第六章熱原的去除及驗證

1、熱原的去除及驗證熱原(Pyrogens)是微生的代謝產(chǎn)物。大多數(shù)細菌都能產(chǎn)生，致熱能力最強的是革蘭氏陰性桿菌所產(chǎn)生的熱原。霉菌甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。含有熱原的輸液注入人體，大約半小時以后，就使人體發(fā)冷、寒戰(zhàn)、體溫升高、身痛、出汗、惡心嘔吐等不良反應(yīng)，有時體溫可升至40°C，嚴重者出現(xiàn)昏迷、虛脫，甚至有生命危險。熱原反應(yīng)的溫度變化曲線，因熱原種類不同而有差異。一般先經(jīng)過一個短的潛伏期后，溫度略微上升，然后又略微下降，接著又很快上升，并出現(xiàn)一個高峰，根據(jù)這種現(xiàn)象而導(dǎo)致一個假設(shè)：即細菌性熱原本身不引起發(fā)熱反應(yīng)。但熱原使多型核白細胞(polymorphonuclerleucocyte)及其他

2、細胞釋放一種內(nèi)源性熱原(endogenouspyrogen)，雖然有人提出內(nèi)源性熱原可能是蛋白質(zhì)或脂蛋白(lipoprotein)組成，但其確切組成尚未肯完，它作用于視丘下部體溫調(diào)節(jié)中樞，可能引起5-羥色胺的升高而導(dǎo)致發(fā)熱1，熱原的致熱量因菌種而異，由于注射途徑不同，引起發(fā)熱反應(yīng)的程度也有差異。1.熱原的組成熱原是微生物的一種內(nèi)毒素，它存在于細菌的細胞膜和固體膜之間。內(nèi)毒素是由磷脂、脂多糖和蛋白質(zhì)所組成的復(fù)合物，其中脂多糖(lipopolysaccharide)是內(nèi)毒素的主要成分，具有特別強的熱原活性，因而大致可以認為內(nèi)毒素=熱原=脂多糖。脂多糖的化學(xué)組成因菌種不同而異，從大腸桿菌分出來的脂多

3、糖中有68%69%的糖(葡萄糖、半乳糖、庚糖、氨基葡萄糖、鼠李糖等)，1213%的類脂化合物，7%的有機磷和其它一些成分。熱原的分子量一般為10105左右。熱原的結(jié)構(gòu)2.熱原的性質(zhì)(1)耐熱性一般說來，熱原在60°C加熱1小時不受影響，100°C也不會發(fā)生熱解，在180°C34小時，250C3045分鐘或650C1分鐘可使熱原徹底破壞。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些熱原具有熱不穩(wěn)定性，但在通常注射劑滅菌的條件下，往往不足以使熱原破壞，這點必須引起注意；(2) 濾過性熱原體積小，約在15nm之間，故一般濾器均可通過。即使微孔濾膜，也不能截留。但活性炭可以吸附熱原；(3) 水溶性熱

4、原能溶于水；(4) 不揮發(fā)性熱原本身不揮發(fā)，但在蒸餾時，往往可隨水蒸汽霧滴帶入蒸餾水，故應(yīng)設(shè)法防止；(5) 吸附性熱原對許多分子有親和性，優(yōu)其是蛋白質(zhì)類，因此較難去除。(5) 其它熱原能耐受酸堿和化學(xué)試劑的處理，但熱原能被強酸、強堿破壞，也能被強氧化劑如高錳酸鉀或過氧化氫所鈍化，超聲波也能破壞熱原。熱原對干涸的耐受性較強。3. 污染熱原的途徑(1)從溶劑中帶入這是注射劑出現(xiàn)熱原的主要原因。蒸餾器結(jié)構(gòu)不合理，操作不當，注射用水貯藏時間過長都會污染熱原。故應(yīng)使用新鮮注射用水，最好隨蒸隨用；(2) 從原料中帶入容易滋長微生物的藥物，如葡萄糖因貯存年久包裝損壞常致污染熱原。用生物方法制造的藥品如右旋糖

5、酐、水解蛋白或抗生素等常因致熱物質(zhì)未除盡而引起發(fā)熱反應(yīng)；(3) 從容器、用具、管道和裝置等帶入因此在生產(chǎn)中對這些容器用具等物要認真處理，合格后方能使用；(4) 制備過程中的污染制備過程中，由于室內(nèi)衛(wèi)生條件差，操作時間長，裝置不密閉，均增加污染細菌的機會，而可能產(chǎn)生熱原；(5) 從輸液器帶入有時輸液本身不含熱原，但仍發(fā)現(xiàn)熱原反應(yīng)。這往往是由于輸液器具(如輸液吊瓶、膠皮管等)污染所致。4. 熱原的除去方法除熱原的定義是除去所有使病人體溫升高的物質(zhì)。制藥生產(chǎn)中指除去內(nèi)毒素。除熱原的方法主要有物理去除，鈍化。物理去除法包括反滲透法、蒸餾法、超濾法、活性炭吸附法、疏水性吸附法、靜電修飾過濾法、吸附色譜法

