常用的單克隆抗體檢測(cè)方法

1、通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，在雜交瘤制備完成后，需要對(duì)抗體進(jìn)行一個(gè)檢測(cè)，本文介紹了幾種常用的抗體檢測(cè)的方法（1）免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對(duì)底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng)，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。器材和試劑a、包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml ， 0.2mol/L NaHCO3 17ml混合， 再加 75ml 蒸餾水， 調(diào) PH 至 9.6。 Tris-HCl 緩沖液 （ PH8.0， 0.02mol/L ） ：取0.1mol/L Tris 100ml ， 0.1mol/L HCl 58

2、.4ml 混合，加蒸餾水至1000ml。 b、洗滌緩沖液（PH7.2 的 PBS） ：KH2PO4 0.2g， KCl 0.2g， Na2HPO4· 12H2O 2.9g， NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。 c、稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA） 0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。 d、酶反應(yīng)終止液（2mol/LH2SO4） ： 取蒸餾水178.3ml， 滴加濃硫酸（ 98%） 21.7ml。 e、底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取 0.2mol/LNa2HPO4 25.7ml ， 0

3、.1ml/L 檸檬酸 24.3ml， 再加 50ml 蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩(wěn)定，易形成沉淀，因此一次不宜配制過(guò)多。f、底物使用液：OPD 底物使用液（測(cè)490nm 的 OD 值） ： OPD 5mg，底物緩沖液10ml， 3% H2O20.15ml。 TMBS 或 TMB 底物使用液（測(cè)450nm 的 OD 值） ：TMBS 或 TMB（ 1mg/ml） 1.0ml， 底物緩沖液10ml， 1% H2O225ul。 ABTS 底物使用液（測(cè) 410nm 的 OD 值） ： ABTS 0.5mg ，底物緩沖液1ml ， 3% H2O2 2ul 。 g、抗體對(duì)照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)

4、上清作為陰性對(duì)照，以免疫鼠血清作為陽(yáng)性血清。h、抗原： 可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細(xì)胞或全菌抗原。淋巴細(xì)胞等懸液。i、酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo)SPA或其他類(lèi)似試劑。j、 細(xì)胞固定液：-20丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg， KH2PO4 500mg，蒸餾水 150ml ， 丙酮 225ml， 甲醛 125ml； 或丙酮-甲醛溶液（ 1；1） ；或-20甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：40 孔、 96 孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。l、 酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。m、吸管、加樣器及水浴箱、離心機(jī)等?？扇苄钥乖拿嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA） a、 純化抗原用包

5、被液稀釋至1-20ug/ml。b、以50-100ul/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4過(guò)夜或37吸附 2 小時(shí)。c、棄去孔內(nèi)的液體，同時(shí)用洗滌液洗3 次， 每次3-5 分鐘，拍干。d、每孔加200ul 封閉液4過(guò)夜或37封閉 2 小時(shí)；該步驟對(duì)于一些抗原，可省略。e、洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可-20或4保存?zhèn)溆?。f、每孔加50-100ul待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；37孵育1-2 小時(shí)； 洗滌， 拍干。g、 加酶標(biāo)第二抗體，每孔 50-100ul， 37孵育1-2 小時(shí)，洗滌，拍干。h、加底物液， 每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul， 37 10-30 分鐘。i

6、、 以 2mol/L H2SO4 終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值。 j、結(jié)果判定：以P/N2.1 ，或PN+3D 為陽(yáng)性。若陰性對(duì)照孔無(wú)色或接近無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。全菌抗原的ELISASa、新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸餾水或 PBS 懸浮，并調(diào)整細(xì)菌濃度至1× 108 個(gè) /ml 。必須指出，對(duì)于人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。b、每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO395ml+25%戊二醛溶液5ml） ， 37作用2小時(shí)，蒸餾水洗滌3 次；加上述細(xì)菌懸液50ul/孔；37-56烘干；每孔加200ul封閉液 4過(guò)

7、夜或37 2 小時(shí)封閉。c、步驟b 也可采用先每孔加 50ul 細(xì)菌懸液，37 -56烘干，然后用-20預(yù)冷的無(wú)水甲醇室溫作用15 分鐘，蒸餾水洗滌3 次；每孔加200ul封閉液 4過(guò)夜或37 2 小時(shí)封閉。d、洗滌液洗3 次；此時(shí)包被板可在-20或 4保存?zhèn)溆?。e、以下步驟同上法。用全細(xì)胞抗原的ELISAa、按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，收獲感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PBS 制成適當(dāng)濃度懸液。b、淋巴細(xì)胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上，1500rpm 離心30 分鐘，吸取界面細(xì)胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液。該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì)胞，離心后加0

