微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(10.10)

1、12實(shí)驗(yàn)一顯微鏡的使用及細(xì)菌的革蘭氏染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 復(fù)習(xí)顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油鏡的使用方法。2. 初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色的步驟二實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 學(xué)習(xí)油浸系物鏡的使用方法。2制作細(xì)菌染色裝片。3. 進(jìn)行革蘭氏染色法操作。4. 用油鏡觀察大腸桿菌和蘇云金桿菌染色裝片。二、實(shí)驗(yàn)原理一油鏡的基本原理普通光學(xué)顯微鏡包括低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3種物鏡。油鏡是一種高倍放大的物鏡，一般都刻有放大倍數(shù)，如95x、100x等。油鏡頭上?？逃蠴IOil,Immersion或HIHomogeneousimmersion字樣，有的還刻有一圈紅線或

2、黑線標(biāo)記，而且油鏡的鏡身較高倍鏡和低倍鏡為長(zhǎng)。在低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑numberalaperture最大，而工作距離最短圖3-1。IH/Cl171-0.1"圖1-1顯微鏡物鏡參數(shù)圖顯微鏡的分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點(diǎn)間最小距離Q的能力。D值愈小說(shuō)明分辨率愈高。D值與光線的波長(zhǎng)入成正比，與物鏡的數(shù)值孔徑NA成反比.從上式可看出，縮短光波長(zhǎng)和增大數(shù)值孔徑都可提高分辨率。數(shù)值孔徑指光線投射到物鏡上的最大角度稱(chēng)鏡口角，a的一半正弦與介質(zhì)折射率n的乘積。影響數(shù)值孔徑大小的因數(shù)，一是鏡口角，二是介質(zhì)的折射率。當(dāng)鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時(shí)，由于空氣n=1

3、.0與玻璃n=的折射率不同，光線會(huì)發(fā)生折射，不僅使進(jìn)入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會(huì)減少鏡口角。當(dāng)以香柏油n=為介質(zhì)時(shí)，由于它的折射率與玻璃相近，光線經(jīng)過(guò)載玻片后可直接通過(guò)香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射，不僅增加了視野的照明廢，更重要的是通過(guò)增加數(shù)值孔徑提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。二革蘭氏染色革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家ChristainGram創(chuàng)立的，是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法，其原理是利用細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類(lèi)脂質(zhì)含量低，用乙醇或丙酮脫色時(shí)細(xì)胞

4、壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄，類(lèi)脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類(lèi)脂質(zhì)被乙醇或丙酮溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來(lái)，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。三、實(shí)驗(yàn)材料和用具1. 菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)、蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)o2. 試劑革蘭氏染色液結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95乙醇、石炭酸復(fù)紅液等、香柏油、二甲苯。3.儀器及用具顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙

5、、試管、小滴管、酒精燈。四、操作步驟(一) 細(xì)菌的革蘭氏染色1. 制片1涂菌用無(wú)菌操作方法從平板中沾取菌苔一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無(wú)脂的載玻片上做一薄而勻、直徑約1cm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。2干燥于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥溫度不宜過(guò)高。3固定將細(xì)菌涂片向上，通過(guò)火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。目的是殺死細(xì)菌并使細(xì)菌粘附在玻片上，便于染料著色。2. 染色1初染于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。2媒染滴加盧戈氏碘液，1min后水洗。3脫色滴加95乙醇脫色，搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止（根據(jù)涂片之厚薄需時(shí)30s至1min），立

6、即水洗。4復(fù)染滴加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染1min,水洗。5鏡檢用濾紙吸干，油鏡鏡檢。二鏡檢1.觀察前的準(zhǔn)備1將顯微鏡置于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約為4cm。坐正。2調(diào)節(jié)光源：將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，把光圈完全打開(kāi)，聚光器升至與載物臺(tái)相距約1mm左右。觀察染色裝片時(shí)，光線宜強(qiáng)；觀察未染色裝片時(shí)，光線不宜太強(qiáng)。2. 低倍鏡觀察染色裝片首先上升鏡筒，將細(xì)菌染色裝片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，物鏡降至裝片cm處，適當(dāng)縮小光圈，然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升或使鏡臺(tái)下降至發(fā)現(xiàn)物像時(shí)，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。移動(dòng)裝片，把合適的觀察部分移至視野中心。3.

