蛋白質(zhì)定量實(shí)驗(yàn)

1、 生命科學(xué)是以探求生命奧秘為中心課題。生命科學(xué)是以探求生命奧秘為中心課題。 蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能。功能。 沒有足夠純度的生物大分子，結(jié)構(gòu)與功能沒有足夠純度的生物大分子，結(jié)構(gòu)與功能的研究就無從談起。的研究就無從談起。 必須首先解決生物大分子的制備問題。必須首先解決生物大分子的制備問題。 對獲得的生物大分子進(jìn)行鑒定。對獲得的生物大分子進(jìn)行鑒定。離心離心分子分子生物學(xué)技術(shù)生物學(xué)技術(shù)電泳電泳層析層析光學(xué)光學(xué)生化生化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)生化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容安排生化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容安排實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一一實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)16：DEAE纖維素離子交換層析纖維素離子交換層析二二

2、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)17：血清：血清-球蛋白的提純球蛋白的提純實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)8 ：醋酸纖維素薄膜電泳：醋酸纖維素薄膜電泳三三實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)9 ：聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳四四實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)3 ：測定蛋白質(zhì)的比色分析法：測定蛋白質(zhì)的比色分析法實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)12：血脂蛋白電泳：血脂蛋白電泳五五實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)18：真核基因組：真核基因組DNA的分離提取的分離提取六六實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)7 ：酶促反應(yīng)：酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)19：質(zhì)粒：質(zhì)粒DNA的提取及酶切鑒定的提取及酶切鑒定第一輪第一輪實(shí)驗(yàn)本身實(shí)驗(yàn)本身:實(shí)驗(yàn)室規(guī)則實(shí)驗(yàn)室規(guī)則:時(shí)間、穿著、時(shí)間、穿著、儀器不能亂動(dòng)儀器不能亂動(dòng)、賠償制度、賠償制度、整潔、整潔、衛(wèi)生。衛(wèi)生。預(yù)習(xí)報(bào)告、預(yù)習(xí)報(bào)

3、告、規(guī)范操作規(guī)范操作（辨認(rèn)標(biāo)簽（辨認(rèn)標(biāo)簽）、）、如實(shí)記錄、如實(shí)記錄、污染物、毒物、廢棄物污染物、毒物、廢棄物（酸堿燒傷大量自來水沖洗）（酸堿燒傷大量自來水沖洗）l實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：題目，組號題目，組號實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)記錄：實(shí)驗(yàn)記錄：如實(shí)記錄如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果分析：實(shí)事求是實(shí)事求是討論或小結(jié)：討論或小結(jié)：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 實(shí)驗(yàn)前需預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和有關(guān)理論，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、預(yù)期的結(jié)果、實(shí)驗(yàn)前需預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和有關(guān)理論，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、預(yù)期的結(jié)果、 操作關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)操作關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng),寫預(yù)習(xí)報(bào)告寫預(yù)習(xí)報(bào)

4、告。 實(shí)驗(yàn)要嚴(yán)肅認(rèn)真地按照操作規(guī)程進(jìn)行，注意觀察實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果，實(shí)驗(yàn)要嚴(yán)肅認(rèn)真地按照操作規(guī)程進(jìn)行，注意觀察實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果，并把實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果并把實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果及時(shí)如實(shí)及時(shí)如實(shí)記錄在實(shí)驗(yàn)記錄本上，課后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)記錄在實(shí)驗(yàn)記錄本上，課后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析。行科學(xué)分析。 實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)臺(tái)應(yīng)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)臺(tái)應(yīng)保持整潔保持整潔。公用試劑用畢，立即蓋嚴(yán)并還原。實(shí)驗(yàn)完畢，。公用試劑用畢，立即蓋嚴(yán)并還原。實(shí)驗(yàn)完畢，儀器洗凈放好。儀器洗凈放好。 注意節(jié)約藥品、試劑和各種物品，愛護(hù)儀器，按規(guī)程操作儀器，注意節(jié)約藥品、試劑和各種物品，愛護(hù)儀器，按規(guī)程操作儀器，以免損壞以免損壞。 實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)

