樣本采集與實驗室分析-2014

1、微生物食物中毒標本采集 實驗室檢測及結(jié)果分析概述n一、標本采集n二、檢測項目確定n三、實驗室檢驗n四、結(jié)果解讀報告與分析n五、案例分析準確的檢測結(jié)果包括正確采集樣品正確選擇檢測方法多種檢測方法運用綜合分析判斷細菌性食品中毒的主要特征及主要檢驗標本細菌性食品中毒的主要特征及主要檢驗標本食物中毒細菌食物中毒細菌 常見食品常見食品潛伏期潛伏期病程病程主要癥狀主要癥狀主要檢驗標本主要檢驗標本沙門菌肉類、蛋品最短68小時，長者23天，平均1224小時37天惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)熱（3840）、出冷汗、頭痛、全身痛糞便 、食品、血液副溶血性弧菌水產(chǎn)品、醃制品324小時，平均10小時13天嘔吐、發(fā)熱、腹

2、痛（上腹部）、腹瀉水樣便糞便 、食品金黃色葡萄球菌肉類、乳品、淀粉制品30分鐘6小時，平均2.53小時12天惡心、嘔吐（頻繁而劇烈）、腹痛、腹瀉食品、嘔吐物蠟樣芽胞桿菌米飯、肉、乳、淀粉制品最短30分鐘1小時，長者8小時約1 天（腹瀉型1636h，嘔吐型為810h）惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉食品、嘔吐物致瀉性大腸桿菌涼拌菜、肉食品220小時，通常410小時13天嘔吐、腹痛、腹瀉水樣便或粘液便，發(fā)熱不超過39糞便 、食品椰毒假單胞菌玉米面、銀耳148小時，多數(shù)56小時27天頭痛、驚恐、抽搐、牙關緊閉、嗜睡、昏迷食品、嘔吐物產(chǎn)氣莢膜梭菌肉食品822小時，平均1012小時12天腹痛、腹瀉、少數(shù)有嘔吐糞便

3、、食品肉毒梭菌堆放牛羊肉、罐頭、香腸、魚、豆制品2小時14天，平均12天220天咽食困難、復視、失音、呼吸困難食品、嘔吐物變形桿菌動物性食品，特別是熟肉和內(nèi)臟制品冷盤518小時多在13天恢復，極少數(shù)可達 12周除腹痛、腹瀉等癥狀外，還有顔面潮紅、頭痛、蕁麻疹等過敏癥狀食品、糞便 、嘔吐物流行病學流行病學實驗室實驗室n樣本采集方案與檢測人員溝通，便于實驗室分析處理。樣本采集方案與檢測人員溝通，便于實驗室分析處理。樣本前期處理，做好實驗前準備。樣本前期處理，做好實驗前準備。n共同商定分析方案：現(xiàn)場工作人員或臨床醫(yī)務工作者共同商定分析方案：現(xiàn)場工作人員或臨床醫(yī)務工作者要和實驗室分析人員多溝通，對現(xiàn)場

4、情況、所收集樣本要和實驗室分析人員多溝通，對現(xiàn)場情況、所收集樣本的情況、現(xiàn)場工作的方向等進行討論，確定應該檢驗的的情況、現(xiàn)場工作的方向等進行討論，確定應該檢驗的毒物種類以及是否需要定量，據(jù)此制定實驗室檢測工作毒物種類以及是否需要定量，據(jù)此制定實驗室檢測工作方案。方案。一、標本采集 （1）及時性原則 （2）針對性原則 （3）適量性原則 （4）不污染原則規(guī)范采樣是獲得可靠檢測結(jié)果的重要保證n合理的采樣時機和種類n足夠的樣品采樣量n多種樣品同時采集n正確的采樣方法n樣品妥善保存運輸合理的采樣時機和種類合理的采樣時機和種類傷寒病人樣本采集：血液：宜在病程1-2周發(fā)燒期內(nèi)骨髓：整個病程糞便：宜在病程3-

