第三章 培養(yǎng)用液

1、 第三章第三章 培培 養(yǎng)養(yǎng) 用用 液液n 培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液是維護組織細胞生存、生長及進是維護組織細胞生存、生長及進 行細胞培養(yǎng)各項操作過程中所需的基本溶行細胞培養(yǎng)各項操作過程中所需的基本溶 液。液。n主要包括主要包括平衡鹽溶液平衡鹽溶液培養(yǎng)基培養(yǎng)基其他培養(yǎng)用液其他培養(yǎng)用液 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基第一節(jié)第一節(jié) 水和平衡鹽溶液水和平衡鹽溶液 細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。其他的雜質(zhì)。 需要用需要用新鮮新鮮( (一周內(nèi)）一周內(nèi)）的的三蒸水三蒸水或或純化水純化水 純化水的純化水的貯存貯存對保持水的質(zhì)量有很大影響：對保持水的質(zhì)量

2、有很大影響：需用需用玻璃容器玻璃容器；周圍環(huán)境和空氣能使水污染，；周圍環(huán)境和空氣能使水污染，或改變其或改變其pHpH，所以要，所以要盡量減少啟開的次數(shù)盡量減少啟開的次數(shù), ,避免避免和外界多接觸和外界多接觸, ,存放時間不宜太長存放時間不宜太長, , 最好現(xiàn)制現(xiàn)最好現(xiàn)制現(xiàn)用。用。一、細胞培養(yǎng)對水的要求一、細胞培養(yǎng)對水的要求n2 2、平衡鹽溶液、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS） 注意：注意： 配制平衡鹽溶液也應當用純化水。如果配方配制平衡鹽溶液也應當用純化水。如果配方中含有中含有Ca2+、Mg 2+，應當首先溶解這些成分。，應當首先溶解這些成分。 滅菌方法：滅菌

3、方法： 過濾除菌或高溫高壓滅菌。過濾除菌或高溫高壓滅菌。 n幾種常用的平衡鹽溶液：幾種常用的平衡鹽溶液： PBS、Hanks、D-Hanks（都有相應配方（都有相應配方, ,主要由無機鹽、葡萄糖組成）主要由無機鹽、葡萄糖組成） nD-Hanks與與Hanks的一個主要區(qū)別在于前者不的一個主要區(qū)別在于前者不含有含有Ca2+、Mg2+ n因此因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。常用于配制胰酶溶液。第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 一、成分成分1.1.氨基酸：氨基酸：精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨

4、酸和纈氨酸苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸（均為型）。（均為型）。 2.2.碳水化合物：碳水化合物：葡萄糖葡萄糖3.3.維生素：維生素：葉酸、煙酰胺、吡哆醛、核黃素、硫胺素等。葉酸、煙酰胺、吡哆醛、核黃素、硫胺素等。 4.4.無機離子與微量元素：無機離子與微量元素： 鈉、鉀、鈣、鎂、氮、磷等基本元素以及鐵、鋅、硒、鈉、鉀、鈣、鎂、氮、磷等基本元素以及鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等微量元素。銅、錳、鉬、釩等微量元素。 n3 3、無血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基 不需要添加血清就可維持細胞在體外較長時不需要添加血清就可維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。二、

5、培養(yǎng)基的分類：二、培養(yǎng)基的分類：三、如何選擇培養(yǎng)基？三、如何選擇培養(yǎng)基？n(1)(1)建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應該是培養(yǎng)這建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應該是培養(yǎng)這 種細胞首選的培養(yǎng)基。種細胞首選的培養(yǎng)基。 n(2)(2)本實驗室慣用的培養(yǎng)基本實驗室慣用的培養(yǎng)基 n(3)(3)根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng) 基基 n(4)(4)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀 態(tài)，可用生長曲線、集落形成率等指標判態(tài)，可用生長曲線、集落形成率等指標判 斷，根據(jù)試驗結果選擇最佳培養(yǎng)基斷，根據(jù)試驗結果選擇最佳培養(yǎng)基 四、培養(yǎng)基的

