第十八章高效液相色譜法

1、一、教學內容一、教學內容1. 高效液相色譜的類型2. 固定相和流動相及其選擇3. 高效液相色譜儀的組成和各部件的作用4. 定性和定量分析方法二、重點與難點二、重點與難點1. 高效液相色譜與氣相色譜的異同點2. 高效液相色譜速率理論方程式在實驗條件優(yōu)化中的應用3. 固定相和流動相的選擇4. 不同種類高效液相色譜分離的原理上的差異 三、教學目標三、教學目標了解高效液相色譜儀的組成熟練掌握高效液相色譜中的反相和正相色譜的分離原理和 實驗條件3. 掌握化學鍵合相固定相和流動相及其選擇4. 速率理論方程式在高效液相色譜法的應用5. 掌握高效液相色譜分離分析中的定性和定量方法 高效液相色譜法： 一種用液體

2、為流動相的色譜分離分析方法。它在經典色譜理論的基礎上，采用了高壓泵、化學鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測器等新實驗技術建立的一種液相色譜分析法。 高壓：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高靈敏：10-9g （紫外檢測）、10-12g （熒光檢測）經典液相色譜法與高效液相色譜法的比較經典液相色譜法高效液相色譜法 常壓或減壓 填料顆粒大 柱效低 分析速度慢 色譜柱只用一次 不能在線檢測 高壓，4050MPa 填料顆粒小，250m 柱效高,4000060000塊/m 分析速度快 色譜柱可重復多次使用 能在線檢測氣相色譜與高效液相色譜的比較 氣相色譜高效液相色譜不能用于熱

3、不穩(wěn)定性物質的分析高溫（程序升溫）有很靈敏的檢測器如ECD和較靈敏的通用檢測器（FID和TCD）流動相為氣體，無毒運行和操作容易 可以用于熱不穩(wěn)定物質的分析 室溫 沒有較高靈敏的通用檢測器 流動相有毒，可供選擇范圍寬 （梯度洗脫） 運行和操作比GC難一些 特點： 具有分離效率高 選擇性好 分析速度快 檢測靈敏度高 應用范圍廣 流動相選擇范圍寬 柱后流出組分不被破壞，易制備 第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型 及其固定相和流動相 一、主要類型一、主要類型 1.固定相的聚集狀態(tài)固定相的聚集狀態(tài) 液液色譜法（液液色譜法（LLC）和液固色譜法（）和液固色譜法（LSC） 2.分離機制：分離機制： 分配色譜

4、法分配色譜法 吸附色譜法吸附色譜法 離子交換色譜法離子交換色譜法（IEC） 空間排阻色譜法（空間排阻色譜法（SEC）3.其他色譜類型其他色譜類型親合色譜法（親合色譜法（AC） 手性色譜法（手性色譜法（CC）膠束色譜法（膠束色譜法（MC） 電色譜法（電色譜法（EC）化學鍵合相色譜法化學鍵合相色譜法 固定相應符合下列要求：固定相應符合下列要求： 顆粒細且均勻；傳質快；機械強度高，能耐高壓； 化學穩(wěn)定性好，不與流動相發(fā)生化學反應。二、固定相二、固定相( (一一) )化學鍵合相色譜法化學鍵合相色譜法（鍵合相色譜法） 化學鍵合相色譜法以化學鍵合相為固定相的色譜法。根據化學鍵合相與流動相極性的相對強弱根據

5、化學鍵合相與流動相極性的相對強弱 正相和反相鍵合相色譜法正相和反相鍵合相色譜法 l 化學化學鍵合相鍵合相：采用化學反應的方法將官能團鍵合在載體表面所形成的固定相 。1.鍵合反應硅氧烷（SiOSiC）型：氯硅烷與硅膠進行硅烷化反應 硅氧碳鍵型：硅氧碳鍵型： SiOC 化學鍵合相形成具備的條件化學鍵合相形成具備的條件 2.固定液應有與載體表面發(fā)生化學反應的官能團1.載體表面應有某種活性基團2.鍵合相的種類 （1）非極性鍵合相非極性鍵合相 ：非極性烴基，如C18C8C1與苯基等鍵合在硅膠表面； 用于反相色譜；ODS（2）極性鍵合相：）極性鍵合相：常用-NH2、-CN鍵合相（氰乙硅烷基Si(CH2)2

