獨(dú)立生存性差。牛牛文庫(kù)文檔分享2 2傳代期：傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系細(xì)胞系。在全。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，情況下，細(xì)胞增殖旺

10、盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系二倍體細(xì)胞系。為保持二。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10105050次左右，細(xì)胞次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。 牛牛文庫(kù)文檔分享3 3衰退期：衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期在細(xì)胞生命期階

11、段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)，由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)任何一點(diǎn)，由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性永生性或或惡性性惡性性。牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享（三）每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過程所謂細(xì)胞的所謂細(xì)胞的“一代一代”是指從細(xì)胞接種到分是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。這已成為培養(yǎng)工作中離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)胞倍增一代非同一與細(xì)胞倍增一代非同一含義含義。如某一細(xì)胞系為第。如某一細(xì)胞系為第153153代細(xì)胞，即指代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代該細(xì)胞系已傳代

12、153153次。它與細(xì)胞世代或倍次。它與細(xì)胞世代或倍增不同；在增不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3 36 6次次。牛牛文庫(kù)文檔分享25牛牛文庫(kù)文檔分享1 1潛伏期潛伏期游離游離: :懸浮懸浮, ,胞質(zhì)回縮胞質(zhì)回縮, , 全部細(xì)胞全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形變?yōu)閳A球形吸附吸附: :貼附底物貼附底物, ,一般一般2424小時(shí)內(nèi)貼小時(shí)內(nèi)貼壁壁潛伏潛伏: :可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng), ,基本無(wú)增基本無(wú)增殖殖, , 少見分裂相少見分裂相 牛牛文庫(kù)文檔分享2 2指數(shù)生長(zhǎng)期：指數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。細(xì)胞細(xì)胞活力最旺盛活力最旺盛的階段，

13、培養(yǎng)物中的階段，培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)呈指數(shù)增長(zhǎng), ,細(xì)胞群體均一，是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞群體均一，是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞細(xì)胞接觸抑制：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)停止接觸抑制：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)停止密度抑制：細(xì)胞終止分裂密度抑制：細(xì)胞終止分裂牛牛文庫(kù)文檔分享3 3停止期：停止期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞停止增殖，進(jìn)細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停止期，也稱入停止期，也稱平臺(tái)期平臺(tái)期。停滯期細(xì)胞雖不增。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pHpH降低。此時(shí)需降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生做

14、分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡牛牛文庫(kù)文檔分享潛伏期潛伏期指數(shù)生長(zhǎng)期指數(shù)生長(zhǎng)期停止期停止期牛牛文庫(kù)文檔分享培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳學(xué)特征（一）染色質(zhì)與染色體：（一）染色質(zhì)與染色體： 正常細(xì)胞：二倍體正常細(xì)胞：二倍體 細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化：多倍體或異倍體細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化：多倍體或異倍體（二）細(xì)胞性別（二）細(xì)胞性別 女性：女性：BarrBarr小體小體 男性：男性：Y Y小體小體牛牛文庫(kù)文檔分享體內(nèi)外細(xì)胞的差異及培養(yǎng)細(xì)胞的分化 經(jīng)多次傳代增殖后，培養(yǎng)細(xì)胞將失去原有經(jīng)多次傳代增殖后，培養(yǎng)細(xì)胞將失去原有的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化逐漸減弱或的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分

15、化逐漸減弱或不顯。形態(tài)與功能逐漸單一化，細(xì)胞衰老不顯。形態(tài)與功能逐漸單一化，細(xì)胞衰老或死亡，或發(fā)生轉(zhuǎn)化，獲得不死性或惡性或死亡，或發(fā)生轉(zhuǎn)化，獲得不死性或惡性性。性。牛牛文庫(kù)文檔分享32牛牛文庫(kù)文檔分享33牛牛文庫(kù)文檔分享34牛牛文庫(kù)文檔分享35牛牛文庫(kù)文檔分享36牛牛文庫(kù)文檔分享1. 1. 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基37牛牛文庫(kù)文檔分享38牛牛文庫(kù)文檔分享2. 2. 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基39牛牛文庫(kù)文檔分享40牛牛文庫(kù)文檔分享3.3.無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基41牛牛文庫(kù)文檔分享42牛牛文庫(kù)文檔分享43牛牛文庫(kù)文檔分享44牛牛文庫(kù)文檔分享45牛牛文庫(kù)文檔分享46牛牛文庫(kù)文檔分享影響動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的因素影

16、響動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的因素 （1 1）溫度）溫度 ：哺乳動(dòng)物最適溫度哺乳動(dòng)物最適溫度36.536.50.5 0.5 ；對(duì)低溫耐受性比高溫強(qiáng)。對(duì)低溫耐受性比高溫強(qiáng)。 （2 2）p pH H：甚至死亡。甚至死亡。偏酸性耐受較強(qiáng)，偏堿性很偏酸性耐受較強(qiáng)，偏堿性很快死亡?？焖劳觥?（3 3）氣體）氣體：O O2 2；COCO2 2，還可調(diào)節(jié)，還可調(diào)節(jié)p pH H。 （4 4）滲透壓）滲透壓：不同細(xì)胞要求不同。不同細(xì)胞要求不同。47牛牛文庫(kù)文檔分享48牛牛文庫(kù)文檔分享動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的特點(diǎn): :牛牛文庫(kù)文檔分享幼齡動(dòng)物取動(dòng)物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞牛牛文庫(kù)文檔分享

