基因工程的基本操作步驟學習教案

1、會計學1基因工程基因工程(jyn gngchng)的基本操作步驟的基本操作步驟第一頁，共42頁?；蚬こ袒蚬こ?jyn gngchng)(jyn gngchng)基本操作基本操作的四個步驟的四個步驟1 1、目的、目的(md)(md)基因的獲取基因的獲取2 2、基因、基因(jyn)(jyn)表達載體的構建表達載體的構建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定第1頁/共41頁第二頁，共42頁。一、目的基因一、目的基因(jyn)(jyn)的的獲取獲取1 1、目的、目的(md)(md)基因主要是指基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結構編碼蛋白質(zhì)

2、的結構(jigu)(jigu)基因基因也有一些具有調(diào)控作用的因子也有一些具有調(diào)控作用的因子2 2、獲取目的基因的方法、獲取目的基因的方法（1 1）從基因文庫中獲?。幕蛭膸熘蝎@取（2 2）利用）利用PCRPCR技術擴增技術擴增（3 3）人工合成）人工合成_第2頁/共41頁第三頁，共42頁。( (一一) )從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取(huq)(huq)目的基因目的基因 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片斷，片斷，導入到受體菌的群體中，各個導入到受體菌的群體中，各個(gg)(gg)受體菌受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文分別含有這種生物的不同基

3、因，稱為基因文庫。庫。2.2.基因文庫的分類基因文庫的分類(fn li):(fn li):種種類類基因組文庫：基因組文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部部分分基因，如：基因，如：cDNAcDNA文庫文庫第3頁/共41頁第四頁，共42頁。限制酶限制酶拼接到載體上拼接到載體上導入受體細胞擴增導入受體細胞擴增 基因組文庫基因組文庫(wnk)3 3. .基因文庫的構建方法基因文庫的構建方法第4頁/共41頁第五頁，共42頁。提取生物提取生物(shngw)(shngw)某發(fā)育時期某發(fā)育時期的的mRNAmRNA單單 鏈鏈DNAD

4、NA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈CDNACDNA( (只含該生物部分只含該生物部分(b fen)(b fen)基因基因) )與載體與載體(zit)(zit)連接導入到受體菌群儲連接導入到受體菌群儲存存 cDNAcDNA文庫文庫第5頁/共41頁第六頁，共42頁?；蚪M文庫基因組文庫(wnk)(wnk)和和cDNAcDNA文庫文庫(wnk)(wnk)比較比較第6頁/共41頁第七頁，共42頁。原核細胞的基因原核細胞的基因(jyn)(jyn)結構結構( (補充內(nèi)容補充內(nèi)容）非編碼非編碼(bin m)(bin m)區(qū)區(qū)非編碼非編碼(bin m)(bin m)區(qū)區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游

5、編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點啟動子啟動子終止子終止子不編碼蛋白質(zhì)。不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì)：編碼蛋白質(zhì) , ,連續(xù)不間斷連續(xù)不間斷編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細胞細胞的的 基因基因結構結構調(diào)控遺傳信息表達調(diào)控遺傳信息表達, ,上上 游有啟動子，下游有終止子游有啟動子，下游有終止子第7頁/共41頁第八頁，共42頁。真核細胞的基因結構真核細胞的基因結構(jigu)(jigu)（補充內(nèi)容（補充內(nèi)容）編碼編碼(bin (bin m)m)區(qū)區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結合結合(jih)(jih)位點位點內(nèi)含子內(nèi)

6、含子 外顯子外顯子 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 真核細真核細胞的胞的 基因結基因結構構編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用有調(diào)控作用, ,上游有啟動子，下游上游有啟動子，下游有終止子有終止子非編碼序列：非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子第8頁/共41頁第九頁，共42頁。原核細胞與真核細胞的基因原核細胞與真核細胞的基因(jyn)(jyn)結構結構比較比較思考思考(sk(sko)o)編碼相同編碼相同(xin tn)(xin tn)

7、數(shù)目氨基酸的蛋數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結構一白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？樣長嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼非編碼第9頁/共41頁第十頁，共42頁。第10頁/共41頁第十一頁，共42頁?；蚪M文庫基因組文庫(wnk)(wnk)和和cDNAcDNA文庫文庫(wnk)(wnk)比較比較第11頁/共41頁第十二頁，共42頁。依據(jù)：目的依據(jù)：目的(md)(md)基因的有關信息基因的有關信息如：根據(jù)基因的核苷酸序列如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色體上的位置基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋

8、白質(zhì)等特性基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性4.4.從基因從基因(jyn)(jyn)文庫中得到目的基因文庫中得到目的基因(jyn)(jyn)的的方法方法第12頁/共41頁第十三頁，共42頁。概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復制復制_的核酸合成的核酸合成(hchng)(hchng)技術技術 條件條件(tiojin)(tiojin)：_、_、_ _ 、 _ _ 、_ _ 原理原理(yunl)(yunl)：_聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復制復制模板模板DNA DNA 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸DNADNA引物引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)

9、定DNADNA聚合酶聚合酶（二）（二）利用利用PCRPCR擴增目的基因擴增目的基因方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增循為擴增循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結果：結果：_指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)使目的基因的片段在短時間內(nèi)大量大量擴增擴增第13頁/共41頁第十四頁，共42頁。過程過程(guchng)(guchng)a a、變性（、變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂斷裂(dun li)(dun li)，形成，形成_b b、復性（復性、復性（復性55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低）：系統(tǒng)溫度降低(ji

10、ngd)(jingd)，引，引 物與物與DNADNA模板結合，形成局部模板結合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成與模板互補的合成與模板互補的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈前提前提_ 有有一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列第14頁/共41頁第十五頁，共42頁。蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列(xli)(xli)mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列(xli)(xli)結構基因結構基因(jyn)(jyn)的核的核苷酸序列苷酸序列推測推測推測推測目的基因目的基因化學合成化