5、4周內(nèi)，抗生素治療前或者停藥3天后采集，帶菌者以糞便采集為主。根據(jù)臨床癥狀確定樣品采集根據(jù)臨床癥狀確定樣品采集根據(jù)流行病學、衛(wèi)生學調(diào)查采集根據(jù)流行病學、衛(wèi)生學調(diào)查采集細菌性食品中毒的主要特征及主要檢驗標本細菌性食品中毒的主要特征及主要檢驗標本食物中毒細菌食物中毒細菌 常見食品常見食品潛伏期潛伏期病程病程主要癥狀主要癥狀主要檢驗標本主要檢驗標本沙門菌肉類、蛋品最短68小時，長者23天，平均1224小時37天惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)熱（3840）、出冷汗、頭痛、全身痛糞便 、食品、血液副溶血性弧菌水產(chǎn)品、醃制品324小時，平均10小時13天嘔吐、發(fā)熱、腹痛（上腹部）、腹瀉水樣便糞便 、食品金黃色

6、葡萄球菌肉類、乳品、淀粉制品30分鐘6小時，平均2.53小時12天惡心、嘔吐（頻繁而劇烈）、腹痛、腹瀉食品、嘔吐物蠟樣芽胞桿菌米飯、肉、乳、淀粉制品最短30分鐘1小時，長者8小時約1 天（腹瀉型1636h，嘔吐型為810h）惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉食品、嘔吐物致瀉性大腸桿菌涼拌菜、肉食品220小時，通常410小時13天嘔吐、腹痛、腹瀉水樣便或粘液便，發(fā)熱不超過39糞便 、食品椰毒假單胞菌玉米面、銀耳148小時，多數(shù)56小時27天頭痛、驚恐、抽搐、牙關緊閉、嗜睡、昏迷食品、嘔吐物產(chǎn)氣莢膜梭菌肉食品822小時，平均1012小時12天腹痛、腹瀉、少數(shù)有嘔吐糞便、食品肉毒梭菌堆放牛羊肉、罐頭、香腸、魚、

7、豆制品2小時14天，平均12天220天咽食困難、復視、失音、呼吸困難食品、嘔吐物變形桿菌動物性食品，特別是熟肉和內(nèi)臟制品冷盤518小時多在13天恢復，極少數(shù)可達 12周除腹痛、腹瀉等癥狀外，還有顔面潮紅、頭痛、蕁麻疹等過敏癥狀食品、糞便 、嘔吐物 杯狀病毒杯狀病毒（諾如病毒、扎如病毒）（諾如病毒、扎如病毒）排病毒數(shù)量與病程有排病毒數(shù)量與病程有關關，發(fā)病發(fā)病4天內(nèi)幾乎天內(nèi)幾乎100%病人排病毒，易于檢查；病人排病毒，易于檢查； 病程病程59天時天時50%排病毒；病程排病毒；病程10天后約天后約10%排病毒。排病毒。采樣時機對檢驗結(jié)果的影響采樣時機對檢驗結(jié)果的影響病程病程病人糞便排毒病人糞便排毒率

8、率假設糞便標本假設糞便標本檢驗陽性率檢驗陽性率與暴發(fā)事件與暴發(fā)事件病因的關系病因的關系發(fā)病發(fā)病4天內(nèi)天內(nèi)100%10%?發(fā)病發(fā)病5950%10%?發(fā)病發(fā)病10天天10%10%?注意：樣品標簽和登記信息，幫助實驗室選擇最佳樣品檢注意：樣品標簽和登記信息，幫助實驗室選擇最佳樣品檢測，幫助實驗室結(jié)果的解釋測，幫助實驗室結(jié)果的解釋正確采樣方法正確采樣方法n無菌操作n防止采集的標本受到影響多種樣品同時采集多種樣品同時采集（一） 食品（二）水源（三） 臨床標本 糞便、血液、嘔吐物、手表面、尸體標本（四）物體表面： 剛被稀便污染的尿布、衣服、 床單等，炊事用具，其它可能被污染的物體表面（五） 宿主動物（六）

