第六章分子生物學研究法

1、第六章分子生物學研究法(下)基因功能研究技術隨著越來越多的基因組序列相繼被測定，人類對生物本質的認識已經發(fā)生了重大變化。但是，海量序列信息也向我們提出了新的挑戰(zhàn)。如何開發(fā)利用這些序列信息，如何通過生物化學、分子生物學等方法研究基因的功能，從而進一步了解生物體內各種生理過程，了解生物體生長發(fā)育的調節(jié)機制，了解疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，給出控制、減緩甚至完全消除人類遺傳疾病，是新時期生物學家所面臨的主要問題。轉錄組測序技術、原位雜交技術、基因芯片技術為研究單個或多個基因在生物體某些特定發(fā)育階段或在不同環(huán)境條件下的表達模式提供了強有力的手段。用基因定點突變(site-directedmutagenesi

2、s)技術、基因敲除技術、RNAi技術可以全部或部分抑制基因的表達，通過觀察靶基因缺失后生物體的表型變化研究基因功能。酵母單雜交、雙雜交技術，四分體技術等都是研究蛋白質相互作用、蛋白質-DNA相互作用等的重要手段。隨著分子生物學技術的發(fā)展，研究者可以在活細胞內和細胞外研究蛋白質之間的相互作用，為認識信號轉導通路、蛋白質翻譯后修飾加工等提供了豐富的技術支持。本章將主要介紹研究基因功能的各種分子生物學技術和方法。矚慫潤厲釤瘞睞櫪廡賴賃軔朧。6.1基因表達研究技術6.1.1轉錄組測序6.1.1轉錄組分析和RNA-Seq轉錄組(transcriptome)，廣義上指在某一特定生理條件或環(huán)境下，一個細胞、

3、組織或者生物體中所有RNA的總和，包括信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉運RNA(tRNA)及非編碼RNA(non-codingRNA或sRNA)；狹義上特指細胞中轉錄出來的所有mRNA的總和。基因組一轉錄組一蛋白質組(genometranscriptomeproteome)是中心法則在組學框架下的主要表現(xiàn)形式。通過特定生理條件下細胞內的mRNA豐度來描述基因表達水平并外推到最終蛋白質產物的豐度是目前基因表達研究的基本思路。聞創(chuàng)溝燴鐺險愛氌譴凈禍測樅。轉錄組研究的基本方法包括基因芯片技術(genechip)和轉錄組測序技術。我們將在6.4節(jié)詳細敘述基因芯片技術，這里主要討論轉

4、錄組測序技術的原理和應用。殘騖樓諍錈瀨濟溆塹籟婭驟東?；趥鹘y(tǒng)的Sanger測序法對轉錄組進行研究的方法主要包括：表達序列標簽(expressedsequeneetag,EST)測序技術，基因表達系列分析技術(serialanalysisofexpression,SAGE)。EST測序數據是目前數量最多，涉及物種最廣的轉錄組數據，但測序讀長較短(每個轉錄本測定4OObp500bp),測序通量小，測序成本較高，而且無法通過測序同時得到基因表達豐度的信息。有人使用SAGE測序法，將不同轉錄本3'端第一個CATG位點下游14bp長的短標簽序列來標識相應的轉錄本。由于標簽序列較短，可以將多個標

5、簽串聯(lián)測序，使SAGE法相對于EST測序在通量上大大提高。但過短的序列標簽使得序列唯一性降低，即使改進過的LongSAGE用21bp標簽測序，仍然有約一半的標簽無法被準確注釋到基因組上。釅錒極額閉鎮(zhèn)檜豬訣錐顧葒鈀。高通量測序技術(high-throughputsequencing),又名二代測序(second-generationsequencing)或深度測序(deepsequencing),可以一次性測序幾十萬甚至幾百萬條序列，是傳統(tǒng)測序技術的一次革命。主要有Roche公司研發(fā)的454測序平臺和川umina公司的Solexa測序平臺(表6-1)。彈貿攝爾霽斃攬磚鹵廡詒爾膚。表6-1454和