7、高倍鏡觀察眼睛離開(kāi)目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意防止鏡頭與玻片相撞。再用目鏡觀察，仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部分移至視野中心，繪圖。不要移動(dòng)裝片位置，準(zhǔn)備用油鏡觀察。4. 油鏡觀察1提起鏡筒約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位鏡頭的正下方滴一滴香柏油。2從側(cè)面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴(kuò)大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。3將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升（切忌反方向旋轉(zhuǎn)），直至視野中有物像出現(xiàn)時(shí)，再用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如因鏡頭下降未到

8、位或鏡頭上升太快未找到物像必須再?gòu)膫?cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作直至物像看清為止。仔細(xì)觀察并繪圖。4再次觀察，提起鏡筒，換上另一塊細(xì)菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察。繪圖。重復(fù)觀察時(shí)可比第一次少加香柏油。5. 鏡撿完畢后的工作1移開(kāi)物鏡鏡頭。2取出裝片。3清潔油鏡油鏡使用完畢后，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯，擦掉殘留的香柏油，最后再用干凈的擦鏡紙擦干殘留的二甲苯。4擦凈顯微鏡，將各部分復(fù)原；將接物鏡呈“八“字形降下，不可使其正對(duì)聚光器，同時(shí)降下聚光器，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡使其鏡面垂直于鏡座。最后套上鏡罩，對(duì)號(hào)放入鏡箱中，陰涼干燥處存放。（三）結(jié)果革蘭氏陽(yáng)性菌染成藍(lán)紫色,

9、革蘭氏陰性菌染成淡紅色。五、注意事項(xiàng)1細(xì)菌涂片務(wù)求均勻切忌過(guò)厚。2在染色過(guò)程中，不可使染液干涸。3脫色時(shí)間十分重要，過(guò)長(zhǎng)，則脫色過(guò)度，會(huì)使陽(yáng)性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會(huì)使陰性菌被染成陽(yáng)性菌。4老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會(huì)使陽(yáng)性菌被染成陰性菌，故不能選用。5使用油鏡必須先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察的程序操作；6下降鏡頭時(shí)，一定要從側(cè)面注視，切忌用眼睛對(duì)著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯(cuò)誤操作以免壓碎玻片而損壞鏡頭。7使用二甲苯擦鏡頭時(shí)，二甲苯不能過(guò)多，以防溶解固定透鏡的樹(shù)脂。8注意保持顯微鏡的潔凈，對(duì)金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

10、1. 分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。2. 記錄革蘭氏染色法步驟，并進(jìn)行結(jié)果分析。七、問(wèn)題和思考1涂片后為什么要進(jìn)行固定，固定時(shí)應(yīng)注意什么?2. 用油鏡便于觀察細(xì)菌的依據(jù)是什么?3使用油鏡應(yīng)特別注意哪些間題？4當(dāng)物鏡從低倍鏡轉(zhuǎn)到高倍鏡和油鏡時(shí)，對(duì)照明度有何要求?實(shí)驗(yàn)二放線菌、酵母菌和霉菌的形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.識(shí)別放線菌的營(yíng)養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的形態(tài)，學(xué)習(xí)放線菌的觀察方法。2.了解酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)。3. 了解霉菌形態(tài)，掌握微生物載玻片濕室培養(yǎng)方法。二實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.用插片法和水封片法觀察放線菌的形態(tài)特征。2.觀察

11、酵母菌的個(gè)體形態(tài)和假菌絲。3. 曲霉、青霉、根霉形態(tài)觀察。二、實(shí)驗(yàn)原理放線菌是一類(lèi)主要呈菌絲狀生長(zhǎng)和以孢子繁殖的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，常見(jiàn)放線菌大多能形成菌絲體。緊貼培養(yǎng)基外表或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的叫基內(nèi)菌絲簡(jiǎn)稱(chēng)“基絲”)，基絲生長(zhǎng)到一定階段還能向空氣中生長(zhǎng)出氣生菌絲簡(jiǎn)稱(chēng)“氣絲”)，并進(jìn)一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子。有的放線菌只產(chǎn)生基絲而無(wú)氣絲。在顯微鏡下直接觀察時(shí)，氣絲處在上層、基絲在下層，氣絲色暗，基絲較透明。孢子絲依種類(lèi)的不同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。在油鏡下觀察，放線菌的孢子有球形、橢圓、桿狀或柱狀。能否產(chǎn)生菌絲體及由菌絲體分化產(chǎn)生的各種形態(tài)特征是放線菌分類(lèi)鑒定的重要依據(jù)。通過(guò)設(shè)計(jì)各種培養(yǎng)和