9、 昆蟲等媒介生物（一）食品標本的采集方法n用滅菌工具采取可疑食物，以及原配料、半成品等，置于滅菌容器中。n如已無可疑食物，可用滅菌棉拭在可疑食物的容器內(nèi)涂抹，置于裝有少量生理鹽水的試管內(nèi)。n可疑的食物盒子可直接送檢，如僅?？蘸校蓪⒖蘸兴蜋z。（二）水源標本的采集方法及注意事項n以滅菌的500ml鹽水瓶采取水樣至少450ml，但不能讓水樣充滿整個瓶子，應留有一定的空氣。一般在可疑污染的河流、池塘岸邊的30cm深度以內(nèi)的表層水采取水樣。連續(xù)采取多份水樣時，注意防止水樣間相互污染。采取的水樣應立即放入冷藏箱中盡快送到實驗室。不能在3小時內(nèi)送檢者，應在采水點即將水樣加入培養(yǎng)基中，搖勻，室溫下運送至實驗

10、室。（三） 臨床標本的采集方法1. 糞便標本n一般采用自然留便，若采樣時病人無便或嬰幼兒則可采用肛拭法。n留便：用2個棉拭子分別在自然排出的新鮮糞便中可疑部分多點挑取采集約5g標本。腹瀉病人應取膿、血、粘液等異常部分。液體糞便取絮狀物約5ml。n肛拭法：先用無菌甘油水或生理鹽水濕潤棉簽，多余的液體緊靠管壁擠出；再用棉拭或肛門采便管由肛門插入直腸內(nèi)約3cm5cm（幼兒約2cm3cm）處，輕輕旋轉(zhuǎn)360，擦取直腸表面黏液后取出。避免采便量過少（注意棉簽上應沾有糞便）。n為作厭氧菌檢查應將標本置于厭氧袋中轉(zhuǎn)送。（三） 臨床標本的采集方法2. 血液標本n（1）綁上止血帶，并用手觸摸，以確定固定住的靜脈

11、位 置。n（2）用2%碘酒消毒皮膚，從穿刺點中心部位開始向外擴大，消毒范圍不應小于5cm（直徑）。n（3）待皮膚干后，再75%酒精擦去碘酒，且不能用手指觸 摸消毒后的皮膚。n（4）皮膚酒精干后，穿刺采集血液，采血量成人5-10ml，嬰幼兒1-5ml。n（5）根據(jù)需要，血標本分為抗凝和不抗凝兩種，于采集后無菌操作分別注入市售抗凝和不抗凝采集管中。需做抗體檢測時，第二份血與第一份血采集時間一般相隔約2周，最短不能少于10天。（三） 臨床標本的采集方法3. 嘔吐物n用無菌壓舌板或棉拭子挑取少量嘔吐物作為檢材，放入自封塑料袋中并封好袋口或置于滅菌帶蓋瓶中，然后蓋緊瓶蓋，立即置于冷藏箱中。（三） 臨床標

12、本的采集方法4. 手表面n用滅菌棉拭蘸以滅菌生理鹽水，涂抹手表面，立即置于采樣管中，蓋緊管蓋。（三） 臨床標本的采集方法5. 尸體標本n應于死后盡可能早地無菌采取，放于無菌容器內(nèi)，不要使用防腐劑；對于各種器官標本，解剖器材和盛裝容器要分開。（四）物體表面標本的采集方法n用滅菌棉拭蘸以滅菌生理水涂擦沾染糞便的衣物、床單等表面或食品表面或水生動物體表，放入到采樣管中或直接置于增菌液中增菌。（五） 宿主動物標本的采集方法n以無菌操作采集可疑宿主動物新鮮糞便約5克，置于采樣袋中，立即置于冷藏箱中。（六） 昆蟲等媒介生物的采集方法n如采集蒼蠅標本：在每個采樣點以1015只蒼蠅作為一份標本放入自封袋中，立

13、即封好袋口，置于冷藏箱中。 標本采集送檢注意事項n送檢標本時應填寫“標本送檢單”，寫明姓名、地址、發(fā)病時間、采集時間、臨床診斷等。標本管/袋或瓶上標記樣品編號樣品編號。病人標本含有大量病菌，標本裝入試管或小瓶時，注意勿污染容器口外壁，必須妥善包裝以防破碎、滲漏等，放在堅固的送檢箱內(nèi)由專人送往檢驗室，運送過程中注意安全。 標本的保存n所有標本采集后都應立即置于冷藏箱中，盡快送往實驗室。不能在3小時內(nèi)送達者，細菌標本應盡可能在現(xiàn)場接種；病毒標本可臨時保存在4冰箱，但不能超過3天，如近期不能檢測，則應直接在-20 或-80 下凍存，有條件的可將樣品分成幾小份，以避免以后接種標本時的反復凍融。標本的運