11、學合成（DNADNA合成儀）合成儀）（三）人工合成（三）人工合成若基因若基因_，核苷酸序列，核苷酸序列_ _ ，可用此法。，可用此法。較小較小已知已知（化學合成法）（化學合成法）第15頁/共41頁第十六頁，共42頁。mRNAmRNAcDcDNANA單鏈單鏈cDNAcDNA分子分子(fnz)(fnz)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶（三）人工合成（三）人工合成(rn n h (rn n h chn)chn)（反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄(zhun l)(zhun l)法）法） 與直接提取的與直接提取的DNADNA相比相比cDNAcDNA不含有不含有_ 和和_等結構。等結構。第16頁/共41頁第十七頁，

12、共42頁。第17頁/共41頁第十八頁，共42頁。a a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在(cnzi)(cnzi) 并遺傳給子代并遺傳給子代b b、同時使目的基因、同時使目的基因(jyn)(jyn)能表達和發(fā)揮能表達和發(fā)揮作用作用1 1、基因表達載體、基因表達載體(zit)(zit)的構建目的的構建目的二二、表達載體的構建表達載體的構建第18頁/共41頁第十九頁，共42頁。2 2、基因表達、基因表達(biod)(biod)載體的載體的組成：組成： 目的目的(md)基因基因 標記標記(bioj)基因基因 啟動子啟動子 終止子終止子第19頁/共41頁第二十頁，共42頁。

13、啟動子：位于基因的首端的啟動子：位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識別和結合的部聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的終止子：位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，能終片斷，能終止止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標記標記(bioj)(bioj)基因的作用是基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來基因的細胞篩選出來第20頁/共41頁第二十

14、一頁，共42頁。用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出口，露出_。用用_切斷目切斷目 的基因的基因(jyn)(jyn)，使其產(chǎn)，使其產(chǎn)生生_ _ _。3 3、基因、基因(jyn)(jyn)表達載體的構建表達載體的構建將切下的目的基因片段插入將切下的目的基因片段插入(ch r)(ch r)質(zhì)粒的質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNA DNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同 ( (插入式插入式) )第21頁

15、/共41頁第二十二頁，共42頁。用一定的用一定的_切割切割(qig)(qig) 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出口，露出_。用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成，形成(xngchng)(xngchng)了一個了一個重組重組 DNA DNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制限制(xinz(xinzh)h)酶酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同用同種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，使之露出

16、用同種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，使之露出相同的相同的黏性末端黏性末端，在加入，在加入DNADNA連接酶。連接酶。第22頁/共41頁第二十三頁，共42頁。三、將目的三、將目的(md)(md)基因?qū)胧荏w細基因?qū)胧荏w細胞胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参镏参?zhw)(zhw)細胞細胞將目的將目的(md)(md)基基因?qū)胍驅(qū)雱游锛毎麆游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法CaCa+ +處理法處理法第23頁/共41頁第二十四頁，共42頁。1 1、將目的基因、將目的基因(jyn)(jyn)導入

17、植物細胞的方導入植物細胞的方法：法：易感染易感染(gnrn)(gnrn)雙子葉植物和裸子植物雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染(gnrn)(gnrn)能力能力原理原理(yunl)(yunl)：農(nóng)桿菌特點：農(nóng)桿菌特點：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法TiTi質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNAT-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的，并整合到受體細胞染色體的DNADNA上。上。第24頁/共41頁第二十五頁，共42頁。過程過程(guchng)：1、將目的、將目的(md)基因插入到基因插入到Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA上上2、將重組、將重

18、組(zhn z)Ti質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌3、用農(nóng)桿菌感染植物體細胞、用農(nóng)桿菌感染植物體細胞第25頁/共41頁第二十六頁，共42頁。（2 2）基因）基因(jyn)(jyn)槍法槍法第26頁/共41頁第二十七頁，共42頁。第27頁/共41頁第二十八頁，共42頁。方法：顯微方法：顯微(xin wi)注射法注射法程序：程序：取卵取卵顯微顯微(xin wi)(xin wi)注射注射受精卵受精卵早期胚胎培養(yǎng)早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植第28頁/共41頁第二十九頁，共42頁。3 3、將目的基因、將目的基因(jyn)(jyn)導入微生物細導入微生物細胞胞用用Ca2+Ca2+處理處理(chl)(chl)

19、細胞細胞 原核生物原核生物(shngw)特點：特點： 繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法：表達載體與感受態(tài)細胞混合表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸收DNADNA分子分子感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞第29頁/共41頁第三十頁，共42頁。四、目的基因四、目的基因(jyn)的檢測與鑒定的檢測與鑒定大腸桿菌大腸桿菌第30頁/共41頁第三十一頁，共42頁。四、目的基因四、目的基因(jyn)的檢測與鑒的檢測與鑒定定個體水平的鑒定個體水平的鑒定第31頁/共41頁第三十二頁，共42頁。四、目的基因四、目的基因(jyn)的檢測與鑒定的檢測與鑒定個體水平個體水平(shupng)(shupng)的鑒定（受體是否表現(xiàn)出相應的鑒定（受體是否表現(xiàn)出相應性狀）性狀）第32頁/共41頁第三十三頁，共42頁。 含有目的含有目的(md)(md)基因基因 單鏈單鏈 標記標記(bioj)(bioj)放射性同位素或放射性同位素或熒光熒光第33頁/共41頁第三十四頁，共42頁。第34頁/共41頁第三十五頁，共42頁。第35頁/共41頁第三十六頁，共42頁。第36頁/共41頁第三十七頁，共42頁。第37頁/共41頁第三十八頁，共42頁。