12、觀察方法如插片法、搭片法、玻璃紙法、印片法等，可保持放線菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的形態(tài)特征，便于觀察上述3種菌絲和孢子。酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物，通常比常見(jiàn)細(xì)胞大幾倍甚至十幾倍。大多數(shù)酵母菌以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過(guò)接合產(chǎn)生子囊孢子。美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，復(fù)原型無(wú)色。用美藍(lán)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的復(fù)原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的復(fù)原型。因此，具有復(fù)原能力的酵母細(xì)胞是無(wú)色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。霉菌可產(chǎn)生分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長(zhǎng)到一定階段分化產(chǎn)生

13、繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體及孢子的形態(tài)特征是識(shí)別不同種類(lèi)霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多，可用低倍顯微鏡觀察。霉菌菌絲較粗大，細(xì)胞易收縮變形，而且孢子很容易飛散，所以制標(biāo)本時(shí)常用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。霉菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的形態(tài)，常用載玻片觀察；此外，為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃紙透析培養(yǎng)法進(jìn)行觀察。三、實(shí)驗(yàn)材料和用具1. 菌株細(xì)黃鏈霉菌Streptomycesmicuoflavus又稱(chēng)5406，棘抱小單抱菌Micromonusporaechinospora，釀酒酵母Saccharomycescerevisiae),熱帶假絲酵母C

14、andidatropicalis，產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum、黑曲霉Aspergillusniger、黑根霉Rhizopusnigricans。2. 試劑%美藍(lán)染色液、石炭酸復(fù)紅染色液、美藍(lán)染色液以pH6.0的mol/L磷酸緩沖液配制、碘液、的中性紅染色液、5%孔雀綠，0.5%沙黃液、95%乙醇、乳酸苯酚固定液、棉藍(lán)染色液、20%甘油。3. 儀器及用具蓋玻片、載玻片、鑷子、接種環(huán)、顯微鏡、涂布器、玻璃紙、打孔器。透明膠帶、剪刀、圓形濾紙片、細(xì)口滴管、鑷子。四、操作步驟()放線菌的形態(tài)觀察1. 觀察自然生長(zhǎng)狀態(tài)的放線菌用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的5406菌培養(yǎng)皿中的一張

15、蓋玻片，將其反面附著的菌絲體擦凈，然后將長(zhǎng)有菌的一面向上放在潔凈的載玻片上，分別用低倍鏡、高倍鏡觀察找出3類(lèi)菌絲及其分生抱子。注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細(xì)和色澤差異。2. 水封片觀察取一滴美藍(lán)染色液置于載玻片中央，將用搭片法培養(yǎng)棘抱小單抱菌培養(yǎng)皿中的蓋玻片取出，并將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀察其分生抱子及基內(nèi)菌絲。(二) 酵母菌的形態(tài)觀察1. 酵母菌的活體染色觀察及死亡率的測(cè)定以無(wú)菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。(2) 取美藍(lán)染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻3min,加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母的個(gè)體形態(tài)

16、，區(qū)分其母細(xì)胞與芽體，區(qū)分死細(xì)胞(藍(lán)色)與活細(xì)胞(不著色)。(3) 在一個(gè)視野里計(jì)數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞，共計(jì)數(shù)5-6個(gè)視野。死亡率x100%酵母菌死亡率一般用百分?jǐn)?shù)來(lái)表示，以下式來(lái)計(jì)算：2. 酵母菌液泡系的活體觀察于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5min,加蓋玻片在顯微鏡下觀察。細(xì)胞無(wú)色，液泡呈紅色。3. 酵母的假菌絲的觀察取一無(wú)菌載玻片浸于溶化的PDA培養(yǎng)基中，取出放在濕室培養(yǎng)的支架上，待培養(yǎng)基凝固后，進(jìn)行酵母菌劃線接種，然后將無(wú)菌蓋玻片蓋在接菌線上（圖4-1）,28°C培養(yǎng)2-3d后，取出載玻片，擦去載玻片下面的培養(yǎng)基，在顯微鏡下直接觀察。可見(jiàn)到