14、輸n標本采集后必須盡快送至實驗室。n用于RNA檢測的標本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。n標本在運送時，應采用不易破碎的容器裝載標本。n運送要注意生物安全生物安全1.標本采集時要嚴格執(zhí)行生物安全防護要求，防止污染、傳播和自身感染 。2.標本采集完畢，首先消毒，然后脫掉防護裝備。3.所有使用過的采樣相關物品要帶離現(xiàn)場，高壓滅菌消毒后丟棄。4.采樣箱每次用完后要及時消毒處理。二、檢測項目的確定標本檢測項目的確定標本檢測項目的確定n檢測那些項目？n誰決定檢測項目？ 在暴發(fā)調(diào)查中，實驗室的病因物質(zhì)在暴發(fā)調(diào)查中，實驗室的病因物質(zhì)檢測，不是搜索尋找病因，是對病因假檢測，不是搜索尋找病因

15、，是對病因假設的證實。根據(jù)病因假設、檢驗條件，設的證實。根據(jù)病因假設、檢驗條件，確定檢驗指標。確定檢驗指標。流行病學流行病學實驗室實驗室n樣本采集方案與檢測人員溝通，便于實驗室分析處理。樣本采集方案與檢測人員溝通，便于實驗室分析處理。n共同商定分析方案：現(xiàn)場工作人員或臨床醫(yī)務工作者共同商定分析方案：現(xiàn)場工作人員或臨床醫(yī)務工作者要和實驗室分析人員多溝通，對現(xiàn)場情況、所收集樣本要和實驗室分析人員多溝通，對現(xiàn)場情況、所收集樣本的情況、現(xiàn)場工作的方向等進行討論，確定應該檢驗的的情況、現(xiàn)場工作的方向等進行討論，確定應該檢驗的毒物種類以及是否需要定量，據(jù)此制定實驗室檢測工作毒物種類以及是否需要定量，據(jù)此制

16、定實驗室檢測工作方案。方案。三、實驗室檢驗檢什么毒素檢測毒素檢測 病原分離病原分離 細菌細菌 病毒病毒 寄生蟲寄生蟲血清學檢查血清學檢查 抗原抗原 抗體抗體 急性期急性期IgMIgM抗體抗體 急性期和恢復期雙份靜脈血測定特異性急性期和恢復期雙份靜脈血測定特異性IgGIgG抗體?？贵w。核酸檢測核酸檢測 特征基因、毒力基因、溯源比較特征基因、毒力基因、溯源比較定性定性/ /定量定量怎么檢n用什么方法用什么方法（同時需要考慮方法靈敏度、準確度、同時需要考慮方法靈敏度、準確度、重現(xiàn)性、不同方法結(jié)果的可比較性、還需要考慮待測重現(xiàn)性、不同方法結(jié)果的可比較性、還需要考慮待測樣品（毒物、代謝物）、分析要求（定

17、性、定量）、樣品（毒物、代謝物）、分析要求（定性、定量）、樣品類型、實驗室條件，分析目的等因素，還要考慮樣品類型、實驗室條件，分析目的等因素，還要考慮時效性、準確性、經(jīng)濟性等要求）時效性、準確性、經(jīng)濟性等要求）n用什么試劑用什么試劑 對重大事件的毒物鑒定或樣本檢測要同時送數(shù)家具有鑒定檢驗對重大事件的毒物鑒定或樣本檢測要同時送數(shù)家具有鑒定檢驗資質(zhì)的實驗室同步開展工作，避免因?qū)嶒炇夜芾砗图夹g因素對結(jié)果的資質(zhì)的實驗室同步開展工作，避免因?qū)嶒炇夜芾砗图夹g因素對結(jié)果的影響。影響。 采樣時，分裝采樣時，分裝N份，分別保存和送檢份，分別保存和送檢怎么檢快速靈敏方法的應用快速靈敏方法的應用儀器自動化方法儀器自