6、CN)鍵合硅膠 一般用于正相色譜 （3）離子交換鍵合相：）離子交換鍵合相：常用-SO3H、 -COOH、 、-R3NCl3.鍵合相的性質含碳量：含碳的百分數 覆蓋度 ：已反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例 封尾（end-capping）：在鍵合反應后，用三甲基氯硅烷等進行鈍化處理，減少殘余硅醇基。 4.鍵合相的特點 使用過程中不流失； 化學穩(wěn)定性好； 柱效高，分離選擇性好； 適于梯度洗脫； 載樣量大 注意： 流動相的pH一般應在3-8，否則會引起硅膠溶解； (也有適用寬pH范圍的鍵合相)三、高效液相色譜法的流動相三、高效液相色譜法的流動相 對流動相的要求：1. 與固定相不發(fā)生化學反應。

7、2. 對試樣有適宜的溶解度。使k在110范圍內，3. 與檢測器相適應。例如用紫外檢測器時，選用截止波長小于檢測波長的溶劑。4. 純度高，粘度小。低粘度流動相如甲醇乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。 （一）流動相對分離的影響（一）流動相對分離的影響2211-4nkkR1. 溶劑的極性（強度） 正相色譜：溶劑極性越強，洗脫能力越強 反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強 2. 溶劑的選擇性 不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同 混合溶劑（二元或多元流動相）（二）流動相的強度和選擇性（二）流動相的強度和選擇性 多元混合溶劑的溶劑極性參數計算多元混合溶劑的溶劑極性參數計算 niiiPP1mix式中式

8、中i 為混合溶劑中各溶劑的體積百分數。為混合溶劑中各溶劑的體積百分數。 二元混合溶劑的則為二元混合溶劑的則為 PPPBAAAB 式中式中A， B分別為二元混合溶劑中溶劑分別為二元混合溶劑中溶劑A和溶劑和溶劑B的體積百分數。的體積百分數。溶劑的選擇性溶劑的選擇性 溶劑可分為八組而分別位于圖中不同區(qū)。溶劑可分為八組而分別位于圖中不同區(qū)。I組的組的xe值較大，值較大，屬質子受體溶劑；屬質子受體溶劑；VII組的組的xd值較大，屬質子給于體溶劑；值較大，屬質子給于體溶劑；V組的組的xn值較大，屬偶極作用力溶劑。同組溶劑在分離中具有相似的選值較大，屬偶極作用力溶劑。同組溶劑在分離中具有相似的選擇性，不同組

9、差別較大。擇性，不同組差別較大。溶劑的選擇性溶劑的選擇性多元混合溶劑的溶劑極性參數計算多元混合溶劑的溶劑極性參數計算 對于正相色譜，二元溶劑的極性參數對于正相色譜，二元溶劑的極性參數P 和組分的和組分的k值存在如下值存在如下關系：關系：2/ )(121210PPkk 式中分別為初始和調節(jié)后二元溶劑的極性參數。式中分別為初始和調節(jié)后二元溶劑的極性參數。k1、k2為組分為組分相應的容量因子。相應的容量因子。例例 在一反相色譜柱上，當流動相為在一反相色譜柱上，當流動相為30%甲醇和甲醇和70%水水(體積比體積比)時，某組分的保留時間為時，某組分的保留時間為25.6min，死時間為，死時間為0.35m

10、in，如何調節(jié)溶劑配比使組分容量因子為，如何調節(jié)溶劑配比使組分容量因子為5？解：初始值解：初始值1723503506251.k 78210700153001.P 2/ )7 . 8(2101 .725P27 . 816. 12P2 .10)1 (1 . 538. 6 = 0.75 即調整溶劑比例為即調整溶劑比例為75%甲醇和甲醇和25%水可使該組分的水可使該組分的k值為值為5。l 固定相固定相：極性鍵合相 如CN、NH2或二羥基鍵合硅膠流動相流動相：非極性或弱極性溶劑加極性調整劑l適用范圍：溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物 分離機制？分離機制？ 分配：把有機鍵合層作為一個液膜看待，溶

