多糖結(jié)構(gòu)分析

1、多糖結(jié)構(gòu)研究方法多糖及其復(fù)合物是來自于高等動(dòng)、植物細(xì)胞膜和微生物細(xì)胞壁中的天然大分子物質(zhì)之一，自然界含量豐富，與人類生活緊密相關(guān)，對維持生命活動(dòng)起至關(guān)重要的作用。多糖和核酸、蛋白質(zhì)、脂類構(gòu)成了最基本的4類生命物質(zhì)。由于多糖的生物活性與多糖的結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，因此清楚認(rèn)識多糖的結(jié)構(gòu)是進(jìn)行多糖研究和利用的基礎(chǔ)。多糖結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，可以說是自然界中最復(fù)雜的生物大分子。從化學(xué)觀點(diǎn)來看，多糖結(jié)構(gòu)解析最大的難點(diǎn)就在于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。糖的結(jié)構(gòu)分類可沿用蛋白質(zhì)和核酸的分類方法，即多糖的結(jié)構(gòu)也可分為一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。與蛋白質(zhì)或核酸大分子相比，糖鏈的一級結(jié)構(gòu)“含義”要十分豐富。測定糖鏈的一

2、級結(jié)構(gòu)，要解決以下幾個(gè)問題：(1)相對分子質(zhì)量；(2)糖鏈的糖基組成，各種單糖組成的摩爾比；(3)有無糖醛酸及具體的糖醛酸類型和比例；(4)各單糖殘基的D-或L.構(gòu)型，毗喃環(huán)或咲喃環(huán)形式；(5)各個(gè)單糖殘基之間的連接順序；(6)每個(gè)糖苷鍵所取的a-或B.異頭異構(gòu)形式；每個(gè)糖殘基上羥基被取代情況：(8)糖鏈和非糖部分連接情況；(9)主鏈和支鏈連接位點(diǎn)：(10)糖殘基可能連接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基的類型等。多糖的二級結(jié)構(gòu)是指多糖主鏈間以氫鍵為主要次級鍵而形成的有規(guī)則的構(gòu)象，與分子主鏈的構(gòu)象有關(guān)，不涉及側(cè)鏈的空間排布；多糖的三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)是指以二級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，由于糖單位之間的非共價(jià)相互作

3、用，導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)在有序的空間里產(chǎn)生的有規(guī)則的構(gòu)象四。多糖結(jié)構(gòu)的分析手段很多。不僅有儀器分析法，如紅外、核磁共振、質(zhì)譜等，還有化學(xué)方法，如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應(yīng)等，以及生物學(xué)方法，如特異性糖苷酶酶切、免疫學(xué)方1質(zhì)譜(MS)由于MS法在糖鏈結(jié)構(gòu)分析中具有快速靈敏，樣品用量少、結(jié)構(gòu)信息直觀的特點(diǎn)而得到越來越廣泛的應(yīng)用。近年來各種軟電離技術(shù)的誕生，如快原子轟擊質(zhì)譜(FABMS),電噴霧質(zhì)譜(ESIMS),基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜(MALDI-MS)等，使得糖結(jié)構(gòu)分析的研究取得了日新月異的發(fā)展。(1) 快原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)FAB-MS是上世紀(jì)80年代初發(fā)

4、展起來的一種新的軟電離質(zhì)譜技術(shù)。其顯著區(qū)別于傳統(tǒng)質(zhì)譜之處在于樣品受加速原子或離子的轟擊，可直接在基質(zhì)溶液中電離。FAB-MS的引入使傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)難以分析的極性強(qiáng)，難揮發(fā)以及熱不穩(wěn)定的化合物不經(jīng)衍生化就可以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，而且對生物大分子的研究取得了重大突破。FAB-MS已被證明是分析糖結(jié)構(gòu)最為有力的方法之一，它不僅可以測定寡糖及其衍生物的分子量，而且可以測定聚合度高于30的糖的分子量。同時(shí)，F(xiàn)AB-MS還可以確定糖鏈中糖殘基的連接位點(diǎn)和序列，已廣泛用于糖類的分析。(2) 電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)ESI-MS是將溶液中分子轉(zhuǎn)變成氣相離子非常有效的手段，是目前最軟的一種電離方式。這種電離方式所

