秀麗線蟲(chóng)的研究和飼養(yǎng)

1、秀麗隱桿線蟲(chóng)的飼養(yǎng)及研究用途 By 王傳杰介紹 秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）,屬于線形動(dòng)物門(mén)、線蟲(chóng)綱。體形非常小,成蟲(chóng)只有1mm左右。 線 蟲(chóng) 是 細(xì) 胞 定 數(shù) 動(dòng) 物 ， 兩性 成蟲(chóng) 只有 9 5 9 個(gè) 體 細(xì) 胞 ， 雄 性 成 蟲(chóng) 只 有 1 0 3 1 個(gè) 體細(xì) 胞 ， 其 中 1 3 1個(gè) 細(xì) 胞 注 定 要 接 一 定 的發(fā) 育 程 序 陸續(xù) 死 亡 。 神 經(jīng) 系統(tǒng)解 剖結(jié) 構(gòu) 十 分 簡(jiǎn) 單 ， 僅有 3 0 2個(gè)細(xì) 胞 ， 約 占整 個(gè) 動(dòng) 物 體 細(xì) 胞 總 數(shù) 的 三 分 之 一 。它身體透明,能感知?dú)馕逗臀兜?對(duì)光線、溫度有反應(yīng)。研究

2、者很容易在顯微鏡下對(duì)其細(xì)胞和組織進(jìn)行跟蹤觀察 飼養(yǎng)與凍存設(shè)備試劑： 大腸桿菌大腸桿菌OP50 大腸桿菌大腸桿菌OP50是尿嘧啶滲漏突變型是尿嘧啶滲漏突變型,作為作為秀麗隱桿線蟲(chóng)的食物。秀麗隱桿線蟲(chóng)的食物。 NGM培養(yǎng)基培養(yǎng)基1000ml的的NGM培養(yǎng)基內(nèi)加有培養(yǎng)基內(nèi)加有:3gNaCl,2.5g蛋蛋白胨白胨,17g瓊脂瓊脂,1mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液緩沖液(pH=6.0)25ml,975ml蒸餾水蒸餾水,滅菌后加入分別抽濾除菌的滅菌后加入分別抽濾除菌的1ml膽固膽固醇溶液醇溶液(5mg/ml乙醇乙醇),1mol/LMgSO41ml,1mol/L的的 CaCl 21ml M9緩沖

3、液每升緩沖液中含15.12gNa2HPO4#12H2O(或6gNa2HPO4),3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4#7H2O,宜現(xiàn)用現(xiàn)配S緩沖液0.1mol/LNaCl,0.05mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH=6.0)喂養(yǎng)方法 用冰M9緩沖液清洗蟲(chóng)體 置4環(huán)境20min 1000r離心，棄上清,沉淀物用M9緩沖液重懸 置4環(huán)境20min 棄上清 取200ul沉淀物以靠接法接種到涂有大腸桿菌大腸桿菌OP50的的NGM培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上將培養(yǎng)基放置到將培養(yǎng)基放置到16生化培養(yǎng)箱中，72h后可繁育至第二代 凍存準(zhǔn)備1mlEP管，加入700ul30%甘油（s緩沖液

4、溶解）用冰M9緩沖液清洗蟲(chóng)體置4環(huán)境20min，1000r離心棄去上清將蟲(chóng)體轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好的EP管中，置于-80冰箱凍存（可保存2個(gè)月），需要時(shí)取出室溫解凍重置培養(yǎng)基研究范圍 細(xì)胞程序性死亡的遺傳調(diào)控機(jī)制 RNAi 及其作用機(jī)制 秀麗線蟲(chóng)的功能基因組學(xué)及其他研究秀麗線蟲(chóng)的功能基因組學(xué)及其他研究 低氧應(yīng)答模式生物 基因組學(xué)和功能蛋白組學(xué)的研究基因組學(xué)和功能蛋白組學(xué)的研究 其他（其他（MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo) 、 TGF- b 信號(hào)傳遞途徑信號(hào)傳遞途徑 、衰老和年齡及脂、衰老和年齡及脂肪代謝等）肪代謝等） 方法 線蟲(chóng)基因顯微注射顯微注射技術(shù)是線蟲(chóng)研究領(lǐng)域的常用技術(shù)，對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的一種高效

5、且相對(duì)簡(jiǎn)單的方法，主 要用于研究線蟲(chóng)突變種系的功能恢復(fù)(mutant rescue)、特定基因的過(guò)表達(dá)或異位表達(dá)、標(biāo) 簽 蛋白的 表達(dá)、特 定 蛋白 質(zhì) 結(jié)構(gòu)域的功 能、DNA 或 RNA 調(diào)節(jié)元件的分析及 RNA 干擾等 此外，這項(xiàng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)于特異表型的篩選也是個(gè)強(qiáng)有 力 的 工具 ， 并 且 它還 可 用于 將人 工 合 成 mRNAs 或其他分子接引入細(xì)胞設(shè)備 顯微注射全套儀器 瓊脂糖固定墊 添 加 了 4% 葡萄糖 (glucose) 的 M9 緩 沖液注射步驟制劑及破針制劑及破針固定蟲(chóng)固定蟲(chóng)將純化的將純化的 DNA 溶解在溶解在 Tris-EDTA(TE)緩沖液中即可接用緩沖液中即