11、質在兩相的溶解 吸附：溶質與鍵合極性基團間的誘導、氫鍵和定向作用四、正相鍵合相色譜法四、正相鍵合相色譜法 組分的保留和分離組分的保留和分離 分離選擇性決定于鍵合相的種類、流動相的分離選擇性決定于鍵合相的種類、流動相的強度和試樣的性質強度和試樣的性質 流動相的極性增強，洗脫能力增加，使組分流動相的極性增強，洗脫能力增加，使組分k減小，減小，tR 減小。反之，減小。反之， k增大，增大，tR增大。增大。 極性強的組分極性強的組分k大，后洗脫出柱。大，后洗脫出柱。五、反相鍵合相色譜法五、反相鍵合相色譜法1. 固定相：非極性鍵合相固定相：非極性鍵合相 如十八烷基硅烷（如十八烷基硅烷（C18，ODS）、

12、辛烷基（）、辛烷基（C8）鍵合硅膠）鍵合硅膠 流動相：流動相：水水為基礎溶劑，加入一定量與水混溶的極性調整劑為基礎溶劑，加入一定量與水混溶的極性調整劑 常用甲醇水、乙腈水等常用甲醇水、乙腈水等應用：非極性至中等極性的組分，還有有機酸、堿及鹽等應用：非極性至中等極性的組分，還有有機酸、堿及鹽等 2. 保留機制：疏溶劑理論保留機制：疏溶劑理論溶質的保留主要是溶質分子與溶質的保留主要是溶質分子與極性溶劑分子間的極性溶劑分子間的排斥力排斥力，促，促使溶質分子與鍵合相的烴基發(fā)使溶質分子與鍵合相的烴基發(fā)生生疏水締合疏水締合。不是溶質分子與。不是溶質分子與鍵合相間的色散力。鍵合相間的色散力。3.保留行為的主

13、要影響因素保留行為的主要影響因素 （1）溶質的分子結構（極性） 極性越弱，疏水性越強，k越大，tR也越大。 同系物碳數越多，極性越弱，k越大； 引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。（2）固定相 鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增加，溶質的k也增大。 硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質的k越大。 （3）流動相）流動相 極性越強，洗脫能力越弱，使溶質的極性越強，洗脫能力越弱，使溶質的k越大越大 溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強溶劑溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強溶劑 溶劑比例：水的比例增加，使溶劑比例：水的比例增加，使k增大增大 中性鹽的加入：使中性溶質的中性鹽的加入：使中性溶質的k增大增大 pH：影響弱

14、酸、弱減的離解：影響弱酸、弱減的離解 流動相的流動相的pH降低，弱酸降低，弱酸k增大，增大，tR增大；弱堿增大；弱堿k變小。變小。1在正相色譜中，若適當增大流動相極性則（ ）。 A 樣品的k降低，tR降低 B 樣品的k增加，tR增加 C 相鄰組分的增加 D 對基本無影響2用ODS柱分析一有機弱酸混合物樣品，以某一比例甲醇一水為流動相時，樣品容量因子較小，若想使容量因子適當增加，較好的辦法是（ ）。 A 增加流動相中甲醇的比例 B 增加流動相中的水的比例 C 流動相中加人少量HAc D 流動相中加人少量的氨水用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調節(jié)流動相的pH，抑制有機弱酸、弱堿的離解，增加疏水締合作用

15、，使k變大。 離子抑制色譜法（離子抑制色譜法（ISC ） 適用于3pKa7的弱酸、7pKa8的弱堿 弱酸，降低流動相pH，k增大， tR增大 弱減，提高流動相pH，k增大，tR增大 把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（counter ion）生成中性離子對，增加溶質與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。 六、反相離子對色譜法（六、反相離子對色譜法（PIC） 用于分離可離子化和離子型的化合物用于分離可離子化和離子型的化合物l離子對模型離子對模型33+()+3s3(+固定相固定相+()+B)+B + H+BHRSO NaRSO + Na+BH RSORS

16、O)BH離子對mB+AB AmA(smBAmmmsmsBAAABABBABEK流動相流動相通式通式影響容量因子的因素影響容量因子的因素 1. 離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質的k增大；在一定范圍內試劑的濃度升高，溶質的k增大 2. 流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的k值最大3. 固定相 、流動相性質（同一般RP-HPLC）。 第二節(jié)第二節(jié) 高效液相色譜法分離條件的選擇高效液相色譜法分離條件的選擇 （一）（一）HPLC中的速率理論中的速率理論 渦流擴散A=2dp 球形、小粒度、均勻（RSD5%）固定相， 勻漿高壓填充，以降低A。縱向擴散=2Dm 可以忽

