蛋白表達(dá)解決方案

1、主要內(nèi)容1，成功案例分享2，蛋白表達(dá)客戶工作流程及存在的問(wèn)題3，AJ 解決方案 德國(guó)耶拿公司德國(guó)耶拿公司W(wǎng)estern Blot 整體解決方案整體解決方案樣品制備樣品制備 蛋白定量蛋白定量 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 勻漿器 垂直電泳、電泳電源 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 膜封閉，一膜封閉，一/二抗體標(biāo)記二抗體標(biāo)記 顯影檢測(cè)顯影檢測(cè)濕法或半干轉(zhuǎn)印 、電源 小型搖床 成像系統(tǒng)3Western 流程流程l蛋白樣品的制備SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交成像檢測(cè)成像檢測(cè)45 蛋白表達(dá)客戶工作流程及存在的問(wèn)題隨著科研的深入，實(shí)驗(yàn)越來(lái)越難做高豐度的蛋白越來(lái)越少，低豐度蛋白越來(lái)也多多蛋白共同作用的研究越來(lái)越

2、多，比如蛋白磷酸化修飾研究向縱深方向開展，不僅要做體外檢測(cè)，還要做在體實(shí)時(shí)檢測(cè)6 蛋白表達(dá)客戶工作流程及存在的問(wèn)題蛋白表達(dá)的結(jié)果與基因表達(dá)不匹配不同的學(xué)生做出來(lái)的結(jié)果不一樣，結(jié)果隨機(jī)性大，不好重復(fù) 審稿人對(duì)蛋白表達(dá)結(jié)果有異議，不知道該如何提供證據(jù)7 蛋白表達(dá)客戶工作流程及存在的問(wèn)題耗時(shí)長(zhǎng)，工作效率低原因原因 儀器靈敏度不夠 沒(méi)有選擇正確的western 檢測(cè)方法 沒(méi)有按照正確的操作進(jìn)行試驗(yàn) 沒(méi)有使用最有效的轉(zhuǎn)印方法8UVP Chemstudio系列系列超敏化學(xué)發(fā)光成像超敏化學(xué)發(fā)光成像可用于極地豐度蛋白表達(dá)的檢測(cè)-60度科研冷CCD專用化學(xué)發(fā)光托盤4/3英寸超大芯片極高的物理像素高光通透性鏡頭B

3、ining功能寬泛的動(dòng)態(tài)范圍化學(xué)發(fā)光級(jí)暗箱810萬(wàn)物理像素?cái)?shù)據(jù)可追溯 VisionWorks LS 軟件 圖像信息可以追蹤溯源，任何修改都可以直接顯示，確保分析結(jié)果的可信度如何選擇合適的western blot檢測(cè)方法？斯隆-凱瑟琳癌癥中心主任Ushma S. Neill在擔(dān)任 “臨床調(diào)查研究雜志”評(píng)審期間曾連續(xù)拒絕了四篇本已接受并準(zhǔn)備發(fā)表的來(lái)稿后明確指出，所有提交的western數(shù)據(jù)的建立必須是平等的，其中包括：1.1.所采用的檢測(cè)方法定量范圍是否所采用的檢測(cè)方法定量范圍是否可靠？可靠？2.2.實(shí)驗(yàn)者如何確定化學(xué)發(fā)光的曝光時(shí)間？實(shí)驗(yàn)者如何確定化學(xué)發(fā)光的曝光時(shí)間？3.3.是否有內(nèi)參？?jī)?nèi)參是否可

4、靠？是否有內(nèi)參？?jī)?nèi)參是否可靠？4.4.分析結(jié)果是否使用的是原始數(shù)據(jù)分析結(jié)果是否使用的是原始數(shù)據(jù)5.5.原始數(shù)據(jù)是否被人修改原始數(shù)據(jù)是否被人修改Source: Source: “All Data are not created Equal” Editorial by Ushma S. Neill, The Journal of Clinical Investigation Volume 119:424, 200912電泳膠和印跡電泳膠和印跡“For quantitative comparisons, appropriate reagents, controls and imaging metho

