第八章 免疫學檢測方法

1、o 免疫學技術是利用抗原抗體特異性反應免疫學技術是利用抗原抗體特異性反應的原理建立的各種檢測與分析技術，以的原理建立的各種檢測與分析技術，以及建立這些技術的各種制備方法。及建立這些技術的各種制備方法。第八章第八章 免疫學檢測方法免疫學檢測方法檢測技術種類檢測技術種類 一、免疫學檢測免疫學檢測a 免疫凝集試驗免疫凝集試驗a 免疫沉淀試驗免疫沉淀試驗a 酶聯(lián)免疫試驗酶聯(lián)免疫試驗a 熒光免疫技術熒光免疫技術a 免疫電鏡技術免疫電鏡技術a 免疫印跡試驗免疫印跡試驗細菌凝集反應被廣泛應用于細菌學的診斷。在凝集反應細菌凝集反應被廣泛應用于細菌學的診斷。在凝集反應中，將參與反應的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集

2、素中，將參與反應的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。凝集法測定哈維氏弧菌抗體的效價凝集法測定哈維氏弧菌抗體的效價 管號管號1 12 23 34 45 56 67 7磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液0.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.91.01.0兔抗兔抗X X菌血清菌血清0.10.10.1(10.1(1) )0.1(20.1(2) )0.1(0.1(3)3)0.1(0.1(4)4)0.1(50.1(5) )0.00.01.1.稀釋抗體稀釋抗體2.2.玻片凝集法玻片凝集法 用用1ml1ml移液槍取移液槍取6 6號離心管中的溶液一滴滴在載玻片的一端，另一端加一滴號離心管中的

3、溶液一滴滴在載玻片的一端，另一端加一滴磷酸鹽緩沖液，然后分別加一滴準備好的磷酸鹽緩沖液，然后分別加一滴準備好的X X菌液。菌液。 牙簽混勻，至于顯微鏡下觀察，看是否有凝集塊的形成。牙簽混勻，至于顯微鏡下觀察，看是否有凝集塊的形成。 后取后取5 5、4 41 1號管的溶液逐個重復號管的溶液逐個重復1 1、2 2步驟。步驟。 取有凝集塊變?yōu)闊o凝集塊時取有凝集塊變?yōu)闊o凝集塊時, ,那個有凝集反應的試管作為抗體的效價。那個有凝集反應的試管作為抗體的效價。 沉淀凝集反應沉淀凝集反應雙向免疫擴散沉淀線示意圖雙向免疫擴散沉淀線示意圖瓊擴反應中和實驗熒光免疫技術 熒光免疫技術又稱熒光抗體技術。它將免疫熒光免疫

4、技術又稱熒光抗體技術。它將免疫化學和血清學的高度特異性和敏感性與顯微技術化學和血清學的高度特異性和敏感性與顯微技術的高度精確性相結合，為免疫學、臨床組織化學的高度精確性相結合，為免疫學、臨床組織化學及實驗室診斷提供了一項其它方法尚不能取代的及實驗室診斷提供了一項其它方法尚不能取代的、并有其獨特風格的技術。目前，該技術已廣泛、并有其獨特風格的技術。目前，該技術已廣泛應用于細菌、病毒、原蟲以及真菌等的鑒定和相應用于細菌、病毒、原蟲以及真菌等的鑒定和相應病的診斷，血清抗體的檢查，病理組織學抗原應病的診斷，血清抗體的檢查，病理組織學抗原、抗體和補體的鑒定及定位，免疫復合物病理的、抗體和補體的鑒定及定位

5、，免疫復合物病理的研究，細菌、病毒與細胞之間抗原關系的研究等研究，細菌、病毒與細胞之間抗原關系的研究等方面。其主要優(yōu)點在于：特異性強，速度快，敏方面。其主要優(yōu)點在于：特異性強，速度快，敏感性高；其缺點在于：非特異性染色問題尚未解感性高；其缺點在于：非特異性染色問題尚未解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也比較復決，結果判定的客觀性不足，技術程序也比較復雜。雜。1 1、原理、原理 熒光免疫技術是一種以熒光物質作為標記熒光免疫技術是一種以熒光物質作為標記物的免疫分析技術，熒光物質的分子在特定物的免疫分析技術，熒光物質的分子在特定條件下吸收激發(fā)光的能量后，分子呈激發(fā)態(tài)條件下吸收激發(fā)光的能量后，分子呈