18、動化方法改進分離培養(yǎng)方法改進分離培養(yǎng)方法怎么檢怎么檢檢驗流程：檢驗流程：1 . 樣品采集樣品采集 2. 初步檢驗初步檢驗（直接鏡檢、免疫快診、（直接鏡檢、免疫快診、PCR。) 3. 分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) (包括增菌培養(yǎng)和直接平板培養(yǎng)包括增菌培養(yǎng)和直接平板培養(yǎng)) 4. 初篩試驗、純培養(yǎng)初篩試驗、純培養(yǎng)（快速診斷方法的使用）（快速診斷方法的使用） 5. 全面鑒定全面鑒定（菌株鑒定、毒素測定）（快速檢測方法）（菌株鑒定、毒素測定）（快速檢測方法）四、結(jié)果的報告與分析結(jié)果的報告與分析n檢驗結(jié)果的正確性不僅取決于實驗室的條件檢驗結(jié)果的正確性不僅取決于實驗室的條件和技術水平，同時還與檢驗樣品的采集、保和技術水

19、平，同時還與檢驗樣品的采集、保存、送樣方法等方面有關。因此在分析檢驗存、送樣方法等方面有關。因此在分析檢驗結(jié)果時，除了應考慮結(jié)果是否符合有關實驗結(jié)果時，除了應考慮結(jié)果是否符合有關實驗室判定標準外，還應綜合考慮各種影響檢驗室判定標準外，還應綜合考慮各種影響檢驗結(jié)果的因素。結(jié)果的因素。結(jié)果的報告與分析n陽性結(jié)果不一定能說明病原因子在爆發(fā)事件陽性結(jié)果不一定能說明病原因子在爆發(fā)事件中的致病作用；反之陰性結(jié)果也不一定能完中的致病作用；反之陰性結(jié)果也不一定能完全否定某種病原因子的病因假設全否定某種病原因子的病因假設.結(jié)果的報告與分析n實驗室檢測結(jié)果是確定病因的重要依據(jù)，但實實驗室檢測結(jié)果是確定病因的重要依

20、據(jù)，但實驗室結(jié)果要和現(xiàn)場調(diào)查情況、患者的臨床表現(xiàn)驗室結(jié)果要和現(xiàn)場調(diào)查情況、患者的臨床表現(xiàn)一起分析，才能確定病因。一起分析，才能確定病因。五、案例分析五、案例分析n2010年9月8日起，四川某高職學院陸續(xù)有學生發(fā)病，癥狀以腹痛、腹瀉為主，部分學生伴惡心、嘔吐，個別有發(fā)熱等癥狀并到本校醫(yī)院進行治療,疾病預防控制中心疫情處理人員于9月15日接到報告后趕赴現(xiàn)場調(diào)查和采樣。 n問題1：現(xiàn)場調(diào)查內(nèi)容？n1）基本情況學校情況，食堂情況，飲用水情況n2） 發(fā)病情況發(fā)病情況n3）臨床表現(xiàn)臨床表現(xiàn) n4）治療情況 1）、基本情況n該學院位于岷江二號橋旁，占地三百七十余畝，全院有教職工330人，學生4500人，學生

21、均住校。8月23日新學期整體搬入該新校址。學院生活飲用水為自備式供水，水源位于岷江旁，取水點位于學院污水排污口下方200米；學校未集中供應開水，學生寢室多配有飲水機，主要飲用“龍蓀泉”、“清心泉”牌桶裝礦泉水。學校的水處理廠沒有定期對水源水進行消毒和監(jiān)測。同時，污水處理設備一直未啟用，且污水管道在鋪設時不符合標準，導致生活污水泄露，并蓄積在取水點上方的低洼地帶，該校生活飲用水取水點設置見圖1。 2）、發(fā)病情況）、發(fā)病情況 9月8日以來陸續(xù)有學生發(fā)病，癥狀以腹痛、腹瀉為主，部分學生伴惡心、嘔吐，個別有發(fā)熱等癥狀。共計249例。病例在9月13日以后逐漸增多，9月1416日發(fā)病人數(shù)達到高峰，17日以后發(fā)病人數(shù)有所下降，每日新增病例數(shù)見圖2。病