6、、用粘合劑或色譜柱提取、漂洗。（1）蒸餾法水系統(tǒng)中使用的最古老的方法。機理簡單，包括水的雙相轉(zhuǎn)變，沸點使液體變?yōu)檎魵?，蒸氣揮發(fā)，分子量大的熱原被留下，設(shè)計良好的隔析使氣體凝固，重力使其下降，使熱原的分子量加大。通常需要>80oC再循環(huán)溫度。（2）超濾法超濾的原理通常認為是分子篩，其有效性與篩的大小有關(guān)。LPS的分子量約為10,000-20,000道爾頓，因此可以被10,000道爾頓的超濾膜除去。實際上熱原聚合物的分了量約100,000道爾頓，所以0.1um的濾膜通常能有效的除去熱原。（3）活性炭吸附法古老的方法之一，很早就有文獻記載?；钚蕴繉嵩休^強的吸附作用，同時有助濾脫色作用，所以

7、在注射劑中使用較廣。常用量為0.1%0.5%。此外還可用活性炭與白陶土合用除去熱原?；钚蕴窟m用的pH范圍較寬，不受電解質(zhì)濃度影響。這種方法在制劑應(yīng)用較廣，如生理鹽水，葡萄糖和抗生素等的除熱原。缺點是對某些活性成份有吸附。（4）疏水吸附法很多的脂肪族聚合物對熱原有吸附性，聚丙烯，聚乙烯，聚偏二乙烯，聚四氟乙烯。這些聚合物的非極性基團使濾膜有疏水性。膜和脂多糖A之間的疏水吸附是溶液中的熱原被吸附的原因。（5）靜電修飾過濾這種濾膜利用兩種作用方式：pH>2.0時原熱帶負電其行為像陰離子，因此濾膜中使用陽離子吸附熱原。也利用濾膜中纖維分支與熱原的碰撞、沉積、篩分來捕獲熱原。這些濾膜通常較厚，也有

8、一些僅帶正電的濾膜。（6）吸附色譜法這是一個應(yīng)有較廣的方法，吸附劑包括PolymixinB,SubstrateAnalogueSepharose，LALSepharose，DEAESepharose。Sepharose色譜柱可以在很長的時間內(nèi)保留吸附能力。并能用1%sodiumdeoxycholate再生。（7）粘合劑提取法有很多化學(xué)物的特性可用以實驗，優(yōu)其是熱原的檢查，最近ProfosAG使用相技術(shù)提取熱原。但大多數(shù)的這些粘合系統(tǒng)不適合于大規(guī)模的應(yīng)用而只能用于實驗。（8）用反滲透法通過三醋酸纖維膜除去熱原這是近幾年發(fā)展起來有實用價值的新方法。反滲透膜是很薄的纖維或聚酰胺膜，通過分子篩的形式阻

9、礙原熱聚合物通過濾膜，因為這樣某些產(chǎn)品的使用有所限制。良好的反滲透膜可以去除99.5%-99.9%的熱原，即使負荷達10,000EU/ml。常見的問題是膜穿孔。（9）漂洗法嚴格來說漂洗不是除熱原的方法，但是在很多情況下能成功的除去小量的熱原。注射用水清洗系統(tǒng)經(jīng)常用于處理大容器，管道。熱和超聲可以提高效率。由于其內(nèi)在的變化性，漂洗程序要仔細的驗證。鈍化法（10）離子交換法國內(nèi)有用#301弱堿性陰離子交換樹脂10%與#122弱酸性陽離子交換樹脂8%成功地除去丙種胎盤球蛋白注射液中的熱原；（11）凝膠濾過去國內(nèi)有用二乙氨基乙基葡聚糖凝膠（分子篩）制備無熱原去離子水；鈍化包括熱、濕和干，化學(xué)鈍化和部分