6、激發(fā)態(tài)而極不穩(wěn)定，其迅速回到基態(tài)時，以電磁輻而極不穩(wěn)定，其迅速回到基態(tài)時，以電磁輻射形式釋放出所有的光能，發(fā)射出波長較照射形式釋放出所有的光能，發(fā)射出波長較照射光長的熒光。熒光免疫技術可分為熒光免射光長的熒光。熒光免疫技術可分為熒光免疫組織化學技術和熒光測定技術。熒光抗體疫組織化學技術和熒光測定技術。熒光抗體技術屬于前者，它是利用某些熒光素通過化技術屬于前者，它是利用某些熒光素通過化學方法與特異性抗體結合，形成的免疫復合學方法與特異性抗體結合，形成的免疫復合物在一定波長光的激發(fā)下可產生熒光，因此物在一定波長光的激發(fā)下可產生熒光，因此借助熒光顯微鏡檢測或定位被檢抗原。其又借助熒光顯微鏡檢測或定位

7、被檢抗原。其又可分為直接熒光抗體法、間接熒光抗體法和可分為直接熒光抗體法、間接熒光抗體法和補體熒光抗體法。補體熒光抗體法。熒光色素o 異硫氰酸熒光素（FITC）o 四乙基羅丹明（RB200）o 四甲基異硫氰酸羅丹明（TMRITC)1、熒光抗體染色方法、熒光抗體染色方法 直接法直接法 間接法間接法2、熒光抗體技術的應用、熒光抗體技術的應用 在細菌學診斷中的應用在細菌學診斷中的應用 在病毒感染診斷中的應用在病毒感染診斷中的應用 其它方面的應用其它方面的應用間接熒光抗體法（IFAT）操作步驟如下：（1）單層血細胞滴片，室溫晾干，放入丙酮中固定10min。室溫晾干。（2）以小白鼠抗血清（或雜交瘤細胞上

8、清液）為第一抗體，加在血細胞抗原上。37濕盒中孵育45min。（3）0.01M PBS洗三次，每次5min。（4）加第二抗體IgG-FITC ，37濕盒中孵育45min。（5）0.01M PBS洗三次，每次5min。（6）甘油封片，熒光鏡下觀察，拍照。間接免疫熒光法檢測對蝦白斑癥病毒病間接免疫熒光法檢測對蝦白斑癥病毒病間接免疫熒光法檢測淋巴囊腫病毒間接免疫熒光法檢測淋巴囊腫病毒直接ELISA間接ELISA間接酶聯(lián)免疫吸附試驗間接酶聯(lián)免疫吸附試驗操作步驟如下：操作步驟如下：（1 1）分別以不同單抗為第一抗體，加在血細胞抗原上。）分別以不同單抗為第一抗體，加在血細胞抗原上。3737濕盒中孵育濕盒中

9、孵育60min60min。（2 2）0.01M PBS0.01M PBS洗三次，每次洗三次，每次5min5min。（3 3）加）加AP-IgG AP-IgG 為第二抗體，為第二抗體，3737濕盒中孵育濕盒中孵育45min45min。（4 4）0.01M PBS0.01M PBS洗三次，每次洗三次，每次5min5min。（5 5）加）加NBT/BCIPNBT/BCIP底物緩沖液發(fā)色底物緩沖液發(fā)色10min10min，（6 6）出現(xiàn)顏色加終止液終止反應。）出現(xiàn)顏色加終止液終止反應。 （7 7）用酶標分析儀在）用酶標分析儀在405nm,405nm,處測定各孔的吸光度，計算處測定各孔的吸光度，計算P