17、轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)牛牛文庫(kù)文檔分享52牛牛文庫(kù)文檔分享過程過程 組織組織取材取材 組織細(xì)胞的分離分離 培養(yǎng)培養(yǎng) 機(jī)械法機(jī)械法 消化法消化法 牛牛文庫(kù)文檔分享動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官物的組織、器官細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液胰蛋白酶胰蛋白酶1 1代細(xì)胞代細(xì)胞原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)5050代細(xì)胞代細(xì)胞傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)無(wú)限傳代無(wú)限傳代單個(gè)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液加培養(yǎng)液動(dòng)物組織細(xì)胞間隙動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和成具有一定彈性和韌性的組織和器官韌性的組織和器官。（分解彈性

18、纖維）（分解彈性纖維）牛牛文庫(kù)文檔分享55牛牛文庫(kù)文檔分享56牛牛文庫(kù)文檔分享機(jī)機(jī)械械法法分分離離胚胚胎胎 牛牛文庫(kù)文檔分享58牛牛文庫(kù)文檔分享59 （二）組織細(xì)胞的分離（二）組織細(xì)胞的分離 有有機(jī)械法機(jī)械法和和消化法消化法兩大類兩大類 1. 1.機(jī)械法：機(jī)械法： 離心分離法：離心分離法：適用于細(xì)胞懸液組織。適用于細(xì)胞懸液組織。500-1000rpm500-1000rpm離心離心5-10min5-10min。 切割分離法：切割分離法：用剪刀剪切成用剪刀剪切成1mm1mm3 3左右的小塊。左右的小塊。 機(jī)械分散法：機(jī)械分散法：擠壓和研磨，適用于纖維含量少的擠壓和研磨，適用于纖維含量少的組織。組織

19、。牛牛文庫(kù)文檔分享60 （二）組織細(xì)胞的分離（二）組織細(xì)胞的分離 2. 2.消化法：可使組織疏松，細(xì)胞分開，細(xì)胞容易消化法：可使組織疏松，細(xì)胞分開，細(xì)胞容易生長(zhǎng)，成活率高。生長(zhǎng)，成活率高。 胰蛋白酶消化法：胰蛋白酶消化法：適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，對(duì)傳代細(xì)胞也適用。使用濃度一般為軟組織，對(duì)傳代細(xì)胞也適用。使用濃度一般為0.1%-0.5%0.1%-0.5%，用不含鈣、鎂離子的，用不含鈣、鎂離子的BSSBSS配制，配制，PH8-9PH8-9。血清有抑制其活性作用。血清有抑制其活性作用。 胰蛋白酶消化法有熱胰蛋白酶消化法有熱(37)(37)和冷和冷(4 )(4 )兩種處理兩

20、種處理。牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享62 膠原酶消化法：膠原酶消化法：膠原酶是由細(xì)菌中提取出的膠原酶是由細(xì)菌中提取出的酶，適用于消化纖維組織、上皮組織或膠原成酶，適用于消化纖維組織、上皮組織或膠原成分的組織?？捎煤}、鎂離子的分的組織?？捎煤}、鎂離子的BSSBSS配制或溶配制或溶于含血清的培養(yǎng)液中。使用濃度一般為于含血清的培養(yǎng)液中。使用濃度一般為0.1-0.1-0.3mg/mL0.3mg/mL，3737溫育。溫育。 優(yōu)點(diǎn)：消化緩和、無(wú)需機(jī)械振蕩優(yōu)點(diǎn)：消化緩和、無(wú)需機(jī)械振蕩 缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴 可與胰蛋白酶混用可與胰蛋白酶混用牛牛文庫(kù)文檔分享63其他消化酶消化法其他消化酶消化法：

21、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、透：鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等。明質(zhì)酸酶等。螯合劑消化法：螯合劑消化法：常用螯合劑有檸檬酸鈉、常用螯合劑有檸檬酸鈉、EDTA-EDTA-NaNa2 2等?？捎貌缓}、鎂離子的等?？捎貌缓}、鎂離子的BSSBSS配制成配制成0.02%0.02%溶液溶液。EDTAEDTA適于消化傳代細(xì)胞，不受血清抑制，消化后適于消化傳代細(xì)胞，不受血清抑制，消化后需徹底清洗。需徹底清洗。牛牛文庫(kù)文檔分享64 （三）培養(yǎng)方法（三）培養(yǎng)方法 1. 1.組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法：簡(jiǎn)便，成功率較低：簡(jiǎn)便，成功率較低牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享66牛牛文庫(kù)文檔分享67牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)