5、產(chǎn)生的分子離子往往帶有多電荷。因此ESI-MS可以測定的分子量范圍大大擴(kuò)展。對多糖而言，ESI-MS可以分析nh25個(gè)甚至更多單糖殘基組成的含有羧基或硫酸根等官能團(tuán)的多糖。近年來，ESI-MS已在多糖的結(jié)構(gòu)分析中顯示了強(qiáng)大的生命力。它能用于衍生化和非衍生化多糖的測定。ESI-MS易與HPLC,CE等技術(shù)聯(lián)用，大大提高了工作效率以及靈敏度和精確度，如ESI-MS與I-IPLC聯(lián)用分析寡糖及其衍生物?；|(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜(MALDI-MS)MALDI-MS于上世紀(jì)80年代末問世。由于技術(shù)的特點(diǎn)，這種離子化方式電離出的離子常用飛行時(shí)間(TOF)檢測器檢測，因此MALDI-MS常與TOF起稱為基

6、質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。它也是一種軟電離方式，產(chǎn)生的分子離子十分穩(wěn)定，不易裂解，所以適用于檢測大分子質(zhì)量的生物樣品。2紅外光譜(IR)紅外光譜(infraredspectroscopy，IR)是一種吸收光譜。因?yàn)榧t外光只能激發(fā)分子內(nèi)原子核之間的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級的躍遷，所以紅外吸收光譜是通過測定振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級躍遷的信息來研究分子結(jié)構(gòu)的。在紅外光譜圖中，縱坐標(biāo)一般用線性透光率作標(biāo)度，稱為透射光譜圖；也有采用非線性吸光度為標(biāo)度的，稱為吸收光譜圖。譜圖中的橫坐標(biāo)是以紅外輻射光的波數(shù)(鋤d)為標(biāo)度。較少采用波長(pm)為標(biāo)度。波長和波數(shù)的關(guān)系依照式為：v(cml)Xu

7、岬)=104。紅外輻射光的波數(shù)可分為近紅外區(qū)(10000-4000cm-1)、中紅外區(qū)(4000-400cm-1)和遠(yuǎn)紅外區(qū)(400-10cnl-1)。其中最常用的是中紅外區(qū)，大多數(shù)化合物的化學(xué)鍵振動(dòng)能級的躍遷發(fā)生在這一區(qū)域，因此主要研究中紅外區(qū)域的吸收光譜即分子的振動(dòng)光譜，可以對各種高分子材料進(jìn)行分析、測定。則對應(yīng)這些基團(tuán)的一些譜帶在這個(gè)化合物的取光譜中往往是最強(qiáng)的，明顯地顯示這個(gè)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特征。因此，對應(yīng)這些基團(tuán)的譜帶在其聚合物的譜圖中，常常是處于最顯著的地位，能夠很特征地反映該類聚合物的結(jié)構(gòu)和預(yù)示其存在。對于各種聚合物分子來說，含有的主要極性基團(tuán)是酸、酯、酰胺、酰亞胺、苯醚、脂肪醚和醇等

8、。除此之外，含有硅、硫、磷、氯和氟等雜原子的化合物也常具有較強(qiáng)的極性。紅外光譜作為“分子的指紋”廣泛用于分子結(jié)構(gòu)和物質(zhì)化學(xué)組成的研究。根據(jù)分子對紅外光吸收后得到譜帶頻率的位置強(qiáng)度、形狀以及吸收譜帶和溫度、聚集狀態(tài)等的關(guān)系便可確定分子的空間構(gòu)型，求出化學(xué)鍵的力常數(shù)、鍵長和鍵角。從光譜分析的角度看主要是利用特征吸收譜帶的頻率推斷分子中存在某一基團(tuán)或鍵，由特征吸收譜帶頻率的變化推測臨近的基團(tuán)或鍵，進(jìn)而確定分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，當(dāng)然也可由特征吸收譜帶強(qiáng)度的改變對混合物及化合物進(jìn)行定量分析。3拉曼光譜拉曼散射又稱拉曼效應(yīng)，是由印度物理學(xué)家拉曼于1928年首先發(fā)現(xiàn)并因此獲得1930年諾貝爾物-理獎(jiǎng)。拉曼效應(yīng)是能