10、破壞，氧化（H202）。（12）干熱除熱原對于注射用的針筒或其他玻璃器皿，在洗滌干燥后，于250°C加熱30分鐘以上，可以破壞熱原；需要驗證說明熱原的3個對數(shù)下降。要求進行熱原挑戰(zhàn)性試驗，例如用熱原挑戰(zhàn)瓶子和ECVs來建立干熱除熱原過程導(dǎo)致的熱原的對數(shù)下降。（13）酸堿化學(xué)鈍化玻璃容器、用具還可用重鉻酸鉀硫酸清潔液或稀氫氧化鈉處理，可將熱原破壞；酸水解作用于酸不穩(wěn)定的ketosidic鏈，使Lipid-A從熱原分子中分離。KD0和核心polysaccharides是整個分子中脂部分的絕以載體。一旦出現(xiàn)分離，脂多糖A不溶于水，熱原活性下降或消失。堿水解靠脂肪酸的皂化，使熱原分子發(fā)生化學(xué)

11、和生化變化。一般來說堿水解的效力低于酸水解，0.25NNa0H，56oC，1hour僅能中度破壞熱原。加入95%乙醇或80%dimethylsulfoxide可以提高效果，但工藝難于處理不能廣泛應(yīng)用。（14）過氧化氫早在1912Hort&Penfolc證實用雙氧水清洗后SalmonellaTyphosa細菌失去致熱能力。雙氧水對熱原的作用機理未明。可能是脂多糖A過氧化所致。熱可以增加過氧化氫的作用。本法優(yōu)于酸堿法，但可能使產(chǎn)品變質(zhì)。（四）原水處理原水處理方法有離子交換法與電滲析法及反滲透法，離子交換法制得的離子交換水主要供蒸餾法制備注射用水使用，也可用于洗瓶，但不得用來配制注射液，因其

12、在除熱原方面還不如蒸餾法那樣可靠，有時還帶有乳光。電滲析法與反滲透法廣泛用于原水預(yù)處理，供離子交換法使用，以減輕離子交換樹脂的負擔。前面已提到，熱原是微生物污染產(chǎn)生的致熱物質(zhì)，是病人注射后發(fā)熱反應(yīng)的根源。這些致熱物質(zhì)是菌菌外壁的脂多糖或內(nèi)毒素。由于它的耐熱性，滅菌后或過濾后仍可以水中存在。注射用水應(yīng)采用合適的方法式去除熱原。由于熱原是有機物，可以將它們氧化為易從水中去除的氣體或非揮發(fā)固體。高錳酸鉀是常用的氧化劑，小量氫氧化鋇可以增加其效率，氫氧化鋇可以堿化溶液，使酸生成非揮發(fā)性鋇鹽。這兩種試劑加入多次蒸餾的水中，再多次蒸餾，在無菌條件下收。如果很好的生產(chǎn)，用這種方法可以得到高純，無菌，無熱原的

13、水。不管采用哪種方法均要進行熱原檢查以保證無熱原。除熱原工藝舉例：烘箱、管道滅菌器、洗瓶、膠塞清洗，例如用氫氧化鈉清洗，過濾。5. 驗證：工藝過程中只要存在除熱原步驟，不論采用何種除熱原的方法均應(yīng)進行驗證。驗證的目標是獲得熱原的3個對數(shù)單位下降。對數(shù)下降的計算：對數(shù)下降=未處理樣品熱原的對數(shù)值-處理后樣品熱原對數(shù)值以干熱除熱原為例:未處理的樣品的熱原值=3,200EU/ml處理后樣品的熱原值=0.7EU/ml對數(shù)下降=Log(3,200)-Log(0.7)=3.505-(-0.155)=3.7熱原挑戰(zhàn)試驗大多數(shù)情況下熱原挑戰(zhàn)試驗是驗證的必須部分。這需要丞載一定濃度的熱原的載體。載體必須能代表工

14、藝要處理的實際的產(chǎn)品。所用的瓶子：制備50,000EU/ml濃度的熱原溶液。每瓶加入100l熱原溶液，空氣干燥或凍干。烘試驗瓶子，保留未烘的瓶子作對照用。用1mlLAL水溶液復(fù)溶，徹底渦旋，將對照樣品稀釋至1/10,000，測定每個瓶子。用動力學(xué)方法所得的結(jié)果如下:ControlVialsDilutionEU/inlTotalEU/vial110,0000.363600210,0000313100310,0000.333300average=3200410,0000.292900510,0000313100TestVialsLogReduction1Undilute<0.005<0.005>5.8考慮點：采用干熱除熱原時要研究工藝的冷點。這些信息可以用以樣正瓶了在烘箱或管道滅菌器中的位置。技術(shù)人員要知道可以熱處理的物品與只能清洗的產(chǎn)品的明顯區(qū)別。熱處理與時間和溫度有關(guān)。清洗與