多組學(xué)聯(lián)合分析研究腸道微生物群促進(jìn)小鼠肝臟脂肪酸去飽和和延長(zhǎng)

1、多組學(xué)聯(lián)合分析研究腸道微生物群促進(jìn)小鼠肝臟脂肪酸去飽和和延長(zhǎng)題目：Thegutmicrobiotapromoteshepaticfattyaciddesaturationandelongationinmice多組學(xué)聯(lián)合分析研究腸道微生物群促進(jìn)小鼠肝臟脂肪酸去飽和和延長(zhǎng)期刊：NatureCommunications影響因子：12.353主要技術(shù)：轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、磷酸化蛋白質(zhì)組、脂質(zhì)組、16sRNA測(cè)序研究背景哺乳動(dòng)物腸道具有高度復(fù)雜的腸道微生物群落，在過(guò)去的幾十年中，許多小鼠模型已被用于研究腸道微生物群及其與宿主的關(guān)系。本研究整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，提出了

2、腸道微生物對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響。研究結(jié)果1 .轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析作者針對(duì)無(wú)菌小鼠模型（GF）和無(wú)特定病原體小鼠模型（SPF的肝臟和血漿樣品進(jìn)行多組學(xué)分析。其中，小鼠肝臟樣本的轉(zhuǎn)錄組使用微陣列芯片技術(shù)分析，總共分析了41174個(gè)探針，其中32308個(gè)可以定位到轉(zhuǎn)錄本，7769個(gè)探針顯著差異表達(dá)（3937個(gè)基因），GF和SPF之間的差異倍數(shù)最大達(dá)到14.3（圖1a）。通路富集分析揭示了GF小鼠中顯著富集的多個(gè)代謝通路，如藥物代謝、脂質(zhì)代謝（圖1b）。使用TMT技術(shù)對(duì)小鼠肝臟樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)分析，共鑒定到5875個(gè)蛋白質(zhì)，GF和SPF中存在顯著差異的蛋白數(shù)目為455（圖1c）,差異倍數(shù)最

3、高達(dá)3.7。差異表達(dá)最顯著的蛋白質(zhì)分另1J為L(zhǎng)3HYPDHCYP3A11、EPHXtACSF2SCD1,這幾個(gè)重要的蛋白質(zhì)均參與了特定的代謝過(guò)程，如亞油酸和視黃醇代謝（圖1d）。作者使用基因名稱合并了蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以便識(shí)別在兩個(gè)組學(xué)層中上調(diào)或下調(diào)的基因。兩次組學(xué)同時(shí)鑒定到4843個(gè)基因（1i）,其中2822個(gè)基因（約58%）為GF和SPF共有，984個(gè)基因在SPF中持續(xù)高表達(dá)（圖1e,Q2）,1,838個(gè)基因在GF中持續(xù)高表達(dá)（圖1e,Q4）。蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組基因功能富集分析顯示SPF小鼠中上調(diào)的基因（Q2）在脂質(zhì)代謝中參與的8個(gè)GO生物過(guò)程中有5個(gè)表現(xiàn)出富集（圖1f）,下調(diào)基因（Q4

4、）則沒有顯著的GO注釋。作者發(fā)現(xiàn)，影響脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，如ACLYFASNSCD1和ELOVL6在轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組中均存在差異表達(dá)。aceTiiwiptamFrywintdIand-M由o一a電Z.XEDCKWlbeHtFPARgndr犀rIwhMhon«n*wi->Dr.一«uLv4biPgCi>riiBevujghKUTn*hXum/金，!；Lfsnecsndaiia*LmMckMimaDdKrr電依K.w4rv«nd：ij1”UM1嗎ilL明Enjtefrjm=(QS：iIS圖1SPF和GF小鼠肝臟樣品的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析2 .磷酸化蛋白質(zhì)

5、組分析蛋白質(zhì)磷酸化在酶的活化和失活中起重要作用，因此，作者同時(shí)對(duì)GF和SPF小鼠的肝臟樣品進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組分析（磷酸化TMT）。在本次試驗(yàn)中，共鑒定到了5558種磷酸化肽段，其中1551個(gè)磷酸肽段，還可以檢測(cè)相應(yīng)的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組共同檢測(cè)到1527個(gè)磷酸肽段（圖1i）。作者研究發(fā)現(xiàn)363種蛋白質(zhì)在GF和SPF動(dòng)物之間具有顯著不同的磷酸化水平（圖1g）,其中，8種蛋白參與到了脂質(zhì)代謝ACOT1、FASZGPAM、LPIN1/2、PGRMC2PLIN3和SLCO1A43 .脂質(zhì)組學(xué)分析為了檢測(cè)脂肪酸和脂質(zhì)代謝中涉及的酶的變化是否導(dǎo)致GF小鼠中的脂質(zhì)水平改變，作者進(jìn)行了全面