17、芽殖酵母形成的藕節(jié)狀假菌絲，裂殖酵母則形圖2-1酵母菌假菌絲的培養(yǎng)圖2-2酵母菌的假菌絲形態(tài)A.藕節(jié)狀假菌絲B.竹節(jié)狀假菌絲（三）霉菌觀察1. 霉菌的形態(tài)觀察采用濕室培養(yǎng)法培養(yǎng)霉菌?？蓮呐囵B(yǎng)16-20h開(kāi)始，連續(xù)觀察，了解抱子的萌發(fā)、菌絲體的生長(zhǎng)分化和子實(shí)體的形成過(guò)程。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛雷、根霉等霉菌的形態(tài)，重點(diǎn)觀察菌絲是否有分隔，曲霉和青霉的分生抱子形成特點(diǎn)，曲霉的足細(xì)胞，根霉和毛霉的抱子囊和抱囊抱子。繪圖。2. 粘片觀察取一滴棉藍(lán)染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開(kāi)霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。3. 假根觀察將培養(yǎng)

18、根霉假根的平皿打開(kāi)，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標(biāo)本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根上分化出的抱子囊梗、抱子囊、抱囊抱子以及兩個(gè)假根間的匍匐菌絲，觀察時(shí)注意調(diào)節(jié)焦距以看清各種構(gòu)造。五、注意事項(xiàng)1放線菌的生長(zhǎng)速度較慢，培養(yǎng)期較長(zhǎng)，在培養(yǎng)操作中特別注意無(wú)菌操作，嚴(yán)防雜菌污染。2. 通過(guò)微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細(xì)胞。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 繪制自然生長(zhǎng)狀態(tài)下放線菌的形態(tài)。2. 繪制酵母菌細(xì)胞。3. 繪制根霉、青霉、曲霉形態(tài)圖，標(biāo)示各部分名稱(chēng)。七、問(wèn)題和思考1. 用插片法和搭片法如何制備放線菌標(biāo)本，其主要優(yōu)點(diǎn)是什么?可否用此法觀察其他微生物?為什么?2. 酵

19、母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區(qū)別？3什么叫載玻片濕室培養(yǎng)？它適用于觀察怎樣的微小物，有何優(yōu)點(diǎn)？附錄：()插片法和搭片法培養(yǎng)放線菌1插片法(圖2-3A)(1) 制平板、接種用冷卻至約50°C的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基倒平板每皿約20mL?？捎脙煞N方法接菌：先接種后插片：冷凝后用接種環(huán)挑取少量斜面上的5406菌抱子，用平板培養(yǎng)基的一半面積作來(lái)回劃線接種接種量可適當(dāng)擴(kuò)大。先插片后接種：用平板培養(yǎng)基的另一半面積進(jìn)行。(2) 插片及培養(yǎng)用無(wú)菌鑷子取無(wú)菌蓋玻片，在已經(jīng)接種平板以45C角斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，插入深度約占蓋玻片1/2的長(zhǎng)度(圖4-3A)。同時(shí)，在另一半未經(jīng)接種的部位以同樣方式插

20、入數(shù)塊蓋玻片，然后接種少量5406菌抱子至蓋玻片一側(cè)的基部，但僅接種于其中央位置約占蓋玻片寬度的一半左右，以免菌絲蔓延至蓋玻片的另一側(cè)，將插片平板倒置于28C，培養(yǎng)3-7d。A0圖2-3放線菌的插片和搭片示意圖A插片法B搭片法2.搭片法(圖2-3B)（1）開(kāi)槽及接種用無(wú)菌打孔器在凝固后的平板培養(yǎng)基上打洞數(shù)個(gè)，并將棘抱小單抱菌抱子劃線接種至洞內(nèi)邊緣。（2）搭片及培養(yǎng)在接種后的洞面上放一無(wú)菌蓋玻片，平板倒置于28°C，培養(yǎng)3-7do（二）霉菌的培養(yǎng)1霉菌的載片濕室培養(yǎng)1準(zhǔn)備濕室在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一U形載玻片擱架，在擱架上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎.經(jīng)1

21、21C濕熱滅菌30min,置60C烘箱中烘干，備用。2取菌接種用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌抱子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的抱子兩處。接種時(shí)只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可（務(wù)必記住接種的位置）。3加培養(yǎng)基用無(wú)菌細(xì)口滴管吸取少量融化約60C的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處.培養(yǎng)基液應(yīng)滴得圓而薄，其直徑約為cm（滴加量一般以1/2小滴為宜）。4加蓋玻片在培養(yǎng)基未徹底凝固之前，用無(wú)菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當(dāng)接近，但不能壓扁.否則不透氣。5倒保濕劑每皿倒入約3mL20%的無(wú)菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤(rùn)滑，以保持皿內(nèi)濕度。皿蓋上注明