9、量為hvo的光子同分子碰撞所產(chǎn)生的光散射效應(yīng)，也就是說，拉曼光譜是一種散射光譜。單色光束的入射光光子與分子相互作用時(shí)可發(fā)生彈性碰撞和非彈性碰撞，在非彈性碰撞過程中，光子與分子之間發(fā)生能量交換，光子不僅僅改變運(yùn)動(dòng)方向，同時(shí)光子的一部分能量傳遞給分子，或者分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能量傳遞給光子，從而改變了光子的頻率。簡單來說，散射分子的轉(zhuǎn)動(dòng)能級和振動(dòng)能級發(fā)生了變化是產(chǎn)生拉曼散射的原因，此時(shí)散射光子頻率不同于入射光子。因此，每種物質(zhì)的拉曼光譜也就是拉曼散射光譜都只與其自身的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，而與入射光的頻率無關(guān)。拉曼效應(yīng)普遍存在于一切分子中，無論是氣態(tài)，液態(tài)和固態(tài)。拉曼散射光譜對于樣品制備沒有特殊要求；對于樣品

10、數(shù)量要求比較少。拉曼散射最突出的優(yōu)點(diǎn)是采用光子探針，對于樣品無損傷探測，尤其適合對稀有或珍貴的樣品進(jìn)行分析，甚至可以用拉曼光譜檢測活體中的生物物質(zhì)。拉曼光譜與紅外光譜是相互補(bǔ)充的。在各種分子振動(dòng)方式中，強(qiáng)力吸收紅外光的振動(dòng)能產(chǎn)生高強(qiáng)度的紅外吸收峰，但只能產(chǎn)生強(qiáng)度較弱的拉曼譜峰反之，能產(chǎn)生強(qiáng)的拉曼譜峰的分子振動(dòng)卻產(chǎn)生較弱的紅外吸收峰。將兩者結(jié)合起來才能得到分子振動(dòng)光譜的完整數(shù)據(jù)，更好地解決分子結(jié)構(gòu)的分析問題。常用的拉曼光譜技術(shù)主要有：顯微共焦拉曼光譜技術(shù)、傅里葉變換拉曼光譜技術(shù)、共振增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)和表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)。(1)顯微共焦拉曼光譜技術(shù)顯微共焦拉曼光譜技術(shù)是將拉曼光譜分析技術(shù)與顯微分

11、析技術(shù)結(jié)合起來的一種應(yīng)用技術(shù)。通過兩根光導(dǎo)纖維將顯微鏡與拉曼光譜儀組合起來，實(shí)驗(yàn)時(shí)通過顯微鏡觀察，選擇有關(guān)分析所感興趣的待測樣品的部位，一根光導(dǎo)纖維將被激發(fā)的激光光束從光譜儀傳遞到顯微鏡待測樣品部位，入射激光通過顯微鏡聚焦后，照射到被測樣品上，另一根光導(dǎo)纖維將拉曼散射光輻射傳遞回光譜儀的有關(guān)部位傳遞回來的拉曼散射光信號被相干儀所調(diào)整，形成光譜信號。顯微共焦拉曼光譜技術(shù)可在不受周圍成分干擾的情況下，精確獲取微區(qū)內(nèi)的化學(xué)信息，如化學(xué)成分、晶體結(jié)構(gòu)、分子取向及分子間相互作用等。(2)傅里葉變換拉曼光譜技術(shù)傅里葉變換拉曼光譜一般采用波長1064nm的近紅外激光作為激發(fā)光源，分子的熒光不被激發(fā)，避免了許