6、配制：四、培養(yǎng)基的配制： （1 1）認真閱讀說明書。）認真閱讀說明書。 （2 2）配制時要保證充分溶解，）配制時要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨、谷氨 酰胺等物質(zhì)都要在培養(yǎng)基完全溶解之后才酰胺等物質(zhì)都要在培養(yǎng)基完全溶解之后才 能添加。能添加。（3 3）配制所用的水應為純化水（三蒸水），離）配制所用的水應為純化水（三蒸水），離 子濃度很低，水電阻達子濃度很低，水電阻達3030萬萬以上。以上。（4 4）所用器皿應十分潔凈。）所用器皿應十分潔凈。（5 5）配制好的培養(yǎng)基應馬上過濾，無菌保存于）配制好的培養(yǎng)基應馬上過濾，無菌保存于 44。DMEM培養(yǎng)液的配制（舉例）培養(yǎng)液的配制（舉例）n900 mL

7、 900 mL 純化水于純化水于1000 mL1000 mL燒杯中，將燒杯中，將DMEMDMEM粉粉1 1包倒入其中，盛粉袋用包倒入其中，盛粉袋用50 mL50 mL純化水分次沖洗，純化水分次沖洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）攪拌溶解。也倒入容器，磁力（或玻棒）攪拌溶解。n用用5 51010的的NaHCONaHCO3 3調(diào)調(diào)pHpH至至7.27.2n加青、鏈霉素至終濃度加青、鏈霉素至終濃度100u/mL 100u/mL 和和100ug/mL100ug/mLn用容量瓶定容到用容量瓶定容到1000 mL 1000 mL n用用0.22um0.22um的濾膜過濾除菌。的濾膜過濾除菌。n分裝（分裝（20

8、0 mL200 mL左右）后左右）后44冰箱保存。冰箱保存。 五、血清：五、血清：n細胞在單純的基礎培養(yǎng)基中不能存活細胞在單純的基礎培養(yǎng)基中不能存活, ,基礎培基礎培養(yǎng)基中常常要添加血清，添加血清后的培養(yǎng)養(yǎng)基中常常要添加血清，添加血清后的培養(yǎng)基被稱為基被稱為“完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基”。n血清終濃度多為血清終濃度多為5 5 20%20%。最常用的是。最常用的是10%10%。 n廣泛應用的血清種類有廣泛應用的血清種類有馬血清與牛血清馬血清與牛血清，后后者又分為者又分為胎牛血清、新生牛血清與小牛血清。胎牛血清、新生牛血清與小牛血清。n胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新生牛血清胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新

9、生牛血清取自出生取自出生2424小時之內(nèi)的新生牛；小牛血清取小時之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生自出生10103030天的小牛。天的小牛。 1 1、血清的主要作用、血清的主要作用(1)(1)提供基本營養(yǎng)物質(zhì)提供基本營養(yǎng)物質(zhì) (2)(2)提供貼壁和擴展因子提供貼壁和擴展因子 (3)(3)提供激素及各種生長因子提供激素及各種生長因子 (4)(4)提供結合蛋白提供結合蛋白 (5)(5)對培養(yǎng)中的細胞提供某些保護作用對培養(yǎng)中的細胞提供某些保護作用 2 2、細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點、細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(1)(1)有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài) (2)(2)血清中

10、含有一些物質(zhì)對細胞會產(chǎn)生毒性作用血清中含有一些物質(zhì)對細胞會產(chǎn)生毒性作用 (3)(3)每批血清之間都有差別每批血清之間都有差別, ,其成分不能保持一致。其成分不能保持一致。(4)(4)取材過程有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng)取材過程有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng) 的細胞產(chǎn)生潛在影響的細胞產(chǎn)生潛在影響(5)(5)直接影響某些實驗，如生長因子的檢測直接影響某些實驗，如生長因子的檢測n3、血清質(zhì)量的判斷：、血清質(zhì)量的判斷： 對于使用者來說，血清質(zhì)量首先從外觀入手。好的血清應該對于使用者來說，血清質(zhì)量首先從外觀入手。好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少量沉淀，比較是透明清亮，土黃色或棕黃色