6、的定量脂質(zhì)組分析。使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)共檢測(cè)到血漿與肝臟樣本中的20類525種脂質(zhì)，如脂肪酸（FA§、甘油磷脂、鞘脂和管醇等。作者研究發(fā)現(xiàn)肝臟樣本中的16種脂質(zhì)在GF和SPF小鼠之間差異顯著，血漿樣本中則15種脂質(zhì)差異顯著。最重要的是，作者發(fā)現(xiàn)SPF和GF小鼠之間存在從單不飽和脂質(zhì)向多不飽和脂質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)。SPF小鼠樣品中的棕桐油酸和含有單不飽和酰基鏈的甘油磷脂，含量高出1.5倍（圖2a-d）,而在GF小鼠中，多不飽和脂肪酸和甘油磷脂（如花生四烯酸）的含量較高。磷脂酰月1堿（PC,37%）、磷脂酰乙醇胺（PE,19%）、游離膽固醇（FC,11%）是肝臟中的主要

7、脂質(zhì)類別（圖2e）,鞘脂僅代表肝臟脂質(zhì)的一小部分，約占2%（圖2f）。血漿脂質(zhì)則以磷脂酰膽堿（PC,27%）、膽固醇酯（CE,54%）和游離膽固醇（FC,10%）為主（圖2g）,而且肝臟和血漿樣品中每種脂質(zhì)類別的總濃度沒有差異（圖2e,g）?？偠灾髡哒J(rèn)為以上數(shù)據(jù)顯示腸道微生物群影響肝臟和血漿中的特定脂肪酸和甘油MUFA),而GF磷脂物種譜。含有腸道微生物群的小鼠會(huì)較高比例的含有單不飽和脂肪酸（小鼠以脂質(zhì)飽和脂肪酸（SAFA和多不飽和脂肪酸（PUFA）為主。*31IF»-33-m：i*Nt1號(hào)昆號(hào)?L"甘"割星*.M-.此iy-aHyJidJd7耳aXm方X&

8、quot;SUK-JU.工2Hu?*«*#£*¥二二a二加«H甲一,丫一里一下ITUTH5-HEn一Ers.1:二士胃工EE圖2GF和SPF小鼠肝臟和血漿的定量脂質(zhì)組分析4 .組學(xué)數(shù)據(jù)重建脂肪酸代謝作者假設(shè)GF小鼠的脂肪酸飽和度和延伸能力與SPF小鼠不同，導(dǎo)致肝臟甘油磷脂酰基鏈譜改變。因此，作者重建了脂肪酸代謝途徑并整合了磷酸化蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組，系統(tǒng)地概述肝臟脂質(zhì)代謝過(guò)程（圖3a,b）。作者在3個(gè)特定的脂肪酸轉(zhuǎn)化步驟中觀察到GF和SPF小鼠之間的顯著差異：（I）借助ACACA/B和FASN從乙酰-CoA從頭合成脂肪酸的過(guò)程（圖3a）;（II）通

9、過(guò)SCD1將棕桐酸酯（FA16:0）去飽和為棕桐油酸酯（FA16:1n-7）（圖3a）;（III）通過(guò)ELOVL5（圖4b）將FA18:3n-6延伸至FA20:3n-6（圖3b）。在所有步驟中，SPF具有較高值。為了支持（II）和（III）,作者將脂肪酸產(chǎn)物/前體比率與相應(yīng)的mRNA或蛋白質(zhì)豐度相關(guān)聯(lián)。如圖3d所示，SCD1表達(dá)與16:1n-7/FA16:0比率（mRNA:R?=0.93;p?<0.00002蛋白質(zhì)：R?=0.94;p?<0.00005強(qiáng)相關(guān)，ELOVL5表達(dá)與20:3n-6/18:3n-6的比率（mRNA:R?=0.79;p?<0.002;蛋白質(zhì)：未檢測(cè)到）