22、菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置28C恒溫培養(yǎng)3-5do2.黑根霉假根的培養(yǎng)（圖2-4將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50C倒入無(wú)菌平皿，其量約為平皿高度的1/2，冷凝后，用接種環(huán)沾取根霉抱子，在平板外表劃線接種，然后將平皿倒置，在皿蓋內(nèi)放一無(wú)菌載玻片，于28C培養(yǎng)2-3d后，可見(jiàn)根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結(jié)構(gòu)。/一卜_L'-i-«-*F|圖2-4根霉假根的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)三培養(yǎng)基的配制、消毒和滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 明確配制培養(yǎng)基的原理，了解消毒和滅菌的原理。2. 學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步

23、驟。3. 掌握各種滅菌方法的操作步驟。二實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA的配制。2高壓蒸汽滅菌法、干熱滅菌法、過(guò)濾除菌法。二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)、繁殖和代謝的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子及水分等。培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH、一定的緩沖能力、一定的氧化復(fù)原電位及合適的滲透壓。在液體培養(yǎng)基中加入0.5-1%的瓊脂配制為半固體培養(yǎng)基，加入1-2%的瓊脂配制為固體培養(yǎng)基。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的多糖，是應(yīng)用最廣的凝固劑。瓊脂在96-100°C融化，46C以下凝固。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后使用。培養(yǎng)基或其他

24、液體的滅菌一般是用高壓蒸汽滅菌法又稱(chēng)濕熱滅菌。其原理是在密閉的高壓滅菌鍋中，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽，增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)提高，得到高于100C的溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性到達(dá)完全滅菌的目的。培養(yǎng)用的玻璃器皿通常采用干熱滅菌法。干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而到達(dá)滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高160170C，時(shí)間要長(zhǎng)12h，但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180C，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起

25、燃燒。過(guò)濾除菌是通過(guò)機(jī)械作用濾去液體或氣體中的細(xì)菌、真菌孢子等的方法，適用于酶液、抗生素等不耐熱溶液的滅菌。三、實(shí)驗(yàn)材料和用具1. 試劑牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO7H2O、1%鏈霉素溶液。2. 儀器及用具試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、稱(chēng)量紙、試管架、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、皮筋、紗布、手提式高壓蒸汽滅菌鍋、電熱烘箱、過(guò)濾除菌器、培養(yǎng)皿塑料管帶刻度。四、操作步驟一玻璃器皿的洗滌和包裝1玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培

26、養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中用毛刷刷洗，然后用自來(lái)水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來(lái)水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2滅菌前玻璃器皿和塑料管的包裝培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報(bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。塑料管將蓋子擰松后，用報(bào)紙包好。包裝后的培養(yǎng)皿和塑料管須經(jīng)滅菌之后才能使用。（二）培養(yǎng)基的配制1.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g,瓊脂13g,水1000mL,pH-。1稱(chēng)量按實(shí)際用量計(jì)算后,按配方稱(chēng)取

27、各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或外表皿中稱(chēng)量,用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱(chēng)量紙上稱(chēng)量,隨后放入熱水中,牛肉膏便與稱(chēng)量紙別離,立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮,故稱(chēng)量時(shí)要迅速。2加熱溶解在燒杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉網(wǎng)上,小火加熱,并用玻棒攪拌,待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。假設(shè)配制固體培養(yǎng)基,則將稱(chēng)好的瓊脂放入已溶解的藥品中,再加熱融化,此過(guò)程中需不斷攪拌,以防瓊脂糊底或溢出,最后補(bǔ)足所失的水分。調(diào)pH檢測(cè)培養(yǎng)基的pH，假設(shè)pH偏酸，可滴加1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè)，直至到達(dá)所需pH范圍。假設(shè)偏堿，則用1mol/LHC1進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH的

28、調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過(guò)頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度.液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過(guò)濾，以利結(jié)果的觀察。供一般使用的培養(yǎng)基.此步可省略。5分裝披實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5,滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過(guò)其容積內(nèi)一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/4為宜.滅菌后垂直待凝。6加棉塞試管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脫脂棉）制作的棉塞，棉塞制作方法則圖1-1。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到