6、川umina高通量測序平臺比較454Illumina讀取長度(bp)約70050150單次測序數據量700Mb600Gb23小時較咼714天低雖然都是基于邊合成邊測序(sequencingbysynthesis,SBS)”，但是454和川umina的實現(xiàn)方法有很大的不同。454系統(tǒng)采用焦磷酸測序(pyrosequencing)原理，如圖6-1a所示，在DNA聚合酶的作用下，按照T、A、C、G順序加入的單個dNTP與模板的下一個堿基配對，同時釋放一個分子的焦磷酸(PPi)，在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和腺苷酰硫酸(adenosine-5'-phosphosulfate,APS)結合形

7、成ATP，在螢光素酶的催化下，ATP和螢光素結合形成氧化螢光素，產生可見光，被CCD捕捉。而lllumina系統(tǒng)(圖6-1b)采用帶有螢光標記的dNTP，其3'羥基末端帶有可被化學切割的部分，每個循環(huán)反應只允許摻入一個堿基，由激光掃描反應板表面，讀出這一輪反應新加的螢光信號，從而判定堿基種類。之后，經過化學切割恢復3'端粘性，進行下一輪聚合反應。從上述描述中不難看出，隨著反應的進行，已有螢光信號會使新的熒光難以準確分辨，因此該方法的測序讀長較短，測序錯誤主要是堿基替換。而454則由于缺少終止反應的元件，相同堿基的連續(xù)摻入常會帶來插入一缺失”類型的測序錯誤。謀蕎摶篋飆鐸懟類蔣薔點

8、鉍雜。利用高通量測序技術對轉錄組進行測序分析，對測序得到的大量原始讀長(reads)進行過濾、組裝及生物信息學分析的過程被稱為RNA-Seq。對于有參考基因組序列的物種，需要根據參考序列進行組裝(refereneeassembly),對于沒有參考序列的，需要進行從頭組裝(denovoassembly),利用大量讀長之間重疊覆蓋和成對讀長(pair-endreads)的相對位置關系，組裝得到盡可能完整的轉錄本，并以單位長度轉錄本上覆蓋的讀長數目(readsperkilo-basegenepermillionbases,RPKM)作為衡量基因表達水平的標準(圖6-2)。在實際組裝過程中，圖中紅色標

9、示區(qū)域覆蓋度過低，且讀長缺乏相對位置信息的區(qū)域，其可信度較低，應當剔除，保留兩側序列。廈礴懇蹣駢時盡繼價騷巹癩龔?，F(xiàn)以棉花轉錄組學數據為例，簡單分析不同組織或纖維不同發(fā)育時期基因表達情況(表6-2)。lllumina平臺測序得到26.86Gb數據，經過從頭組裝總共獲得了42,773條非重復序列，平均長度1,054堿基。每個不同組織中分別有23,265至26,427個獨立轉錄本。轉錄組數據不但能用來分析不同組織中獨立轉錄本數量，還被用于分析特定轉錄本在某個組織中的表達強度(表6-3)。RNA-Seq還可以用于轉錄本結構、轉錄本SNP檢測、非編碼區(qū)功能鑒定以及挖掘低豐度轉錄本等研究。煢楨廣鰳鯡選塊

10、網羈淚鍍齊鈞。表6-2陸地棉6個組織的RNA-Seq數據分析組織樣品讀長數堿基數Q201(%)N50獨立基因總數獨立基因長度(nt)開花后0天胚珠47907298359304735098.2282726427778開花后5天胚珠53022210397666575097.8684223520786花48049786360373395097.9982323265775葉54191238406434285097.5182025280776根79438254714944286091.6878623905753莖49713024447417216091.4678224088746總計3323218102

11、686140492013064277310541Q20，測序準確率達到99%。表6-3棉花組織特異性轉錄因子表達強度分析序列標識基因RPKM序列標識基因RPKM根莖根莖Unigene58528MYB-L81.860.16Unigene85367FAR10.4065.51Unigene58563B356.020.00Unigene29146HD-ZIP0.0044.49Unigene58582B353.660.29Unigene51008HB0.2443.60Unigene58458Dof45.540.00Unigene18073MIKC0.1336.74Unigene55872Dof41.56

12、0.00Unigene64521MYB0.1531.71Unigene51911bHLH36.640.19Unigene58698B30.0924.01Unigene58446NAC28.400.37Unigene62109MYB0.0418.45Unigene57837bHLH20.270.00Unigene52681bZIP0.2017.62Unigene58640S1Fa-L20.250.68Unigene64531G2-L0.3416.92Unigene55579B315.710.13Unigene64486bHLH0.0014.49轉錄組組裝過程中，同一個非重復序列上復蓋有來自根、莖