12、多樣品拉曼光譜中的熒光干擾，近90的化合物可獲得拉曼光譜。(3) 共振增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)當(dāng)激發(fā)光的頻率接近或等于被測分子的電子吸收頻率(紫外可見光)時(shí)，某一條或幾條特定的拉曼線強(qiáng)度會急劇增加，甚至可以出現(xiàn)正常拉曼效應(yīng)中觀察不到的泛頻及組合振動(dòng)頻率的譜峰。共振拉曼光譜靈敏度高，可檢測低濃度和微量樣品，可研究大分子聚集體的局部結(jié)構(gòu)，已成為研究有機(jī)分子、離子、生物大分子甚至活體組織的有利工具。(4) 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)是一種新的表面測試技術(shù)，它可以在分子水平上研究材料分子的結(jié)構(gòu)信息，具有極高的靈敏度和選擇性等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。4X射線衍射(XRD)1912年德國物理學(xué)家勞厄(Laue)

13、等人根據(jù)理論預(yù)見，并用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了X射線具有波動(dòng)性，它與晶體相遇時(shí)能產(chǎn)生衍射現(xiàn)象，并證明了X射線的波動(dòng)性和晶體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的周期性，開創(chuàng)了x射線晶體學(xué)這一新領(lǐng)域。當(dāng)一束單色x射線入射到晶體時(shí)，由于這些規(guī)則排列的原子間距離與入射X射線波長有相同數(shù)量級，故能相互干涉，在某些特殊方向上產(chǎn)生X射線衍射，衍射線在空間分布的方位和強(qiáng)度，與晶體結(jié)構(gòu)相關(guān)。衍射線空問方位與晶體結(jié)構(gòu)的關(guān)系可用布拉格(Bragg)方程表示：2dsin0=nX，式中d為晶面間距，0為掠射角，n為反射級數(shù)，九為x射線波長。5核磁共振(NMR)核磁基振(縮寫為NMR),是指核磁矩不為零的核，在外磁場的作用振能提供有關(guān)化學(xué)結(jié)構(gòu)及分子動(dòng)力學(xué)的信息

14、，成為分子結(jié)構(gòu)解析的一個(gè)有力工具。核磁共振技術(shù)于1946年美國哈佛大學(xué)的波賽爾和斯坦福大學(xué)的布洛赫發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)過60多年的理論和技術(shù)上的發(fā)展，取得了非常驚人的成就，該領(lǐng)域已先后有6位科學(xué)家獲得4次諾貝爾獎(jiǎng)。現(xiàn)在核磁共振技術(shù)己經(jīng)廣泛應(yīng)用于物理，化學(xué)，醫(yī)學(xué)，生物等多個(gè)領(lǐng)域。尤其是現(xiàn)在用多核，多維核磁共振方法進(jìn)行的生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸等)的三維空間構(gòu)象和動(dòng)力學(xué)研究更加引人注目。近些年來，人們通過核磁共振或X射線晶體衍射技術(shù)解析了越來越多的蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。通過對這些結(jié)構(gòu)的分析，人們對生物大分子架構(gòu)，酶作用的活性位點(diǎn)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的界面等有了更深入的了解。但是，隨著了解的加深，人們同

15、時(shí)認(rèn)識到僅僅對靜態(tài)結(jié)構(gòu)的了解并不足以解釋蛋白質(zhì)在生理過程中的作用機(jī)理。因?yàn)槿S空間的結(jié)構(gòu)僅僅是基態(tài)的結(jié)構(gòu)，而在生理過程中蛋白質(zhì)分子更多的處于激發(fā)態(tài)，并同蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)特性密切相關(guān)。我們必須了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化，從而在分子的靜態(tài)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)間架起一座橋梁，這樣才能最終揭示蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。6 掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡簡稱為掃描電鏡，英文縮寫為SEM(ScanningElectronMicroscope)。SEM與電子探針(EPMA)的功能和結(jié)構(gòu)基本相同，但SEM一般不帶波譜儀(WDS)。它是用細(xì)聚焦的電子束轟擊樣品表面，通過電子與樣品相互作用產(chǎn)生的二次電子、背散射電子