6、可接用于注射。在注射液中加入終濃于注射。在注射液中加入終濃度約度約 10 mg/L 的線蟲(chóng)基因組的線蟲(chóng)基因組 DNA，則會(huì)有效地提高轉(zhuǎn)基因，則會(huì)有效地提高轉(zhuǎn)基因效率。效率。將一小玻片放在加了注射油的將一小玻片放在加了注射油的固定墊上，操縱微操使注射針固定墊上，操縱微操使注射針與玻片邊緣相撞，若針頭尖端與玻片邊緣相撞，若針頭尖端撞破，可觀察到有液泡自動(dòng)滲撞破，可觀察到有液泡自動(dòng)滲出出注射時(shí)將注射時(shí)將線蟲(chóng)挑至線蟲(chóng)挑至瓊脂糖固瓊脂糖固定墊上，定墊上，調(diào)整線蟲(chóng)調(diào)整線蟲(chóng)使性腺暴使性腺暴露，滴加露，滴加注射油覆注射油覆蓋整個(gè)蟲(chóng)蓋整個(gè)蟲(chóng)體體 固定固定好后的操好后的操作要迅速，作要迅速，否則線蟲(chóng)否則線蟲(chóng)容易脫

7、水容易脫水而死而死將瓊脂糖固定墊放將瓊脂糖固定墊放在載物臺(tái)上，在載物臺(tái)上，40 x物物鏡下找到線蟲(chóng)，使鏡下找到線蟲(chóng)，使性腺聚焦在正確的性腺聚焦在正確的平面平面 操作微操或操作微操或輕移滑動(dòng)載物臺(tái)，輕移滑動(dòng)載物臺(tái)，將注射針尖刺入性將注射針尖刺入性腺腺 啟動(dòng)微量加壓?jiǎn)?dòng)微量加壓器進(jìn)行注射，能觀器進(jìn)行注射，能觀察到注射液在性腺察到注射液在性腺中快速流動(dòng)，注射中快速流動(dòng)，注射后的性腺被液體充后的性腺被液體充滿滿在體視顯微鏡下，在體視顯微鏡下，滴加恢復(fù)緩沖液至滴加恢復(fù)緩沖液至注射后的線蟲(chóng)正上注射后的線蟲(chóng)正上方，由于與油互不方，由于與油互不相溶，緩沖液會(huì)滲相溶，緩沖液會(huì)滲入油下使線蟲(chóng)浮入油下使線蟲(chóng)浮起起

8、一般等待一般等待 2 5 min，線蟲(chóng)活力，線蟲(chóng)活力恢復(fù)，身體開(kāi)始游恢復(fù)，身體開(kāi)始游動(dòng)，即可挑至培養(yǎng)動(dòng)，即可挑至培養(yǎng)板上，板上，20 常規(guī)培常規(guī)培養(yǎng)養(yǎng)注射注射恢復(fù)恢復(fù) 瓊脂糖固定墊 取約 50 ul 加熱溶解的 2%瓊脂糖(agarose)溶液滴在長(zhǎng)寬 50 mmx24 mm，厚 0.13 0.17 mm 的載玻片上，用另一載玻片輕壓其上，待瓊脂糖凝固后( 約 2 min)，將上面的玻片從側(cè)面滑下即可 制作好的固定墊室溫過(guò)夜或 65 干燥 1h 后可疊放起來(lái)備用 恢復(fù)緩沖液5.8 g Na2HPO4， 3.0 g KH2PO4，0.5 g NaCl， 1.0gNH4Cl加水至 1L，高壓滅菌，

9、用于注射后線蟲(chóng)的恢復(fù) 注射子代目的基因表達(dá)檢測(cè)注射后約 3 天，觀察孵出的 F1 代是否有目的DNA 表達(dá) 目前，線蟲(chóng)外源基因表達(dá)的標(biāo)記通常用：a 熒光蛋白與目的蛋白形成融合蛋白，但熒光蛋白與目的蛋白形成融合蛋白，但需要確定熒光蛋白的連接不影響目的蛋白的功能；需要確定熒光蛋白的連接不影響目的蛋白的功能；b 目的基因與熒光標(biāo)記基因共注射；目的基因與熒光標(biāo)記基因共注射；c 目的基因目的基因與具有明顯表型的標(biāo)記基因共注射，與具有明顯表型的標(biāo)記基因共注射，我們通常使用易觀察的 pmyo-3:TDimer II作為熒光標(biāo)記，它在所有體壁肌肉細(xì)胞表達(dá)，轉(zhuǎn)基因效率高且本身對(duì)線蟲(chóng)的行為 和功能沒(méi)有 影響。顯微