5、禁吸煙！嚴(yán)禁吸煙！乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加熱，并遠(yuǎn)離火源。實(shí)乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加熱，并遠(yuǎn)離火源。實(shí)驗(yàn)結(jié)束離開實(shí)驗(yàn)室之前，關(guān)好窗戶，切斷電源，水源，確保安全。驗(yàn)結(jié)束離開實(shí)驗(yàn)室之前，關(guān)好窗戶，切斷電源，水源，確保安全。 若發(fā)生酸堿灼燒事故，若發(fā)生酸堿灼燒事故，應(yīng)用大量自來水沖洗應(yīng)用大量自來水沖洗，酸灼傷者用飽和，酸灼傷者用飽和NaHCO3溶溶液中和，堿灼傷者用飽和液中和，堿灼傷者用飽和H3BO3溶液中和，氧化劑傷害者用溶液中和，氧化劑傷害者用Na2S2O4處理。處理。 所有所有固體廢棄物固體廢棄物如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于垃圾桶中。如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于

6、垃圾桶中。強(qiáng)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿酸、強(qiáng)堿必須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽。必須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽。血漿脂蛋白的分類血漿脂蛋白的分類血漿脂蛋白組成特點(diǎn)血漿脂蛋白組成特點(diǎn)血漿脂蛋白的結(jié)構(gòu)血漿脂蛋白的結(jié)構(gòu)血脂代謝的臨床意義血脂代謝的臨床意義電泳技術(shù)簡介電泳技術(shù)簡介 電泳定義電泳定義 電泳技術(shù)電泳技術(shù) 影響電泳速度的主要因素影響電泳速度的主要因素 電泳的分類電泳的分類 水平電泳裝置水平電泳裝置 瓊脂糖的特點(diǎn)瓊脂糖的特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理： 各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類及數(shù)量不同，各種脂蛋白顆粒大小、及數(shù)量不同，各種脂蛋白顆粒大小、帶電荷的數(shù)量相差也很大，因此以

7、帶電荷的數(shù)量相差也很大，因此以瓊脂糖凝膠為支持物，在電場中可瓊脂糖凝膠為支持物，在電場中可使各種脂蛋白顆粒分離開來。使各種脂蛋白顆粒分離開來。 實(shí)驗(yàn)方法（概括）實(shí)驗(yàn)方法（概括） 將血清脂蛋白用脂類染料（如蘇丹將血清脂蛋白用脂類染料（如蘇丹黑或油紅等）進(jìn)行預(yù)染。再將預(yù)染黑或油紅等）進(jìn)行預(yù)染。再將預(yù)染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進(jìn)行過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進(jìn)行電泳分離，通電后，可以看出脂蛋電泳分離，通電后，可以看出脂蛋白向正極移動(dòng)，并分離為幾個(gè)區(qū)帶。白向正極移動(dòng)，并分離為幾個(gè)區(qū)帶。實(shí)驗(yàn)操作 、預(yù)染血清、預(yù)染血清 2 2、制備瓊脂糖凝膠板、制備瓊脂糖凝膠板 、點(diǎn)加血清、點(diǎn)加血清 、電泳、電泳 、觀察

8、并記錄電泳結(jié)果、觀察并記錄電泳結(jié)果 (1)蘇丹黑染色液：稱取100nag蘇丹黑B加0.2mL2氧六環(huán)混勻，加3mL無水乙醇，37 0C水浴30min。 (2)巴比妥緩沖液：稱取巴比妥鈉5.4g，巴比妥2.76g及EDTA0.29g，加水溶解后再加蒸餾水至1000mL(pH為8.6離子強(qiáng)度0.075)，為電極緩沖液。 (3)凝膠緩沖液：取三羥甲基氨基甲烷1.212g，EDTA0.29g及NaCl5.85g，用蒸餾水溶解后，稀釋至1000mL，pH為8.6。 (4)瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖0.5g溶于50mL凝膠緩沖液中，再加水50ml。在水浴中加熱至沸。待瓊脂糖完全溶解后，立即停止加熱。試劑實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

9、的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握雙縮脲法測定蛋白濃度的原理。掌握雙縮脲法測定蛋白濃度的原理。2. 掌握掌握Lowry氏法測定蛋白濃度的原理。氏法測定蛋白濃度的原理。3. 學(xué)會(huì)使用分光光度計(jì)。學(xué)會(huì)使用分光光度計(jì)。 4. 總結(jié)蛋白質(zhì)定量方法的設(shè)計(jì)思路?？偨Y(jié)蛋白質(zhì)定量方法的設(shè)計(jì)思路。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理一、雙縮脲法測定血清總蛋白一、雙縮脲法測定血清總蛋白 雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng) 操作操作 計(jì)算計(jì)算 試劑及器材試劑及器材二、二、Lowry氏法測定蛋白質(zhì)含量法氏法測定蛋白質(zhì)含量法 原理原理 操作操作 計(jì)算計(jì)算 試劑及器材試劑及器材試劑使用規(guī)則試劑使用規(guī)則 使用試劑前應(yīng)該使用試劑前應(yīng)該仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃

10、度，是，看清名稱及濃度，是 否否為本實(shí)驗(yàn)所需。為本實(shí)驗(yàn)所需。 取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試劑決不可倒回原瓶。劑決不可倒回原瓶。 取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)該將標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入干試管中應(yīng)該將標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入干試管中，再用干，再用干凈吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)液，凈吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)液，以免污染瓶中的標(biāo)準(zhǔn)液體。以免污染瓶中的標(biāo)準(zhǔn)液體。 使用滴管時(shí)，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內(nèi)。使用滴管時(shí)，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內(nèi)。 使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，盡可能用量筒取，若用吸使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，盡可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸

11、取，以免造成意外。管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。吸量管的種類吸量管的種類 奧氏吸量管奧氏吸量管 供準(zhǔn)確量取供準(zhǔn)確量取0.50、1.0、2.0、3.0ml液體所用。這液體所用。這種吸量管只有一個(gè)刻度，當(dāng)放出所量取的液體時(shí)，管尖余留種吸量管只有一個(gè)刻度，當(dāng)放出所量取的液體時(shí)，管尖余留的液體必須吹入容器內(nèi)。的液體必須吹入容器內(nèi)。 移液管移液管 常用量取常用量取50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0ml的液體，的液體，這種吸量管只有一個(gè)刻度，放液時(shí)，量取的液體自然流出后，這種吸量管只有一個(gè)刻度，放液時(shí)，量取的液體自然流出后，管尖需在容器內(nèi)滯留管尖需在容器內(nèi)滯留15秒。秒。

12、注意管尖殘留的液體不要吹出。注意管尖殘留的液體不要吹出。 刻度吸量管刻度吸量管 供量取供量取10 ml以下任意體積的溶液。一般刻度包以下任意體積的溶液。一般刻度包括尖端部分。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管括尖端部分。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管尖的溶液。此類吸量管為尖的溶液。此類吸量管為“吹出式吹出式”，吸量管上端標(biāo)有，吸量管上端標(biāo)有“吹吹”字。未標(biāo)字。未標(biāo)“吹吹”字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體。字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體。吸量管的使用吸量管的使用原則原則 量取整數(shù)量液體，并且取量要求準(zhǔn)確時(shí)，應(yīng)該選用奧氏量取整數(shù)量液體，并且取量要求準(zhǔn)確時(shí)，應(yīng)該選用奧氏吸量

13、管。量取大體積時(shí)要用移液管。同一定量實(shí)驗(yàn)中，吸量管。量取大體積時(shí)要用移液管。同一定量實(shí)驗(yàn)中，如欲加同種試劑于不同的管中，并且取量不多時(shí)，如欲加同種試劑于不同的管中，并且取量不多時(shí)，應(yīng)應(yīng)選擇一支與最大取液量接近的刻度吸量管。選擇一支與最大取液量接近的刻度吸量管。吸量管的使用方法吸量管的使用方法 正確拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂正確拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端端 取液：用橡皮球吸液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸取液：用橡皮球吸液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上端。完后用食指頂住吸量管上端。 調(diào)刻度：吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸

14、，并調(diào)刻度：吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應(yīng)在一水平面上。面、刻度和視線應(yīng)在一水平面上。 放液：吸量管移入準(zhǔn)備接受溶液的容器中，仍使其出口尖放液：吸量管移入準(zhǔn)備接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開食指，端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開食指，使液體自動(dòng)流出。奧氏吸量管和刻度到底的吸量管應(yīng)吹出使液體自動(dòng)流出。奧氏吸量管和刻度到底的吸量管應(yīng)吹出尖端殘留的液體。移液管應(yīng)最后靠壁尖端殘留的液體。移液管應(yīng)最后靠壁15秒。秒。 加

15、樣器的正確使用加樣器的正確使用 移液管的正確使用（特別注意每種試劑移液管的正確使用（特別注意每種試劑的專用管不可混用）的專用管不可混用） 加樣量的準(zhǔn)確性加樣量的準(zhǔn)確性 溫度與時(shí)間的準(zhǔn)確性溫度與時(shí)間的準(zhǔn)確性 分光光度計(jì)的校準(zhǔn)和使用分光光度計(jì)的校準(zhǔn)和使用 開啟電源，儀器預(yù)熱開啟電源，儀器預(yù)熱20分鐘。分鐘。 波長調(diào)至測試用波長。波長調(diào)至測試用波長。 將比色皿架處于空白管位置，打開試樣室蓋，選將比色皿架處于空白管位置，打開試樣室蓋，選擇擇“T”檔，調(diào)節(jié)檔，調(diào)節(jié)“0”按鈕，使數(shù)字顯示為按鈕，使數(shù)字顯示為“0.00”。 蓋上試樣室蓋，使光電管受光，調(diào)節(jié)透過率蓋上試樣室蓋，使光電管受光，調(diào)節(jié)透過率“100