5、ds with linear signal ranges should be used.”“對(duì)于定量比較實(shí)驗(yàn)，應(yīng)該使用適當(dāng)?shù)脑噭?、參比及線性范圍內(nèi)的成像方法?！? Nature 13Western Blot Workflow-Detection生成有色物質(zhì)生成有色物質(zhì)沉淀在膜上沉淀在膜上被檢測(cè)被檢測(cè)DAB顯色法檢測(cè)靈敏度低，不能有效的檢測(cè)低豐度蛋白，且定量范圍只有1.5OD更靈敏的檢測(cè)方法：化學(xué)發(fā)光法DAB顯色14化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的優(yōu)勢(shì) 定量范圍更廣 高靈敏度（化學(xué)發(fā)光一般光強(qiáng)很弱）檢測(cè)方法： 底片檢測(cè)（傳統(tǒng)的壓片，顯影，定影） CCD攝像頭檢測(cè)15Chemiluminescen

6、ce-Western Blot傳統(tǒng)X光壓片檢測(cè)16Chemiluminescence-Western Blot無(wú)需外在激發(fā)光源，依靠自身發(fā)光，一般要求高靈敏度的冷CCD17為什么為什么 CCD技術(shù)優(yōu)于底片成像？技術(shù)優(yōu)于底片成像？CCD與光學(xué)強(qiáng)度具有真正的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系底片的反應(yīng)是非線性的pg. SA-HRP CCD Counts Densitometric Counts (OD)CCD底片底片18 成像方式15s 曝光3D顯示CCD 成像Film定量線性范圍比較定量線性范圍比較19CCD具有更寬的動(dòng)力學(xué)線性范圍(4.0 個(gè)數(shù)量級(jí)） 底片的動(dòng)力學(xué)線性范圍低（1.5 1.9 個(gè)數(shù)量級(jí)) CCD可進(jìn)行

7、更精確的濃度比較 CCD無(wú)需多次曝光CCD系統(tǒng) 可提示過(guò)飽和反應(yīng) 過(guò)飽和像素警示 底片無(wú)法警示過(guò)飽和區(qū)域-數(shù)據(jù)失真CCD 系統(tǒng)無(wú)需任何消耗品 無(wú)需底片及沖洗試劑 無(wú)需沖洗設(shè)備及暗室降低了輸出成本 (熱敏打印 vs. 底片)為什么為什么 CCD技術(shù)優(yōu)于底片成像？技術(shù)優(yōu)于底片成像？20化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光 vs. X光片曝光光片曝光 X光片曝光化學(xué)發(fā)光所需材料膠片、暗室、顯影液、定影液 只需一臺(tái)成像儀線性范圍窄，只有約1.8 O.D. 寬，超過(guò)4 O.D.靈敏度最靈敏的檢測(cè)方法低至fg級(jí)最靈敏的檢測(cè)方法低至fg級(jí)21CCD成像與膠片法對(duì)比成像與膠片法對(duì)比Film與傳統(tǒng)的壓片法對(duì)比ChemStudio系

8、列成像系統(tǒng)在相同曝光時(shí)間內(nèi)能得到更寬的定量范圍和更高的靈敏度CCDFilmIntensityIntensityConcentrationConcentration22化學(xué)發(fā)光成像的局限化學(xué)發(fā)光成像的局限 分子量大小非常接近的蛋白（磷酸化蛋白） 特點(diǎn)：特點(diǎn)：分子量非常接近，無(wú)法進(jìn)行剪膜檢測(cè) 傳統(tǒng)操作方法：傳統(tǒng)操作方法： 先檢測(cè)第一個(gè)蛋白 將第一個(gè)目標(biāo)蛋白的抗體剝離掉（巰基乙醇處理5-6個(gè)小時(shí)，且會(huì)將第二個(gè)目標(biāo)蛋白洗掉一部分，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性） 檢測(cè)第二個(gè)蛋白 方法缺陷：方法缺陷：檢測(cè)步驟繁瑣、巰基乙醇?xì)馕峨y以忍受、檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確 表達(dá)變化差異1042324熒光素化學(xué)發(fā)光，二抗由酶標(biāo)記熒光，二