13、等不同組織的讀長，不同讀長數目通過歸一化轉變?yōu)镽PKM值，進而篩選得到組織特異表達的轉錄因子。鵝婭盡損鵪慘歷蘢鴛賴縈詰聾。6.1.2RNA的選擇性剪接技術RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點組合）從一個mRNA前體產生不同的mRNA剪接異構體的過程。一般將選擇性剪切分為如下幾類：平衡剪切、5'選擇性剪切、3'選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切（圖6-3）。一般用RT-PCR的方法研究一個基因是否存在選擇性剪切。首先以cDNA兩端特異引物或來自不同外顯子的引物序列在不同組織來源的RNA樣品中進行擴增，觀察PCR產物大小是否存在差異。一旦發(fā)現(xiàn)差異，即

14、可通過序列分析來判斷這種差異是否來自于選擇性剪切。圖6-4為擬南芥中發(fā)現(xiàn)的有選擇性剪切的5個轉錄調控因子基因的物理圖譜。選擇性剪接使一個基因翻譯為多種蛋白質序列，是基因表達多樣性的重要表現(xiàn)形式。分析人類基因組數據發(fā)現(xiàn)，有60%的基因在表達過程中可通過選擇性剪切產生各種形式的mRNA。最新的研究表明，果蠅的Dscam基因最多可能夠產生38，016種不同形式的剪切體（圖6-5）。由于選擇性剪切與細胞生理、發(fā)育調節(jié)以及腫瘤的發(fā)生、轉移等有密切關系，闡明基因的選擇性剪切機制是了解動植物個體發(fā)育和基因功能的重要環(huán)節(jié)。因此，發(fā)現(xiàn)新的可變剪切異構體，確定每個異構體的獨特功能和生物學意義并闡明其調節(jié)機制，是功

15、能基因組時代的一個重要特征。籟叢媽羥為贍債蟶練淨櫧撻曉。6.1.3原位雜交技術原位雜交（InSituHybridization,ISH）是用標記的核酸探針，經放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段，通常分為RNA原位雜交和染色體原位雜交兩大類。RNA原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標記的特異性探針與被固定的組織切片反應，若細胞中存在與探針互補的mRNA分子，兩者雜交產生雙鏈RNA，就可通過檢測放射性標記或經酶促免疫顯色，對該基因的表達產物在細胞水平上做出定性定量分析（圖6-6）。預頌圣鉉儐歲齦訝驊糴買闥齙。熒光原位雜交（

16、fluoresceneeinsituhybridization,FISH）技術首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置（圖6-7）。FISH技術不需要放射性同位素，實驗周期短，檢測靈敏度高，若用經過不同修飾的核苷酸分子標記不同的DNA探針，還可能在同一張切片上觀察幾種DNA探針的定位，得到相應位置和排列順序的綜合信息。滲釤嗆儼勻諤鱉調硯錦鋇絨鈔。6.1.4基因定點突變（site-directedmutagenesis）技術定點突變是重組DNA進化的基礎，該方法通過改變基因特定

17、位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，常用于研究某個（些）氨基酸殘基對蛋白質的結構、催化活性以及結合配體能力的影響，也可用于改造DNA調控元件特征序列，修飾表達載體，引入新的酶切位點等。由于迄今尚未建立能精確預測特定氨基酸殘基變化對整個蛋白結構及活性影響的模型，選擇氨基酸突變的位點存在一定的盲目性。因為即使知道了該蛋白的三維結構，人們仍然無法了解某個氨基酸殘基對其高級結構的影響。少數幾個氨基酸殘基的改變，有時根本不影響靶蛋白的功能，有時影響了靶蛋白的活性位點，有時還能從根本上改變整個蛋白的高級結構。所以，基因的定點突變是我們進一步了解蛋白質的結構與功能關系的重要手段。鐃誅臥瀉噦圣騁貺頂廡縫勵