29、防止雜菌侵入和有利透氣的作用。要使棉塞總長(zhǎng)約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的透氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料蓋代替棉塞。圖1-1試管棉基的制作A制作.過(guò)程；B制件田超包扎加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。假設(shè)培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把試管扎成捆后，再于棉塞外包一層牛皮紙。然后用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、組別、日期。8滅菌將上述培養(yǎng)基于121.0°C濕熱滅菌20min。如因特殊情況沒(méi)能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放人冰箱內(nèi)暫時(shí)保存。9擺斜面滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長(zhǎng)木條上，并調(diào)整斜度，使斜面長(zhǎng)

30、度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半。10無(wú)菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入37°C溫箱中培養(yǎng)24-48h,無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)可以使用，或放置在冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。2高氏1號(hào)培養(yǎng)基高氏1號(hào)培養(yǎng)基是用于別離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaClg，K2HPO43H2Og，MgSO47H2Og，F(xiàn)eSO47H2O1g,瓊脂13g,蒸餾水1000mL,-。1稱(chēng)量和溶解經(jīng)計(jì)算后稱(chēng)量，按用量先稱(chēng)取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加至少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。對(duì)微量成分FeSO47H2O可先配成高濃度的

31、貯備液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO47H2O，配成濃度為0.01g/mL的貯備液，再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。待所有藥品完全溶解后補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過(guò)程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。3. 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA的配制PDA是用于別離真菌的常用培養(yǎng)基。去皮馬鈴薯200g；葡萄糖20g；瓊脂13g；自來(lái)水1000mL。1培養(yǎng)基配制將馬鈴薯洗凈去皮，稱(chēng)取200g，切成小塊，放入鍋中加水1000mL,煮沸半小時(shí)。用雙層潔凈紗布過(guò)濾去渣，在濾液中加葡萄糖或蔗糖2

32、0g,加水補(bǔ)足1000mL。這樣配成的培養(yǎng)液一般呈酸性，用于培養(yǎng)真菌時(shí)，不必矯正它的酸度。然后加入瓊脂13g,加熱使瓊脂完全融化，同時(shí)補(bǔ)足應(yīng)有的水量。趁熱分裝在試管或三角瓶中，加棉花塞后滅菌。2鏈霉素的加入鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時(shí)，將培養(yǎng)基融化后待溫度降全45C左右時(shí)才能加入。可先將鏈霉素配成1%的溶液（配好的鏈霉素溶液保存于-20C）,在1000mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素mL,使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30昭。三滅菌1.高壓蒸汽滅菌法15高壓蒸汽滅菌法適用于培養(yǎng)基、無(wú)菌水、工作服等物品的滅菌。1加水將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，以水面與三角架相平為宜2裝料將裝料桶放回鍋內(nèi)，裝

33、入待滅菌的物品。裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，瓶塞不要緊貼桶壁，以免冷凝水沾濕棉塞。3加蓋將蓋上與排氣孔相連接的排氣軟管插人內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對(duì)齊螺口，然后以同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓的方式擰緊所有螺栓，并打開(kāi)排氣閥。4排氣用電爐或煤氣加熱待水煮沸后，水蒸汽和空氣一起從排氣孔排出.一般排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，說(shuō)明鍋內(nèi)空氣已排凈（沸后約5min）。5升壓當(dāng)鍋內(nèi)空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開(kāi)始上升。6保壓當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，計(jì)時(shí)并維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用121°C,20min滅菌。7降壓到達(dá)所需滅菌時(shí)間后，關(guān)閉熱源，讓壓力自然下降到零后，打開(kāi)排

34、氣閥，放凈余下的蒸汽后，再打開(kāi)鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。8無(wú)菌檢查將已滅菌培養(yǎng)基于37C培養(yǎng)24h,無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可待用。2.干熱滅菌法干熱滅菌法適用于玻璃器皿，如試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、移液管等的滅菌。1裝入待滅菌物品預(yù)先將各種器皿用紙包好或裝入金屬制的培養(yǎng)皿筒、移液管筒內(nèi)，然后放入電熱烘箱中。2升溫關(guān)好電烘箱門(mén)，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，旋功恒溫調(diào)節(jié)器至所需溫度刻度（本實(shí)驗(yàn)所需為160），此時(shí)烘箱紅燈亮，說(shuō)明烘箱已開(kāi)始加熱，當(dāng)溫度上升至所設(shè)定溫度后，則烘箱綠燈亮，表示巳停止加溫。當(dāng)溫度升到所需溫度后，維持此溫度1.5h。4降溫切斷電源，自然降溫。5取出滅菌物品待電烘箱內(nèi)溫度降到70°C