10、注射后的整合目前常用的整合方法有：用 y射線和 X射線照射，或用光敏劑補(bǔ)骨脂素加長(zhǎng)波紫外線照射整合(TMP/UV integration) 基本策略是大量篩選經(jīng)射線照射過(guò)的轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)，一般挑取數(shù)百只 F1 代繁殖，篩選 F4 代，檢測(cè)是否有 100%的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，若是則說(shuō)明整合成功 一般一次整合能得到若干個(gè)獨(dú)立種系，可選擇最好的一個(gè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 整合TMP/UV 整合無(wú)需 酌 或 X 射線源，可在普通實(shí) 驗(yàn)室 進(jìn) 行 誘 變 劑 TMP (Trioxsalen 或 4,5憶 ,8-Trimethylpsoralen, 三甲基補(bǔ)骨脂素)，劇毒，避光，對(duì)其操作都需避光進(jìn)行 TMP/UV 的處理可使線蟲(chóng)

11、 DNA 發(fā)生隨機(jī)斷裂，從而使染色體外的 DNA片段整合至染色體上 TMP/UV 整合法的流程為：a 用 M9 緩沖液將同步好的 L4 齡線蟲(chóng)從培養(yǎng)板中清洗下來(lái)，加 TMP(溶于 DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，存于-80 )使其終濃度為 50 mg/L b 室溫下輕柔振蕩15 min，將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)至未鋪菌的 9 cm 培養(yǎng)板上紫外線照射，照射能量為 35 000 滋J/cm2，換算成瞬時(shí)功率即 350 滋W/cm2, 100s c 照射完畢后，在培養(yǎng)板上加大腸桿菌 OP50，室避光培養(yǎng) 5h，使線蟲(chóng)活力恢復(fù) d 挑取 15 25 只狀態(tài)較好的 P0 代個(gè)體，每板 1 只，等待大腸桿菌被吃完，挑 100300

12、 只 F2 代，每板 1 只，觀察 F4 代是否全部表達(dá)注射 DNA 根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，如果經(jīng)紫外線照射后，后代出現(xiàn)很多具有短粗、致死表型的線蟲(chóng)，甚至 1/4 沒(méi)有后代，則預(yù)示整合成功 整合成功的標(biāo)準(zhǔn)是 F4 代全部表達(dá)目的基因，若沒(méi)有，一般沒(méi)必繼續(xù)篩選，可認(rèn)為該克隆的整合不成功細(xì)胞程序性死亡的遺傳調(diào)控機(jī)制 現(xiàn)階段研究已發(fā)現(xiàn)了十幾個(gè)控制細(xì)胞凋亡的基因，這些凋亡基因之間通過(guò)遺傳相互作用組成一條線性的調(diào)控途徑控制細(xì)胞程序性死亡，包括凋亡的激活階段、凋亡的起始 、凋亡細(xì)胞的清除及凋亡細(xì)胞內(nèi)部的 DNA 降解線蟲(chóng)PCA關(guān)鍵階段EGL-1：促凋亡蛋白，屬BCl2蛋白家族，與哺乳動(dòng)物BAD、BIK/NBK及

13、HRK同源CED-9:抗凋亡蛋白,與人體bcl-2同源CED-4:促凋亡蛋白,同源體為Apaf-1CED-3:凋亡蛋白,與ICE(caspase家族)同源低氧應(yīng)答模式生物低氧能夠引起秀麗線蟲(chóng)發(fā)生相應(yīng)的生理和行為學(xué)變化，并可保護(hù)機(jī)體免受缺氧損傷。秀麗線蟲(chóng)的低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)的恒定性調(diào)控通路和人類的相應(yīng)通路之間具有高度保守性，因此秀麗線蟲(chóng)也已成為研究低氧應(yīng)答調(diào)控通路進(jìn)化保守性的重要工具之一。闡明秀麗線蟲(chóng)的低氧應(yīng)答機(jī)制將為了解人類低氧相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供有價(jià)值的線索。相關(guān)機(jī)制低氧環(huán)境秀麗線蟲(chóng)的非HIF一1介導(dǎo)的低氧應(yīng)答通路秀麗線蟲(chóng)的氧感知神經(jīng)回路胰島素胰島素樣受體DAF-2通路熱休克蛋白及其它秀麗線蟲(chóng)中低氧誘導(dǎo)因子HIF1介導(dǎo)的低氧應(yīng)答m i R N A 作用機(jī)制的研究首個(gè)時(shí)序調(diào)控的miRNA 基因 lin-4發(fā)現(xiàn)于線蟲(chóng)，轉(zhuǎn)錄后形成兩種長(zhǎng)度的RNA，較小的一個(gè)與基因lin-14的mRNA互補(bǔ)配對(duì)阻礙其翻譯，隨后又發(fā)現(xiàn)了類似作用的let-7.通過(guò)研究miRNA在線蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)對(duì)于靶基因翻譯表達(dá)的阻礙作用，為疾病治療提供新手段，特別是探究其對(duì)RNA病毒侵染的抑制作用其他方面 衰老和壽命控制機(jī)制衰老和壽命控制機(jī)制DAF-16 蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中激活靶基因