18、羆。最早在20世紀70年代初進行小噬菌體X174單鏈基因組易突變位點圖譜分析工作時認識到基因定點突變的可能性。在人工成功合成寡聚核苷酸、獲得高品質DNA聚合酶和DNA連接酶的基礎上，科學家建立了體外寡核苷酸介導的DNA突變技術（圖6-8）。PCR技術的出現(xiàn)大大促進了定點突變技術的發(fā)展，簡化了實驗操作程序，提高了突變效率?？茖W家主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術和大引物誘變法，在基因序列中進行定點突變。擁締鳳襪備訊顎輪爛薔報贏無。圖6-9闡述了重疊延伸介導的定點誘變機制。首先將模板DNA分別與引物對1（正向誘變引物FM和反向引物R2）和2（正向引物F2和反向誘變引物RM）退火，通過PCR1和2

19、反應擴增出兩種靶基因片段。FMR2和RMF2片段在重疊區(qū)發(fā)生退火，用DNA聚合酶補平缺口，形成全長雙鏈DNA，進行PCR3擴增。最后，用引物F2和R2擴增出帶有突變位點的全長DNA片段（PCR4）。贓熱俁閫歲匱閶鄴鎵騷鯛漢鼉。大引物誘變法首先用正向突變引物（M）和反向引物（R1），擴增模板DNA產生雙鏈大引物（PCR1），與野生型DNA分子混合后退火并使之復性，第二輪PCR中加入正向引物（F2），與PCR1中產生的一條互補鏈配對，擴增產生帶有突變的雙鏈DNA（圖6-10）。由于F2的退火溫度顯著高于第一輪PCR所使用的引物M和R1，因此，可以忽略引物M和R1在本輪反應中所造成的干擾。獲得定點突

20、變PCR產物以后，一般需進行DNA序列分析以驗證突變位點。壇摶鄉(xiāng)囂懺蔞鍥鈴氈淚躋馱釣。與經典定點突變方法相比，PCR介導的定點突變方法具有明顯的優(yōu)勢：1、突變體回收率高，以至于有時不需要進行突變體篩選；2、能用雙鏈DNA作為模板，可以在任何位點引入突變；3、可在同一試管中完成所有反應；4、快速簡便，無需在噬菌體M13載體上進行分子克隆。所以，PCR介導的定點突變方法已成為定點突變的主要技術。蠟變黲癟報倀鉉錨鈰贅籜葦繯。6.2基因敲除技術6.2.1基本原理經典遺傳學（Forwardgenetics）是從一個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進而找出該基因的編碼序列。在后基因組時代，大規(guī)模基因功能的

21、研究正成為生命科學研究的熱點，現(xiàn)代遺傳學（Reversegenetics,反向遺傳學）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進而推導出該基因的功能?；蚯贸╣eneknock-out）又稱基因打靶，該技術通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組,進行精確的定點修飾和基因改造,具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點。買鯛鴯譖曇膚遙閆擷凄屆嬌擻。1985年，科學家利用同源重組將一段外源質粒pA31171入到人類染色體DNA3-珠蛋白位點，首次在哺乳動物細胞中進行基因打靶并獲得成功。目前,在胚胎干細胞中進行同源重組已經成為遺傳修飾基因組位點的常規(guī)技術。通過對這些基因敲除生物個體的表

22、型分析,鑒定或推測該基因的生物學功能。綾鏑鯛駕櫬鶘蹤韋轔糴飆鈧麥?；蚯贸譃橥耆蚯贸蜅l件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性,條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng),尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應用最為廣泛。驅躓髏彥浹綏譎飴憂錦諑瓊針。1完全基因敲除實驗中一般采用取代型或插入型載體（圖6-11）在ES細胞中根據正-負雙向選擇（positive-negativeselectio

23、n,PNS）原理（圖6-12）進行完全基因敲除實驗。正向選擇基因neo通常被插入載體靶DNA功能最關鍵的外顯子中，或通過同源重組法置換靶基因的功能區(qū)。neo基因有雙重作用，一方面形成靶位點的插入突變，同時可作為正向篩選標記。負向選擇基因HSV-tk（humansemianvirus-thymidinekinase）則被置于目的片段外側，含有該基因的重組細胞不能在選擇培養(yǎng)基上生長。如果細胞中發(fā)生了隨機重組，負向選擇基因就可能被整合到基因組中，導致細胞死亡。由于基因轉移的同源重組自然發(fā)生率極低，動物的重組概率約為10-210-5,植物的概率為10-410-5,即使采用雙向選擇法也很難保證一次就從眾