16、等對樣品表面或斷口形貌進(jìn)行觀察和分析。現(xiàn)在SEM都與能譜(EDS)組合，可以進(jìn)行成分分析。所以，SEM也是顯微結(jié)構(gòu)分析的主要儀器，已廣泛用于材料、冶金、礦物、生物學(xué)等領(lǐng)域。掃描電鏡主要包括電子光學(xué)系統(tǒng)、掃描系統(tǒng)、信號檢測放大系統(tǒng)、圖象顯示和記錄系統(tǒng)、電源和真空系統(tǒng)等。其工作原理(圖11)：在高電壓作用下，從電子槍射出來的電子束往聚光鏡和物鏡聚焦成很細(xì)的高能電子束，在掃描線圈的作用下，在試樣的表面進(jìn)行幀掃描。電子束與試樣表面物質(zhì)相互作用產(chǎn)生背散射電子，二次電子等各種信息，探測器將這些信號接受，經(jīng)放大器放大去調(diào)節(jié)顯像管的柵極，并在熒光屏上顯示出襯度。掃描電鏡的主要性能與特點(diǎn)：放大倍率高，從幾十放大

17、到幾十萬倍，連續(xù)可調(diào)。分辨率高、景深大、景深大，圖像立體感強(qiáng)，樣品通常不需要作任何處理即可以直接進(jìn)行觀察，所以不會由于制樣原因而產(chǎn)生假象。這對斷口的失效分析特別重要。樣品制備簡單，可以是自然面、斷口、塊狀、粉體、反光及透光光片，對不導(dǎo)電的樣品只需蒸鍍一層20nm的導(dǎo)電膜。另外，現(xiàn)在許多SEM具有圖像處理和圖像分析功能。有的SEM加入附件后，能進(jìn)行加熱、冷卻、拉伸及彎曲等動(dòng)態(tài)過程的觀察。但掃描電鏡只能觀察物質(zhì)表面的微觀形貌，無法獲得物質(zhì)內(nèi)部的信息。7 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡是以波長很短的電子束做照明源，用電磁透鏡聚焦成像的一種具有高分辨本領(lǐng)，高放大倍數(shù)的電子光學(xué)儀器。測試的樣品要求厚度極薄

18、(幾十納米)，以便使電子束透過樣品。在真空條件下，電子束經(jīng)高壓加速后，穿透樣品時(shí)形成散射電子和透射電子，它們在電磁透鏡的作用下在熒光屏上成像。投射電子顯微鏡結(jié)構(gòu)如圖12所示91。透射電子顯微術(shù)在高分子研究中有著重要的應(yīng)用。它可用來觀察高分子晶體的形貌和結(jié)晶結(jié)構(gòu)，高分子多相體系的微觀相分離結(jié)構(gòu)，高分子材料的網(wǎng)絡(luò)，測定高分子的分子量分布和多孔高分子薄膜的微孔大小與分布，高分子材料的表面、界面和斷口、粘合劑的粘結(jié)效果以及聚合物涂料的成膜特性，還可用來使高分子晶體的晶格至高分子本身直接成像。透射電鏡由于入射電子透射試樣后，將與試樣內(nèi)部原子發(fā)生相互作用，從而改變其能量及運(yùn)動(dòng)方向。顯然，不同結(jié)構(gòu)有不同的相互作用。這樣，就可以根據(jù)透射電子圖象所獲得的信息來了解試樣內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。由于試樣結(jié)構(gòu)和相互作用的復(fù)雜性，因此所獲得的圖象也很復(fù)雜。它不象表面形貌那樣直觀、易懂。8 差示掃描量熱法(DSC)DSC是在程序控制溫度條件下，測量輸入給樣品與參比物的功率差與溫度關(guān)系的一