35、以下后，才能打開(kāi)箱門(mén)，取出滅菌物品。3. 過(guò)濾除菌法有些物質(zhì)，如抗生素、血清、維生素等易受熱分解，因而要采用過(guò)濾除菌法。1過(guò)濾器的種類(lèi)濾膜過(guò)濾器：由醋酸纖維素、硝酸纖維素等制成，有孔徑大小不同的多種規(guī)格（如Am、0.22Am、Am、0.45Am等），過(guò)濾細(xì)菌常用0.45Am孔徑。其優(yōu)點(diǎn)是吸附性小，即溶液中的物質(zhì)損耗少，濾速快,每張濾膜只使用1次，不用清洗。蔡氏過(guò)濾器：是一種金屬制成的過(guò)濾漏斗，其過(guò)濾部分是一種用石棉纖維和其他填充物壓制成的片狀結(jié)構(gòu)。溶液中的細(xì)菌通過(guò)石棉纖維的吸附和過(guò)濾而被去除，但對(duì)溶液中其他物質(zhì)的吸附性也大。每張纖維板只能使用1次。玻璃濾器：是一種由玻璃制成的過(guò)濾漏斗，其過(guò)濾部

36、分是由細(xì)玻璃粉燒結(jié)成的板狀構(gòu)造。玻璃濾器規(guī)格很多，5號(hào)孔徑2-5Am和6號(hào)孔徑小于2Am適用于過(guò)濾細(xì)菌。其優(yōu)點(diǎn)是吸附量少，但每次使用后要洗凈再用。清洗方法是：用水充分沖洗，然后浸于含1%KNO3的濃硫酸中24h,再用蒸餾水抽洗數(shù)次。在抽洗液中加入數(shù)滴BaCl2扎，至不出現(xiàn)BaSO4沉淀時(shí)，即表示巳洗凈。2過(guò)濾裝置圖2-2針頭式過(guò)濾器按圖2-1進(jìn)行安裝，為阻止空氣中細(xì)菌進(jìn)入濾瓶而在接管處塞入棉花、外用紙包好進(jìn)行121C濕熱滅菌20min。為加快過(guò)濾速度，一般用負(fù)壓抽氣過(guò)濾.即在自來(lái)水龍頭上裝一抽氣裝置，利用自來(lái)水流造成負(fù)壓。假設(shè)接真空泵進(jìn)行抽濾則速度更快。微量溶液過(guò)濾時(shí)，可用圖2-2的針頭式過(guò)濾

37、器。五、注意事項(xiàng)1. 稱(chēng)藥品用的牛角匙不要混用；稱(chēng)完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋：調(diào)pH時(shí)要小心操作，防止回調(diào)。2. 不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。3. 分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基在管瓶上，以免污染過(guò)的棉塞再引起試劑污染。4. 使用滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行，防止發(fā)生事故；滅菌時(shí)，操作者切勿擅自離開(kāi)，待壓力下降到零后，才可打開(kāi)鍋蓋。5干熱滅菌時(shí)電烘箱中物品不要擺得太擁擠，以免阻礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與電烘箱內(nèi)壁的鐵板接觸以防包裝紙烤焦起火。6過(guò)濾除菌時(shí)應(yīng)注意檢查過(guò)濾裝置各連接處是否漏氣，以防污染。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)基的名稱(chēng)、配方，并簡(jiǎn)述其配制過(guò)程，指明要點(diǎn)。

38、2.記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件（溫度、壓力）。七、問(wèn)題和思考1配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題?為什么?2培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?假設(shè)不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無(wú)菌檢查。3比較各種滅菌方法的原理及適用范圍。4高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅茵后不能驟然快速降落，并要在放凈鍋內(nèi)蒸汽才能打開(kāi)鍋蓋?實(shí)驗(yàn)四土壤微生物的稀釋別離、純化及無(wú)菌操作技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)從土壤中別離微生物的方法。2.掌握常用的別離純化微生物的操作技術(shù)。二實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1用稀釋法別離細(xì)菌、放線菌和霉菌。2用平板劃線法別離微生物。3斜