9、抗由熒光素標(biāo)記熒光標(biāo)記抗體的使用多色熒光多色熒光多重檢測(cè)多重檢測(cè)COX IVAlpha-TubulinRabbit anti-COX IVMouse anti-tubulinGoat anti-rabbitGoat anti-mouseCOX IVAlpha-Tubulin25凝膠制備凝膠制備電泳電泳電泳電泳抗體雜交抗體雜交成像檢測(cè)成像檢測(cè)目的蛋白抗體剝離目的蛋白抗體剝離需要將第一個(gè)目的蛋需要將第一個(gè)目的蛋白的抗體剝離掉，然白的抗體剝離掉，然后再進(jìn)行第二個(gè)目的后再進(jìn)行第二個(gè)目的蛋白的抗體雜交檢測(cè)蛋白的抗體雜交檢測(cè)5h分子量接近的多蛋白檢測(cè)對(duì)比多色熒光法化學(xué)發(fā)光法26磷酸化蛋白檢測(cè)磷酸化蛋白檢測(cè)

10、27化學(xué)發(fā)光法無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分和定量目的蛋白多色熒光法檢測(cè)兩個(gè)目的蛋白分開檢測(cè)，再后續(xù)合并成一張圖片不同蛋白之間無(wú)干擾準(zhǔn)確區(qū)分和定量目的蛋白近紅外成像更適合近紅外成像更適合western blot成像成像近紅外成像RGB可見(jiàn)熒光成像NC膜、PVDF膜在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光背景NIR波長(zhǎng)下膜的背景極低，更適合做western blot檢測(cè)2829 近紅外熒光相對(duì)于RGB熒光背景低，結(jié)果靈敏度更高，準(zhǔn)確性更高，圖片更漂亮，因此被廣泛應(yīng)用于western blot 多色熒光成像Western 檢測(cè)的方法檢測(cè)的方法 化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光 壓片法 靈敏度高，定量范圍窄 CCD成像 靈敏度高，定量范圍寬 多色熒光

11、多色熒光 定量準(zhǔn)確、多重檢測(cè) RGB熒光 背景高 NIR熒光 背景低、定量準(zhǔn)確 DAB顯色顯色 定量范圍窄，靈敏度低30 化學(xué)發(fā)光（靈敏度） + 最優(yōu)搭配 近紅外多色熒光（寬線性范圍，多重檢測(cè)，持久信號(hào)）最優(yōu)化方案最優(yōu)化方案-兩種方法結(jié)合使用兩種方法結(jié)合使用31UVP Chemstudio全能成像超敏化學(xué)發(fā)光多色熒光近紅外多色熒光在體實(shí)時(shí)檢測(cè)的解決辦法在體實(shí)時(shí)檢測(cè)的解決辦法活體成像活體成像33動(dòng)物成像植物成像34在體實(shí)時(shí)檢測(cè)在體實(shí)時(shí)檢測(cè)氙燈光源：氙燈光源：可以為成像系統(tǒng)提供從紫外到近紅外的全光譜激發(fā)光，即可作為頂置光源，亦可作為透射光源，無(wú)限擴(kuò)展了儀器的熒光成像應(yīng)用。氙燈光源提供更強(qiáng)的激發(fā)光，

12、提高檢測(cè)靈敏度。應(yīng)用舉例：應(yīng)用舉例：RGB/NIR多色熒光成像、2D DIGE、小動(dòng)物活體成像和植物成像。熒光光源介紹熒光光源介紹LED光源光源：波長(zhǎng)固定不可改變，光強(qiáng)弱，無(wú)法進(jìn)行小動(dòng)物成像，無(wú)法提供透射光源激光光源激光光源：波長(zhǎng)固定不可改變，光強(qiáng)太強(qiáng)，易造成熒光淬滅，背景高，無(wú)法同時(shí)提供頂置和透射光源35熒光光源介紹熒光光源介紹氙燈氙燈/鹵素?zé)酐u素?zé)鬖ED激光激光光譜范圍全光譜固定波長(zhǎng)固定波長(zhǎng)光強(qiáng)強(qiáng)弱最強(qiáng)Western成像滿足滿足滿足小動(dòng)物成像最優(yōu)不支持背景太高應(yīng)用拓展靈活拓展不可拓展不可拓展透射熒光支持不支持不支持36濾光片的選擇濾光片的選擇37AJ如何幫助客戶如何提高實(shí)驗(yàn)效率？快速半干轉(zhuǎn)印快速半干轉(zhuǎn)印快速：15min-50min，濕轉(zhuǎn)一般1.5h-過(guò)夜節(jié)省緩沖液、冷卻