10、PN N（樣品光吸收值（樣品光吸收值與陰性對照的值），判定與陰性對照的值），判定ELISAELISA反應結果。大于反應結果。大于2.12.1時可判斷為陽性。時可判斷為陽性。以最大顯色至陽性的顯色孔以最大顯色至陽性的顯色孔50%50%反應孔的抗體稀釋倍數為抗體效價反應孔的抗體稀釋倍數為抗體效價。 圖 DOT BLOT方法篩選結果圖。免疫組織化學方法定扇貝血細胞分布細胞免疫化學法檢測病毒感染四、四、Western blot 是蛋白水平檢測，研究基因表達與功能的一種方法是蛋白水平檢測，研究基因表達與功能的一種方法。 原理及步驟原理及步驟 樣品樣品 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離

11、蛋白 （SDS-PAGE ) 轉移（印跡）于硝酸纖維素膜轉移（印跡）于硝酸纖維素膜 加抗體檢測某種特異性蛋白質加抗體檢測某種特異性蛋白質West Blot 圖：淋巴囊腫病毒與抗血清的Western blotting結果免疫電鏡技術免疫電鏡技術（免疫電鏡技術（immune electron microscopic techniqueimmune electron microscopic technique）是一種將免疫學技術與電子顯微鏡技術相結合的血清學方是一種將免疫學技術與電子顯微鏡技術相結合的血清學方法，能使抗原在分子水平上進行定位。它實際上是將細胞法，能使抗原在分子水平上進行定位。它實際上

12、是將細胞水平的熒光抗體技術的基本原理應用于分子水平上。這一水平的熒光抗體技術的基本原理應用于分子水平上。這一技術的發(fā)明使抗原和抗體的定位研究達到了亞細胞或分子技術的發(fā)明使抗原和抗體的定位研究達到了亞細胞或分子水平。主要有以下幾種技術。水平。主要有以下幾種技術。鐵蛋白抗體法鐵蛋白抗體法酶標記抗體法酶標記抗體法重金屬標記抗體法重金屬標記抗體法圖 膠體金標記免疫電鏡結果(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm膠體金免疫技術o 膠體金是氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸等作用下的水溶液，具有高電子密度，并能與多種大分子發(fā)生物理吸附，因此，不但所有的大分子物質都可

13、被金標記，而且標記后大分子物質活性不發(fā)生改變。o 當抗原和金標抗體反應時，肉眼可見紅色或粉紅色斑條（點）,在顯微鏡下觀察，抗原抗體結合處為黑褐色的顆粒。 o 斑點免疫金滲濾法（斑點免疫金滲濾法（DIGFA）的應用）的應用 與研究進展與研究進展 是是20世紀八十年代發(fā)展起來的一種免疫學檢世紀八十年代發(fā)展起來的一種免疫學檢 測方法，具有簡便、快速、準確等優(yōu)點。目前在測方法，具有簡便、快速、準確等優(yōu)點。目前在 醫(yī)學檢驗中主要應用于檢測醫(yī)學檢驗中主要應用于檢測 HBsAg、HCG 和和HIV等。等。斑點免疫金滲濾法原理斑點免疫金滲濾法原理： NCM為固相載體-通過滲濾-抗原與抗體在膜上快速反應-標記的

14、膠體金堆積顯色。膠體金膠體金抗體抗體抗原抗原NCM吸水墊吸水墊 臨床應用：臨床應用：v 間接法測抗體：間接法測抗體： NCM 抗原-樣品抗體-金標抗抗體顯色v 夾心法測抗原夾心法測抗原： NCM多抗-樣品抗原-金標單抗顯色。 直接法檢測抗原直接法檢測抗原 NCM病毒病毒-金標單抗顯色金標單抗顯色 DIGFA步驟簡化、時間縮短。 v DIGFA檢測操作程序檢測操作程序o2l檢測樣品-NCM-直徑2mm點-晾干； 100l封閉液，滲入； 100l的金標抗體，滲入；o100l 的0.01M PBS-T（含0.05%Tween-20），滲入； 檢測結果：紅色斑點的為陽性，無紅色斑點的為陰紅色斑點的為陽