39、面接種及穿刺接種。二、實(shí)驗(yàn)原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程成為微生物的別離與純化。常用的別離純化方法有：?jiǎn)渭?xì)胞挑取法、平板劃線法和稀釋倒平板法。本實(shí)驗(yàn)利用稀釋倒平板法從土壤中別離細(xì)菌、放線菌和霉菌。基本原理為：將含有各種微生物的土壤懸液進(jìn)行稀釋后涂布接種到各種選擇培養(yǎng)基平板上，在不同條件下培養(yǎng)，從而使各類(lèi)微生物在各自的培養(yǎng)基上形成單菌落。單菌落是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體，即是一個(gè)純培養(yǎng)。三、實(shí)驗(yàn)材料和用具1. 菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和普通變形菌(Protuesvulgaris)斜面菌種。2. 培養(yǎng)基巳滅菌的牛肉膏、高氏1號(hào)、

40、PDA固體培養(yǎng)基各1瓶。3. 試劑及儀器無(wú)菌水(帶玻璃珠)、滅過(guò)菌的塑料管及槍頭、80%乳酸、10%酚液、95%乙醇。無(wú)菌培養(yǎng)皿、土壤樣品、天平、稱(chēng)量紙、藥勺、試管架、涂布器。四、操作步驟一土壤稀釋別離細(xì)菌、放線菌和霉菌1. 取土壤取表層以下5-10cm處的土樣放入滅菌的袋中備用，或放在4°C冰箱中暫存。2. 無(wú)菌操作制備土壤稀釋液1制備土壤懸液：稱(chēng)土樣1g,迅速倒入帶玻璃珠的無(wú)菌水瓶中(玻璃珠用量以充滿瓶底為最好),振蕩5-10min使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。嵌次各眠SaL郵芒試管均詁4“5就無(wú)曲水號(hào)蚌曹培捽基潁tU號(hào)擠養(yǎng)華牛戲新隠莽無(wú)圖4-1稀釋法別離土壤微生物操

41、作過(guò)程(2)稀釋?zhuān)河脽o(wú)菌移液管吸10-2的土壤懸液mL.放入mL無(wú)菌水中即為10-3稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3-10-8的稀釋液（圖2-1）。注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換用1支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于一次，以減少稀釋中的誤差。3.涂布法測(cè)定菌落數(shù)的方法1倒平板按無(wú)菌操作要求，在火焰旁操作（圖2-2），取融化并冷卻至不燙手的固體培養(yǎng)基（約50°C）,倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒量以鋪滿皿底為限，平放桌上待其充分凝固，備用。24圖4-3平板涂布菌圖4-2倒平板的方法2接種量和培養(yǎng)基細(xì)菌：取10-6、10-7兩管稀釋液各1

42、mL,分別接入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中，每個(gè)稀釋度接入兩個(gè)牛肉膏瓊脂平板中，涂布均勻。放線菌：取10-4、10-5兩管稀釋液，在每管中加入10%酚液5-6滴，搖勻，靜置片刻，然后分別從兩管中吸出0.2mL加入相應(yīng)高氏1號(hào)培養(yǎng)基平皿中，涂布均勻。霉菌：取10-2、10-3兩管稀釋液各0.2mL,分別接入相應(yīng)的PDA培養(yǎng)基中每100mL加入滅菌的乳酸1mL，涂布均勻。3培養(yǎng)將接種好的細(xì)菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于8-30C恒溫培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)1-2d放線菌培養(yǎng)5-7d,霉菌培養(yǎng)3-5d可用于觀察菌落，用于進(jìn)一步別離純化或直接轉(zhuǎn)接斜面。（二）平板劃線別離微生物1.劃線別離使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待別離的斜面菌種中沾取少量菌樣在相應(yīng)培養(yǎng)基平板中劃線別離，劃線的方法多樣，目的是獲得單個(gè)菌落，主要方法參見(jiàn)下列圖。S3-3爭(zhēng)犧聖鮭肓戀示韋屋剤?chǎng)残∈[嫌作：H.用轉(zhuǎn)聯(lián)班中，巨崔無(wú)劃退:.匚阻甘較黴肝譽(yù)悴卜趕餌耳敕，誦倉(cāng)劃撫心：妄蜓書(shū)種環(huán)，煤送耳劃干-反.3培養(yǎng)方法同“土壤稀釋別離”。三斜面接種和穿刺接種1. 斜面接種(1) 取新鮮固體斜面培養(yǎng)基.分別做好標(biāo)記(寫(xiě)上菌名、接種日期、接種人等)，然后用無(wú)菌操作方法，把待接菌種接入以上新鮮培養(yǎng)基斜