17、略。因為Dl很小，室溫操作，且U大于U最佳，傳質阻抗：固定相傳質阻抗CS可以忽略 ，因df極小 流動相傳質阻抗Cm m2PmmDdC要求： dp小，Dm大靜態(tài)流動相傳質阻抗： 由于部分流動相在固定相微孔內的滯留靜態(tài)流動相傳質阻抗系數Csm Csm dp2， Csm 1/Dm，而DmT/ 要求: 固定相dp2、 流動相都小H=A+Cmu+Csmu HPLC的實驗條件應該是：小粒度、均勻的球形化學鍵合相；低粘度流動相，流速不宜過快；柱溫適當。 （一）正相鍵合相色譜法的分離條件（一）正相鍵合相色譜法的分離條件 固定相：極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相等流動相：烷烴加適量極性調節(jié)劑（二）反相鍵合相色譜法的

18、分離條件（二）反相鍵合相色譜法的分離條件固定相：非極性鍵合相如ODS流動相：以水為基礎溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調節(jié)劑 弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制劑加入0.1%1%的醋酸鹽、磷酸鹽可減少殘余硅醇基的作用 二、分離條件二、分離條件的選擇的選擇（三）反相離子對色譜法的分離條件（三）反相離子對色譜法的分離條件 固定相 盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強的非極性鍵合相離子對試劑 離子對試劑所帶的電荷應與試樣離子的電荷相反 流動相pH使試樣組分與離子對試劑全部離子化有機溶劑及其濃度 同一般HPLC 第三節(jié)高效液相色譜儀進樣器餾分收集器記錄儀檢測器流程（1）高壓輸液泵）高壓輸液泵輸液泵應具備的性能：輸液

19、泵應具備的性能： 流量精度高且穩(wěn)定流量精度高且穩(wěn)定 流量范圍寬流量范圍寬 能在高壓下連續(xù)工作能在高壓下連續(xù)工作 液缸容積小液缸容積小 密封性能好，耐腐蝕密封性能好，耐腐蝕 恒流泵：在輸送流動相過程中流量恒定。恒流泵：在輸送流動相過程中流量恒定。 常用柱塞往復泵常用柱塞往復泵雙泵：為了克服流量的脈動。雙泵：為了克服流量的脈動。 有串聯式和并聯式有串聯式和并聯式輸液泵操作注意事項：輸液泵操作注意事項： 防止固體微粒進入泵體防止固體微粒進入泵體 流動相不應含有腐蝕性物質流動相不應含有腐蝕性物質 防止溶劑瓶內的流動相被用完防止溶劑瓶內的流動相被用完 不超過規(guī)定的最高壓力不超過規(guī)定的最高壓力 流動相一般

20、應該先脫氣流動相一般應該先脫氣 梯度淋洗（洗提、洗脫）梯度淋洗（洗提、洗脫） 分離過程中按一定程序連續(xù)改變載液中溶劑即流動相分離過程中按一定程序連續(xù)改變載液中溶劑即流動相的配比和極性以提高分離效果（類似的配比和極性以提高分離效果（類似GC中的程序升溫）中的程序升溫）高壓梯度和低壓梯度高壓梯度和低壓梯度高壓梯度低壓梯度二、分離和進樣系統(tǒng)二、分離和進樣系統(tǒng) 進樣器進樣閥（六通閥）、自動進樣裝置色譜柱色譜柱分析柱、制備柱分析柱、制備柱 性能評價性能評價 ：H、n、fs、k和和的重復性，或的重復性，或R。 柱效評價柱效評價1.1.硅膠柱：硅膠柱：樣品：苯、萘、聯苯及菲（己烷配制） 流動相：無水己烷2.