24、多細胞中篩選出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細胞，必須用PCR及Southern雜交等多種分子篩選技術驗證確實獲得了目的基因被敲除的細胞系。貓蠆驢繪燈鮒誅髏貺廡獻鵬縮。2條件型基因敲除對于許多有重要生理功能的基因來說，完全基因敲除往往導致胚胎死亡，有關該基因功能的研究便無法開展。而條件型基因敲除，特別是應用Cre/LoxP和FLP/FRT系統(tǒng)所開展的組織特異性敲除，由于其可調節(jié)性而受到科學家的重視。構建條件型基因敲除打靶載體時，常將正向選擇標記neor置于靶基因的內含子中，并在靶基因重要功能域兩側內含子中插入方向相同的LoxP位點（圖6-13）。當實驗中需要消除靶基因活性時，與帶有Cre重組酶基因

25、的ES細胞雜交，Cre重組酶就能把兩個LoxP位點中間的DNA片段切除，導致靶基因失活。標記基因兩側也常常帶有LoxP序列，因為許多時候即使標記基因位于內含子中也會阻斷靶基因的轉錄。一旦出現(xiàn)這種情況，可以用Cre重組酶表達質粒轉染中靶ES細胞，通過LoxP位點重組將neo抗性基因刪除。鍬籟饗逕瑣筆襖鷗婭薔嗚訝擯。以Cre/loxp系統(tǒng)為基礎，可以在動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基因進行遺傳修飾。利用控制Cre表達的啟動子活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導性的特征，人們常常通過設定誘導時間的方法對動物基因突變的時空特異性進行人為控制，以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。構

26、氽頑黌碩飩薺齦話騖門戲鷯。6.2.2高等動物基因敲除技術胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術基礎。真核生物基因敲除的技術路線主要包括構建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導入胚胎干細胞純系中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內源基因組中并得以表達，主要實驗流程及篩選步驟如圖6-14所示。輒嶧陽檉籪癤網儂號澩蠐鑭釃。利用Neo基因替換目的基因外顯子IV至外顯子VI區(qū)段，得到腸堿性磷酸酶（IntestinalAlkalinePhosphataseIAP）基因敲除的ES細胞，用顯微注射或電穿孔法將I

27、AP基因敲除的ES細胞注入早期胚胎的囊胚腔中，誘導胚胎分化，獲得嵌合體胚胎后與野生型純合體胚胎回交，獲得由ES細胞分化產生的IAP基因敲除小鼠，實驗證明，純合小鼠體內檢測不到IAP蛋白，而該基因的敲除導致小鼠變胖（圖6-15）。在條件型基因敲除實驗中，首先構建帶有S6基因的LoxP打靶載體的ES細胞，經過雜交篩選，獲得純合體小鼠；再與帶有肝組織特異性、受INF-a誘導的Mx-Cre轉基因小鼠雜交，刪除neo和外顯子3-5,得到肝組織特異性敲除S6基因小鼠后發(fā)現(xiàn)，3H胸腺嘧啶不能摻入S6基因敲除小鼠肝組織，細胞不能進入S期，不能正常分裂增殖（圖6-16）。堯側閆繭絳闕絢勵蜆贅瀝紕縭。一般來說,動

28、物基因敲除時用顯微注射胚胎干細胞命中率較高,技術難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低,但操作相對簡單易行。識饒鎂錕縊灩筧嚌儼淒儂減攙。因為同源重組常常發(fā)生在某一條染色體上,要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，至少需要兩代以上的遺傳。除了基因敲除法，還有人用基因捕獲的方法通過隨機插入突變破壞靶基因表達（圖6-17）?；虿东@載體包括一個無啟動子的報告基因（通常為neor基因），當該基因插入到ES細胞染色體某個部位，利用所在位點的轉錄調控元件得到表達時，該ES細胞就獲得在含G418的選擇性培養(yǎng)基上生長的能力?？赏ㄟ^分析標記基因側翼cDNA或染色體DNA序列來獲得靶基因的相關信息。凍鈹鋨勞臘鍇癇

29、婦脛糴鈹賄鶚。由于受整合位點附近染色質區(qū)的影響，轉基因整合具有顯著的位置效應，基因5'端啟動子和增強子區(qū)，3'端終止子區(qū)都會對轉基因的整合產生影響，這是某些打靶載體選擇組織特異性啟動子的原因之一。外源轉基因的有效表達有時還取決于其是否有內含子，因為內含子中存在的轉錄調控元件可影響mRNA的剪切以及啟動子與內含子間的相互作用。另外，內含子可能含有能開放染色體功能域的序列，還可能通過影響核質成分、位置等來影響基因表達強度。恥諤銪滅縈歡煬鞏鶩錦聰櫻鄶。除了研究基因功能之外，基因敲除技術還被廣泛應用于建立人類疾病的轉基因動物模型，為醫(yī)學研究提供遺傳學數據，為遺傳病的治療、為生物新品種的