22、文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享71牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶滾動(dòng)培養(yǎng)瓶滾動(dòng)培養(yǎng)瓶貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享76牛牛文庫(kù)文檔分享774. 4.克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法：又稱單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，：又稱單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，就是將就是將細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新繁殖成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。繁殖成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。 細(xì)胞株細(xì)胞株 : :由由細(xì)胞系細(xì)胞系進(jìn)一步克隆化，而獲得進(jìn)一步克隆化，而獲得的由的由單一細(xì)胞單一細(xì)胞形成的細(xì)胞群體。形成的細(xì)胞群體。

23、 初代細(xì)胞和有限細(xì)胞系的克隆培養(yǎng)比較困難，初代細(xì)胞和有限細(xì)胞系的克隆培養(yǎng)比較困難，無(wú)限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞等則比較無(wú)限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞等則比較容易容易牛牛文庫(kù)文檔分享78牛牛文庫(kù)文檔分享79牛牛文庫(kù)文檔分享80牛牛文庫(kù)文檔分享815. 5.細(xì)胞同步化培養(yǎng)細(xì)胞同步化培養(yǎng)：用自然的或人工的方法獲：用自然的或人工的方法獲得細(xì)胞周期同步化的細(xì)胞群體。得細(xì)胞周期同步化的細(xì)胞群體。篩選同步化細(xì)胞篩選同步化細(xì)胞 誘導(dǎo)同步化細(xì)胞誘導(dǎo)同步化細(xì)胞 M期細(xì)胞震蕩脫落法期細(xì)胞震蕩脫落法 離心洗脫法離心洗脫法 梯度沉降法梯度沉降法 血清饑餓法血清饑餓法 異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺乏法異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺乏法 DNAD

24、NA合成抑制劑阻斷法合成抑制劑阻斷法 秋水仙素阻斷法秋水仙素阻斷法 牛牛文庫(kù)文檔分享6. 6.動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)牛牛文庫(kù)文檔分享1. 1. 分批式操作分批式操作 2. 2. 流加式操作流加式操作 3. 3. 半連續(xù)式操作半連續(xù)式操作 4. 4. 連續(xù)式操作連續(xù)式操作 5. 5. 灌流式操作灌流式操作 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，污染和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，污染和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。缺點(diǎn)：費(fèi)用高，每一次收液后，都要進(jìn)行一系列新的接種放大缺點(diǎn)：費(fèi)用高，每一次收液后，都要進(jìn)行一系列新的接種放大的準(zhǔn)備工作，此期間生產(chǎn)停工。而且收液率低的準(zhǔn)備工作，此期間生產(chǎn)停

25、工。而且收液率低. .優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)效率高，可反復(fù)長(zhǎng)期培養(yǎng)，反復(fù)收獲產(chǎn)品。優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)效率高，可反復(fù)長(zhǎng)期培養(yǎng)，反復(fù)收獲產(chǎn)品。優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下生長(zhǎng)。生長(zhǎng)。缺點(diǎn)：開放式操作，容易造成污染。細(xì)胞容易發(fā)生變異，且對(duì)缺點(diǎn)：開放式操作，容易造成污染。細(xì)胞容易發(fā)生變異，且對(duì)設(shè)備等要求高。設(shè)備等要求高。優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下生長(zhǎng)。產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下生長(zhǎng)。產(chǎn)量高等. .6. 6.動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)牛牛文庫(kù)文檔分享84牛牛文庫(kù)文檔分享85牛牛文庫(kù)文檔分享86牛牛文

26、庫(kù)文檔分享細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名 HeLaHeLa：為供體患者的姓名（來(lái)源于宮頸癌）：為供體患者的姓名（來(lái)源于宮頸癌）CHOCHO：中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞（：中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Chinese Hamster OvaryOvary）宮宮-743-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，：宮頸癌上皮細(xì)胞，19741974年年3 3月建立月建立NIH3T3NIH3T3：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National National Institute of HealthInstitute of Health）建立；每）建立；每3 3天傳代，每次接天傳代，每次

27、接種種3 310105 5細(xì)胞細(xì)胞mLmL。牛牛文庫(kù)文檔分享細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用 ATCCATCC入庫(kù)細(xì)胞要求檢測(cè)項(xiàng)目如下：入庫(kù)細(xì)胞要求檢測(cè)項(xiàng)目如下：培養(yǎng)簡(jiǎn)歷：培養(yǎng)簡(jiǎn)歷：組織來(lái)源日期、物種、組織起源、性組織來(lái)源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳別、年齡、供體正常或異常健康狀態(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等代數(shù)等凍凍 存存 液：液：培養(yǎng)基和防凍液名稱培養(yǎng)基和防凍液名稱細(xì)胞活力：細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性融解前后細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性培培 養(yǎng)養(yǎng) 液：液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來(lái)源和含量生素）、血清來(lái)源和含量牛牛文庫(kù)文檔分享細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性，融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性核核 型：型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無(wú)無(wú)無(wú)污染檢測(cè)：無(wú)污染檢測(cè)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和