21、 反相色譜柱：反相色譜柱：樣品：尿嘧啶、硝基苯、萘及芴 流動相：甲醇-水（85：15） 或乙腈-水（60：40）3. 正相色譜柱：正相色譜柱：樣品：四氯乙烯、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇 流動相：正庚烷 色譜柱再生色譜柱再生1.反相色譜柱： 先以甲醇-水（95：5）、甲醇、一氯甲烷為流動相依次沖洗，再以相反順序依次洗脫。 2.正相色譜柱： 先以正己烷、異丙醇、一氯甲烷及甲醇為流動相依次沖洗，再以相反順序依次洗脫。三、檢測系統(tǒng)三、檢測系統(tǒng)（一）檢測器（一）檢測器(detector)的主要性能的主要性能要求：要求： 靈敏度高（檢測限低） 噪音低 線性范圍寬 重復性好 適用范圍廣（通

22、用型、專屬型） （二）紫外檢測器（二）紫外檢測器檢測原理： 朗伯比爾 (Lambert-Beer) 定律，響應信號（吸光度）與濃度成正比 A=Cl 特點： 靈敏度較高（10-610-9 g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應用廣（分析、制備）。局限： 只能檢測有紫外吸收的物質，流動相的截止波長應小于檢測波長。 紫外檢測器紫外檢測器固定波長檢測器 ：254nm可變波長檢測器：光源：氘燈（和鎢燈）， 200400（800）nm， 單色器，流通池（試樣），光電管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計相似 光電二極管陣列檢測器 (photodiode array detector；PDA

23、D)：一系列光電二極管，一個二極管對應接受光譜上約1nm譜帶寬的單色光 紫外檢測器紫外檢測器 光電二極管陣列檢測器工作原理：復光通過流通池，再進入單色器，分光后照射在二極管陣列裝置上，同時獲得各波長的信號強度，即獲得組分的吸收光譜。獲得三維光譜色譜圖。用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量,判斷峰純度。 （三）熒光檢測器（三）熒光檢測器(FD)檢測原理：化合物受紫外光激發(fā)后，發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的光，稱為熒光 熒光強度 (F) 與激發(fā)光強度 (I0) 及熒光物質濃度 (C) 之間的關系為： F=2.3QKI0Cl Q為量子產率，K為熒光效率，為摩爾吸光系數，l為光徑長度。 F=KC

24、 特點：選擇性好，專屬型檢測器 靈敏度比紫外檢測器高（檢測限10-10 g/ml）激發(fā)波長(ex)和發(fā)射波長(em)的選擇第四節(jié)第四節(jié) 高效液相色譜分析方法高效液相色譜分析方法 l定性分析方法定性分析方法l定量分析方法：定量分析方法：l外標法、內標法外標法、內標法同同GC（自己看）（自己看）1. 計算在某色譜條件下，分析只含有二氯乙烷，二溴乙烷及四乙基鉛三組分的樣品，結果如下： 二氯乙烷 二溴乙烷 四乙基鉛相對質量校正因子 1.00 1.65 1.75峰面積cm 2 1.50 1.01 2.82(1)試求各組分的百分含量。 上述色譜分析采用了何種定量方法? 該定量方法有何優(yōu)點和局限性? 2.已

25、知物質A和B在一根30.00 cm長的柱上的保留時間分別為16.40 min和17.63 min。不被保留組分通過該柱的時間為1.30 min。峰底寬度分別為1.11 min和1.21 min，計算：（1）柱的分離度；（2）柱的平均塔板數（3）達到1.5分離度所需的柱長度。二、二、 分離類型選擇分離類型選擇分析實例：分析實例：環(huán)境中有機氯農藥殘留量分析環(huán)境中有機氯農藥殘留量分析 可對水果、蔬菜中的農藥殘留量進行分析。 固定相：薄殼型硅膠(37 50m) 流動相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色譜柱：50cm2.5mm(內徑) 檢測器：示差折光檢測器 稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴的分析 稠環(huán)芳

26、烴多為致癌物質。 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：20%甲醇-水 100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 C 柱 壓：70 104 Pa 檢測器：紫外檢測器血漿分析血漿分析2.已知物質A和B在一根30.00 cm長的柱上的保留時間分別為16.40 min和17.63 min。不被保留組分通過該柱的時間為1.30 min。峰底寬度分別為1.11 min和1.21 min，計算：（1）柱的分離度；（2）柱的平均塔板數（3）達到1.5分離度所需的柱長度。主要內容1.化學鍵合相色譜法的原理： 反相鍵合相色譜法 反相離子對色譜法 正相鍵合相色譜法2.化學鍵合相色譜法的固定相、流動相3.化學鍵合相色譜法的分離條件4.高效液相色譜中的速率理論5.定量分析方法6.紫外、熒光檢測器1HPLC與GC的比較，可忽略縱向擴散項，這主要