30、培育奠定新基礎。鯊腎鑰詘褳鉀溈懼統(tǒng)庫搖飭緡。6.2.3植物基因敲除技術由于動植物細胞結構顯著不相同，植物細胞基因敲除常采用不同于動物細胞的策略。T-DNA插入失活技術是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。T-DNA插入失活就是利用根瘤農桿菌T-DNA介導轉化，將一段帶有報告基因的DNA序列標簽整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內部或附近，就會影響該基因的表達，從而使該基因“失活”。由于該基因內部或附近插入了一段已知序列的DNA，可據此設計引物，用PCR方法將被破壞的靶基因序列分離出來（圖6-18A）。若將靶基因（假定編碼區(qū)為900個堿基對）兩端的引物LP、RP及插入載體上的

31、引物LB加入同一反應體系中進行PCR,理論上能得到三種類型的條帶（圖6-18B）。野生型植株中，只有LP和RP引物配對擴增出來的靶基因條帶；如果實驗材料來自純合型基因敲除植株，那么，只有靶基因一端的引物可以與LB引物配對完成PCR擴增；如果實驗材料來自雜合型基因敲除植株，那么，PCR擴增后會同時出現(xiàn)兩種條帶。碩癘鄴頏謅攆檸攜驤蘞鷥膠據。T-DNA無專一整合位點，在植物基因組中發(fā)生隨機整合，所以，只要突變株的數目足夠大，從理論上就可能獲得任何一個功能基因都發(fā)生突變的基因敲除植物庫。擬南芥基因組冗余序列少，基因密度高，幾乎每一個DNA插入都會導致某個基因功能的喪失，結合已完成的擬南芥基因組信息，人

32、們很容易篩選到新的功能基因。已經用T-DNA插入失活方法建立了擬南芥大規(guī)?；蚯贸蛔凅w庫，研究人員可以方便地在多個數據庫中檢索到感興趣基因的突變體，再開展深入的表型分析和功能研究。閿擻輳嬪諫遷擇楨秘騖輛塤鵜。6.3蛋白質及RNA相互作用技術6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)（yeastone-hybridsystem）是上個世紀90年代中期發(fā)展起來的新技術，可識別穩(wěn)定結合于DNA上的蛋白質，可在酵母細胞內研究真核生物中DNA-蛋白質之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。此外，該體系也是分析鑒定細胞中轉錄調控因子與順式作用元件相互作用的有效方法。氬嚕躑竄

33、貿懇彈瀘頷澩紛釓鄧。酵母單雜交的基本原理如圖6-19所示，首先將已知的特定順式作用元件構建到最基本啟動子（minimalpromoter，Pmin）的上游，把報告基因連接到Pmin下游。然后，將編碼待測轉錄因子cDNA與已知酵母轉錄激活結構域（transcriptionactivationdomain,AD）融合表達載體導入酵母細胞，該基因產物如果能夠與順式作用元件相結合，就能激活Pmin啟動子，使報告基因得到表達。釷鵒資贏車贖孫滅獅贅慶獷緞。目前，酵母單雜交體系主要被用于確定某個DNA分子與某個蛋白質之間是否存在相互作用，用于分離編碼結合于特定順式調控元件或其他DNA位點的功能蛋白編碼基因，

34、驗證反式轉錄調控因子的DNA結合結構域，準確定位參與特定蛋白質結合的核苷酸序列。由于該方法的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細胞中含量極低且用生化手段難以純化的那部分轉錄調控因子。常用的酵母單雜交體系基本選用HIS3或LacZ作為報告基因，雖然有的體系將帶有報告基因的載體直接整合于酵母染色體上，在大部分的實驗中報告基因都位于質粒DNA上。圖6-20是利用酵母單雜交體系和已知的順式作用元件DRE從擬南芥cDNA文庫中篩選轉錄調控因子的基本流程。實驗中如果將不同的未知基因與酵母GAL4的DNA結合結構域相融合，通過檢測位于GAL4順式作用元件下游的報告基因的表達狀況，還可以鑒定出該轉錄因子是否具