11、，無沉淀或極少量沉淀，比較粘稠。粘稠。n4 4、血清的使用與儲存、血清的使用與儲存 (2)(2)使用前的處理：血清在使用前通常在使用前的處理：血清在使用前通常在5656加熱加熱3030分鐘，這一過程稱為分鐘，這一過程稱為滅活滅活。 n大包裝的血清，首先將血清滅活處理，然后分大包裝的血清，首先將血清滅活處理，然后分裝為小包裝，如裝為小包裝，如10ml10ml、20ml20ml、50ml50ml，儲存于，儲存于 -20-20，使用前融化。，使用前融化。n融化后的血清在融化后的血清在44不宜長時間存放，不宜長時間存放，勿超過勿超過一個月，一個月，應盡快使用。應盡快使用。 （4）血清中的沉淀物）血清中

12、的沉淀物n絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心量。可用離心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用分鐘去除，也可不用處理處理n顯微鏡下顯微鏡下“小黑點小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象觀察象“小黑點小黑點”，常誤認為血清受污染。一般，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷疑

13、血清質(zhì)量，則應立即停止使用，更換另一批號疑血清質(zhì)量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清的血清舉例清亮清亮小黑點小黑點小黑點小黑點小黑點小黑點六、其他培養(yǎng)用液六、其他培養(yǎng)用液 n、消化液、消化液取材進行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細胞取材進行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁的細胞從瓶壁上消化下來，懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁的細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有：常用的消化液有： （1 1）胰蛋白酶）胰蛋白酶(trypsin)(trypsin)溶液：溶液： 濃度一般為濃度一般為0.10.10.250.25 配制時要用配制時要用不含不含Ca2+、M

14、g2+及血清及血清的平衡鹽溶液的平衡鹽溶液 （2 2）EDTA溶液溶液： 使用濃度為使用濃度為0.02%0.02%；對于一些貼壁特別牢的細胞，對于一些貼壁特別牢的細胞，可可與胰酶的混合使用與胰酶的混合使用 （3 3）膠原酶）膠原酶( (collagenase) )溶液：溶液： 使用濃度為使用濃度為0.10.10.3mg0.3mgL L或或2020萬萬U UL L， 作用的最佳作用的最佳pHpH為為6.56.5。 膠原酶不受膠原酶不受CaCa2+2+、MgMg2+2+及血清的抑制，配制及血清的抑制，配制時可用時可用PBS。 膠原酶作用溫和，不易對細胞產(chǎn)生損傷。在膠原酶作用溫和，不易對細胞產(chǎn)生損傷

15、。在上皮類細胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用。上皮類細胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用。 缺點：價格昂貴缺點：價格昂貴 、谷氨酰胺補充液、谷氨酰胺補充液合成培養(yǎng)基中必需成分，但容易降解，所以合成培養(yǎng)基中必需成分，但容易降解，所以都是在使用前添加。都是在使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度為谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L0.002mol/L。一般配。一般配制為制為100100倍濃縮液，配制時應加溫至倍濃縮液，配制時應加溫至3030，完全，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于-20-20。3 3、pHpH調(diào)整液調(diào)整液 常用的有常用的有 HEPES液液 NaHCO3 n一種弱酸，中文

16、名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性，對細胞無毒性，是一種氫離子緩沖劑，是一種氫離子緩沖劑，能較長能較長時間控制恒定的時間控制恒定的 pH 范圍。范圍。n使用終濃度為使用終濃度為 10-50mmol/L 10-50mmol/L n主要作用主要作用: :防止培養(yǎng)基防止培養(yǎng)基pHpH迅速變動。在開放式迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO5%CO2 2的環(huán)境，的環(huán)境，COCO2 2氣體迅速逸出，氣體迅速逸出，pHpH迅速升高，若迅速升高，若加了加了HEPESHEPES，此時可以維持，此時可以維持pH7.0pH7.0左右。一般左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPESHEPES使用時可向使用時可向100ml100ml培養(yǎng)液中加入培養(yǎng)液中加入2ml 2ml 濃縮液，終濃度為濃縮液，終濃度為20mmol/L20mmol/L 、抗生素液、抗生素液n青、鏈霉素的配制及使用濃度青、鏈霉素的配制及使用濃度n青霉素青霉素8080萬萬U U加加HanksHanks液至液至80 mL80 mL，濃度，濃度1 1萬萬u/ u/ mL