15、性，無紅色斑點的為陰性性。 陽性代表檢測樣品中有病毒，陰性則無。 DIGFA檢測結果檢測結果, 紅色斑點的為病毒陽性紅色斑點的為病毒陽性,無紅色斑點的為病毒陰性。無紅色斑點的為病毒陰性。The result of DIGFA, red dot shows there is WSSV, otherwise, there is no WSSV. 免疫金標層析法的應用與研究進展免疫金標層析法的應用與研究進展 o 檢測試紙的原理是：采用夾心免疫層析原理，即由檢測試紙的原理是：采用夾心免疫層析原理，即由金標單抗同檢測樣品液中的抗原反應，形成由金標金標單抗同檢測樣品液中的抗原反應，形成由金標單抗單抗-抗原

16、復合物，當該復合物層析至硝酸纖維素抗原復合物，當該復合物層析至硝酸纖維素膜上預先包被在檢測線上的另一種單抗處時，此處膜上預先包被在檢測線上的另一種單抗處時，此處的抗體會識別該復合物中抗原，反應的結果便形成的抗體會識別該復合物中抗原，反應的結果便形成了金標單抗了金標單抗+抗原抗原+包被單抗的夾心結構，最終是包被單抗的夾心結構，最終是金標單抗上的膠體金顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼金標單抗上的膠體金顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼可見的紅色線，未反應的金標單抗則仍繼續(xù)層析前可見的紅色線，未反應的金標單抗則仍繼續(xù)層析前行行,當到達點預先包被在質控線羊抗鼠抗體處時，金當到達點預先包被在質控線羊抗鼠抗體處時，金標

17、單抗被其結合住，從而在此處也出現(xiàn)由膠體金顆標單抗被其結合住，從而在此處也出現(xiàn)由膠體金顆粒固定并累積而顯現(xiàn)出肉眼可見的紅色線，結果是粒固定并累積而顯現(xiàn)出肉眼可見的紅色線，結果是：檢測線顯示紅色表示樣品陽性；檢測線不顯示紅：檢測線顯示紅色表示樣品陽性；檢測線不顯示紅色，表示樣品陰性。質控線顯示紅色，表示試紙有色，表示樣品陰性。質控線顯示紅色，表示試紙有效；質控線處不顯示紅色，說明試紙失效，即或是效；質控線處不顯示紅色，說明試紙失效，即或是金標單抗、或是羊抗鼠抗體失活，檢測結果無效。金標單抗、或是羊抗鼠抗體失活，檢測結果無效。該試紙條構成:載體板7；在該載體板7的兩端部，分別設有加樣端4吸水層和手持

18、端1吸水層；在該載體板7中部段設有硝酸纖維膜的檢測層2，在該檢測層2與加樣端4吸水層交界處，設有載有金標單抗E的玻璃纖維層塊3，該層塊3一端部分設置在加樣端4吸水層之下，其另一端部分設置在檢測層2之上；在與該層塊3延續(xù)的檢測層2上設有檢測線6和質控線5，該檢測線6和質控線5處分別包被有抗病毒單抗和羊抗鼠IgG。 用吖啶酯直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相應的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產生的光子能，這部分

19、光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。 直接化學發(fā)光免疫分析發(fā)光Y YY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后（1）加入H2O2（pH10）直接化學發(fā)光的機理磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點 已結合的抗原和抗體與未結合部分的易分離磁微粒技術五、聚合酶鏈反應（五、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR） o PCR是模擬體內是模擬體內DNA復制復制條件，應用條件，應用DNA聚合酶反聚合酶反應，特異性擴增某一應，特異性擴增某一DNA片段的技術。體外程序化

20、片段的技術。體外程序化的的DNA合成技術。合成技術。PCRACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3 : Extension 延伸72CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaq PolymeraseTaq PolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA原原 理：理：1) 合成待擴增區(qū)域兩端已知序列，與模板合成待擴增區(qū)域兩端已知序列，與模板DNA互互補的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴增補的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴增片段的長度；片段的長度；2) 反應體系：反應體系：DNA模板，模板，dNTP，Taq DNA聚聚合酶，合酶，buffer3) 反應程序：反應程序： 變性變性 ( 9495oC) 復性復性 延伸延伸 ( 3755 oC) ( 7072 oC ) 72 oC延伸延伸10min 30-35cycles DNA擴增擴增100萬倍萬倍P