16、%”按鈕，使數(shù)字顯示為按鈕，使數(shù)字顯示為“100.0”。 吸光度的測量，將選擇開關(guān)置于吸光度的測量，將選擇開關(guān)置于“A”，調(diào)節(jié)吸光，調(diào)節(jié)吸光度調(diào)零按鈕，使數(shù)字顯示為度調(diào)零按鈕，使數(shù)字顯示為0.00，然后將被測，然后將被測樣品移入光路，顯示值即為被測樣品的吸光度值。樣品移入光路，顯示值即為被測樣品的吸光度值。 722機(jī)的光譜范圍在機(jī)的光譜范圍在360nm-800nm722分光光度計(jì)使用方法分光光度計(jì)使用方法該機(jī)的光譜范圍在該機(jī)的光譜范圍在360nm-800nm。 接通電源，打開機(jī)器開關(guān)，使儀器通電，打開箱蓋，預(yù)熱接通電源，打開機(jī)器開關(guān)，使儀器通電，打開箱蓋，預(yù)熱10分鐘。分鐘。 將空白液或?qū)φ找?/p>

17、及測定液分別裝入比色杯將空白液或?qū)φ找杭皽y定液分別裝入比色杯3/4體積并用軟紙擦清外壁，體積并用軟紙擦清外壁， 放入樣品室。放入樣品室。 調(diào)節(jié)電流計(jì)上零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使讀書盤上指針的吸光度為調(diào)節(jié)電流計(jì)上零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使讀書盤上指針的吸光度為A或透光率為或透光率為0。 調(diào)節(jié)測定所用波長。調(diào)節(jié)測定所用波長。 蓋上箱蓋，光徑開關(guān)自動(dòng)打開。轉(zhuǎn)動(dòng)光量調(diào)節(jié)器使空白或?qū)φ展艿奈馍w上箱蓋，光徑開關(guān)自動(dòng)打開。轉(zhuǎn)動(dòng)光量調(diào)節(jié)器使空白或?qū)φ展艿奈?度為度為0，或透光率為，或透光率為100，待讀數(shù)指針穩(wěn)定后，逐步拉出樣品盒滑干，待讀數(shù)指針穩(wěn)定后，逐步拉出樣品盒滑干， 通過讀數(shù)指針，讀取測定管上的吸光度。有時(shí)需調(diào)節(jié)靈敏度開

18、關(guān)，才能通過讀數(shù)指針，讀取測定管上的吸光度。有時(shí)需調(diào)節(jié)靈敏度開關(guān)，才能 正確讀得吸光度。此時(shí)應(yīng)重新轉(zhuǎn)動(dòng)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器至吸光度為正確讀得吸光度。此時(shí)應(yīng)重新轉(zhuǎn)動(dòng)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器至吸光度為A。 讀數(shù)完畢，打開儀器蓋板，關(guān)閉開關(guān)，將比色杯沖洗干凈。讀數(shù)完畢，打開儀器蓋板，關(guān)閉開關(guān)，將比色杯沖洗干凈。 溶液定量測定時(shí)，應(yīng)注意吸光度在溶液定量測定時(shí)，應(yīng)注意吸光度在0.11.0范圍，濃度太大時(shí)應(yīng)適當(dāng)稀范圍，濃度太大時(shí)應(yīng)適當(dāng)稀 釋。釋。 *注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1）用手拿比色杯的磨砂面。）用手拿比色杯的磨砂面。 2）液體的體積裝滿比色杯的）液體的體積裝滿比色杯的3/4。 3）不要將比色杯放在分光光度計(jì)上）不要將比色杯放在分光光度計(jì)上。1.比色杯光學(xué)表面不能有任何污損，否則會(huì)比色杯光學(xué)表面不能有任何污損，否則會(huì)引起光吸收的增加。用手拿比色杯的磨砂面。引起光吸收的增加。用手拿比色杯的磨砂面。 3.裝液量不能超過裝液量不能超過3/4,用前潤洗。用前潤洗。2.2.比色杯的外表面應(yīng)以高質(zhì)量的柔軟擦鏡紙或比色杯的外表面應(yīng)以高質(zhì)量的柔軟擦鏡紙或綢布擦干凈，不能使用易磨損比色杯的濾紙。綢布擦干凈，不能使用易磨損比