10、強(qiáng)相關(guān)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)脂肪酸部分的反應(yīng)比（產(chǎn)物/前體水平）與PC和LPC物種的相應(yīng)去飽和度和伸長(zhǎng)指數(shù)高度相關(guān)（圖3e）,表明改變的FA代謝過(guò)程清楚地反映在?；?。FA1H；ZIfI尸aidedn-eFA2Q3XF昌183門7FMQ:gZ出笈府*TCD0Tg5s4Cl)fASZOFA2Z.InT尸廢9*XFwsr?-a心（JFA24:1FF-i產(chǎn)同電4n7卜必重”3hc工4m<irjiiiMKrtrrinrtfArmniRg曲mPTK和6l,gn制陶,FQA電FAEfl35甲Icpd5刖的To-o025MGQ&圖3多組學(xué)數(shù)據(jù)重建脂肪酸代謝途徑5 .基于脂肪酸譜的綜合分類為了獲得腸

11、道微生物群特異性調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過(guò)程的進(jìn)一步證據(jù)，作者利用短期抗生素（氨茉青霉素（A）、萬(wàn)古霉素（V）、甲硝陛（M）、或萬(wàn)古霉素（V）和甲硝陛（M）的組合）處理SPF的腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)，GC-MS定量肝臟脂肪酸譜，作者發(fā)現(xiàn)通過(guò)FA160FA20:3n-6、FA20:4n-6和FA22:6n-3進(jìn)行分類，既能清楚地將GF與SPF小鼠區(qū)分開（圖4a,b）,也可將不同抗生素處理與未處理的小鼠區(qū)分開（圖4c）。Scd1和日ovl5的mRNA表達(dá)水平明顯遵循分類評(píng)分的趨勢(shì)，低評(píng)分樣本有低表達(dá)水平（圖4d）。這些結(jié)果支持了腸道微生物群影響脂肪酸代謝代謝，特別是由SCD1和ELOVL5產(chǎn)生的脂肪酸（圖3a,b

12、;反應(yīng)II和III）。ato-TTingBGF史id息日£r&aiEmen1E4CN|口a口sdyUGEIDIPBJIdAUC=0-K0.30-02fr-0.20015'0.1003,0.00-0.01o-0d!ol*mxii<za:E21四由r500-CcMVVMTr&aEmentC<>MVWTreatmentrrvioMKtkxWMei1尸中事0.頓T：CfiMVEJVMhndhtstoonsmiOTL-32：OostndLJT1s?p.1S4.5%)0.6-s%4'：J國(guó)wv.vuKirwrfjraafyoities屈.1%)P

13、eQQQQH配tratHCtEFj-r-J-i!*4K3gri*3lw1?V-Zkrfcnrfaoatcra3司eMcijmraiDchBcteriiLJnknovrjbarlEFa8WVVM圖4抗生素對(duì)腸道微生物種類的影響6 .腸道微生物群組成分析為了確定抗生素對(duì)腸道微生物群多樣性和組成的影響，作者通過(guò)高通量測(cè)序分析了16SrRNA基因的V3-V4擴(kuò)增子。本次實(shí)3共檢測(cè)總到376071個(gè)序列，代表172個(gè)OTU（每個(gè)樣品99±49OTU）。所有抗生素均影響“多樣性（圖4e,f）,與單獨(dú)的M相比，V和VM的組合具有特別顯著的影響，3多樣性分析揭示了V和VM樣品的顯著聚集，這些樣品與對(duì)

14、照組分開，但是彼此并不分離（圖4g）,受抗生素影響最大的OUT來(lái)自于厚壁菌和擬桿菌。文章小結(jié)宿主的腸道微生物與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)之間的相互作用，與宿主的生理學(xué)機(jī)能和代謝疾病高度相關(guān)。本研究整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，提出了腸道微生物促進(jìn)肝臟脂質(zhì)代謝的多組學(xué)觀點(diǎn)。微生物可以通過(guò)硬脂酰輔酶A脫氫酶1（SCD1）誘導(dǎo)單不飽和脂肪酸生成，并通過(guò)脂肪酸延長(zhǎng)酶5誘導(dǎo)多不飽和脂肪酸延伸，導(dǎo)致甘油磷脂?；湻植嫉娘@著改變。解析文獻(xiàn)AlidaKindt,GerhardLiebisch,etal.Thegutmicrobiotapromoteshepaticfattyaciddesatur

15、ationandelongationinmice.NatureCommunications,2018,DOI:10.1038/s41467-018-05767-4參考文獻(xiàn)1. Rappsilber,J.,Mann,M.&Ishihama,Y.Protocolformicro-purification,enrichment,pre-fractionationandstorageofpeptidesforproteomicsusingStageTips.Nat.Protoc,2007,2,1896T906.2. Ruprecht,B.etal.Evaluationofkinaseactivityprofilingusingchemicalproteomics.ACSChem.Biol.2015,10,27432752.3. Bartram,J.etal.Accuratesampleassignmentinamultiplexed,ultrasensitive,high-throughputsequencingassayforminimalr