35、有轉錄激活功能。慫闡譜鯪逕導嘯畫長涼馴鴇撟。6.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeasttwo-hybridsystem）該體系巧妙地利用真核生物轉錄調控因子的組件式結構（modular）特征，因為這些蛋白往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成，其中DNA結合結構域（bindingdomain，BD）和轉錄激活結構域AD是轉錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。單獨的BD能與特定基因的啟動區(qū)結合，但不能激活基因的轉錄，而由不同轉錄調控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉錄的功能。實驗中，首先運用基因重組技術把編碼已知蛋白的DNA序列連接到帶有酵母轉錄調控因子（常為GAL1、GAL4或GCN1）DNA

36、結合結構域編碼區(qū)（BD）的表達載體上。導入酵母細胞中使之表達帶有DNA結合結構域的雜合蛋白，與報告基因上游的啟動調控區(qū)相結合，準備作為“誘餌”捕獲與已知蛋白相互作用的基因產物。此時，若將已知的編碼轉錄激活結構域（AD）的DNA分別與待篩選的cDNA文庫中不同插入片段相連接，獲得“獵物”載體，轉化含有“誘餌”的酵母細胞。一旦酵母細胞中表達的“誘餌”蛋白與“獵物”載體中表達的某個蛋白質發(fā)生相互作用，不同轉錄調控因子的AD和BD結構域就會被牽引靠攏，激活報告基因表達。分離有報告基因活性的酵母細胞，得到所需要的“獵物”載體，就能得到與已知蛋白相互作用的新基因（圖6-21）。諺辭調擔鈧諂動禪瀉類謹覡鸞。

37、6.3.3蛋白質相互作用技術1、等離子表面共振技術該技術是將誘餌蛋白結合于葡聚糖表面，將葡聚糖層固定于納米級厚度的金屬膜表面。當有蛋白質混合物經過時，如果有蛋白質同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結合將使金屬膜表面的折射率上升，從而導致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質濃度成線性關系，由此可以檢測蛋白質之間的相互作用（圖6-22）。該技術不需要標記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點是需要專門的等離子表面共振檢測儀器。嘰覲詿縲鐋囁偽純鉿錈癱懇跡。圖6-23應用SPR技術研究COI1蛋白與JAZ1蛋白之間的相互作用。研究人員首先在葡聚糖芯片表面固定1000共振單位的茉莉酸（

38、JA）信號通路負調控因子JAZ1蛋白，當體系中同時有茉莉酸異亮氨酸（JA-lle）及COI蛋白存在時，可以檢測到最高達380共振單位的SPR反應信號。加入一種在結構和功能上與茉莉酸甲脂（MeJA）非常相似的名為冠毒素（COR）的細菌毒素，也能使COl1和JAZ1發(fā)生相互作用。熒紿譏鉦鏌觶鷹緇機庫圓鍰緘。2、免疫共沉淀技術（Co-lmmunoPrecipitation，ColP）該技術的核心是通過抗體來特異性識別候選蛋白。首先，將靶蛋白的抗體通過親和反應連接到固體基質上，再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法在固體基質和抗體的共同作用下將蛋白復合物沉淀

39、到試管的底部或微膜上。如果靶蛋白質與待篩選蛋白發(fā)生了相互作用，那么，這個待篩選蛋白質就通過靶蛋白與抗體和固體基質相互作用而被分離出來（圖6-24）。鶼漬螻偉閱劍鯫腎邏蘞闋簣擇。免疫共沉淀實驗中常用pGADT7和pGBKT7質粒載體分別以融合蛋白形式表達靶蛋白，體外轉錄、翻譯后將產物混合溫育，分別用Myc或HA抗體沉淀混合物，過柱后再用SDSPAGE電泳分離，檢測兩個靶蛋白之間是否存在相互作用（圖6-25）。實驗表明，棉花乙烯合成酶基因ACS2與鈣離子依賴性蛋白激酶CDPK1之間存在相互作用，而該蛋白與CDPK32及CRK5沒有發(fā)生相互作用。ACO1與這三個蛋白都沒有發(fā)生相互作用（圖6-26）。紂憂蔣氳頑薟驅藥憫騖覲僨鴛。3、GST及GAD融合蛋白沉降技術