8、.83%的氯化銨溶液，室溫10 分鐘，洗滌一次即可。將該細(xì)胞懸液稀釋至適當(dāng)濃度。c、每孔加100ul 上述 a 或 b 的細(xì)胞懸液，使每孔含細(xì)胞5× 104 個(gè)； 1500r/min 15 分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮-甲醇（ 1： 1） 4固定10 分鐘；可4或-20保存?zhèn)溆谩、以下步驟同上法?？贵w捕捉ELISA 試驗(yàn)本法用抗BALB/c小鼠 Ig的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb ，再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA 中較理想的一種；其操作步驟如下：a、以適當(dāng)濃度的純化抗鼠Ig 抗體包被酶標(biāo)板，每孔加 100ul， 372 小時(shí)或4過(guò)夜。

9、b、洗滌、拍干后加待測(cè)的McAb 樣品，371-2 小時(shí)。c、 洗滌后加適量的抗原，371-2 小時(shí)。d、洗滌后加入酶標(biāo)多克隆抗體，371-2 小時(shí)。洗滌后加底物顯色，判定結(jié)果。ABC-ELISA 試驗(yàn) ABC-ELISA 是在常規(guī)ELISA 原理的基礎(chǔ)上，增加了生物素（Biotin ）與親和素（ Avidin ）間的放大作用。親和素有4 個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素有高度的親合力。生物素很易與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。因此，結(jié)合了酶的親和素與結(jié)合有抗體的生物素發(fā)生反應(yīng)即起到了多極放大作用。其操作步驟如下：a、 已知抗原的包被及加待檢 McAb 樣品，同間接ELISA 試驗(yàn)。b、加生物素化抗鼠Ig 抗體， 每

10、孔 100ul， 371 小時(shí)； 洗滌。c、 加酶標(biāo)親和素，每孔 100ul， 3730 分鐘洗滌；加底物顯色，判定結(jié)果。Dot-ELISA 試驗(yàn)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（Dot-ELISA ）是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為固相載體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的免疫檢測(cè)手段。該法采用不溶性底物（如DAB ，或4-氯萘酚或AgNO3 等） ，其與相應(yīng)標(biāo)記物（HRP、 AP、膠體金）作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀著色，從而易于判定結(jié)果。根據(jù)所用的標(biāo)記物不同，可分為HRP 免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、AP 免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和免疫金銀斑點(diǎn)法等。其操作步驟大致如下：a、 將抗原液 2-5ul 點(diǎn)加于纖維素膜上，室溫37干燥。b、 將纖維膜浸

11、入封閉液中，3730 分鐘。c、用洗滌液洗2 次，吸干后加待檢 McAb 樣品，37 1 小時(shí)；用洗滌液振蕩洗滌三次，每次 5 分鐘，加HRP 或 AP 或膠體金標(biāo)記的抗鼠Ig 抗體，37作用30 分鐘。d、同法洗滌，吸干，用新配的相應(yīng)底物溶液顯色，然后水洗終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。免疫組化染色法該法主要用于檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞抗原成分的McAb ，常用的方法是間接免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)（IIP， indirectimmunoperoxidase） 及 APAAP 技術(shù)。 其結(jié)果用光鏡或倒置顯微鏡檢查。（ 2）免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可用于多種抗原的雜交瘤抗體檢測(cè)，如細(xì)胞性抗原（包括細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞）、感染細(xì)胞中

12、的病毒抗原和膜抗原等。其操作簡(jiǎn)單、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優(yōu)點(diǎn)，在McAb 的篩選與鑒定上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。器材和試劑a、供檢測(cè)抗體用的抗原制備固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液。b、 PBS（ PH7.2， 0.01mol/L ）c、待檢的McAb 樣品。 d、冷丙酮e、 FITC（異硫氰酸熒光素）或 TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明熒光素）標(biāo)記的抗鼠Ig 抗體等f(wàn)、熒光顯微鏡，磁力攪拌器，離心機(jī)，水浴箱等。間接免疫熒光法a、固定細(xì)胞片的制備：生長(zhǎng)在蓋片上的細(xì)胞（接種或未接種病毒），可直接收獲蓋片，在PBS 中洗滌， 用4丙酮固定10 分鐘， 空氣干燥，置密封容器于-20保存?zhèn)溆?；單?xì)胞懸液

13、可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。細(xì)胞涂片的制備：將10ul 細(xì)菌懸液（1× 108 個(gè) /ml）涂抹7× 21mm 蓋片上， 自然干燥后，用 -20 丙酮固定10-15 分鐘，于 -20保存?zhèn)溆?。b、蓋片在去離子水中濕潤(rùn)后置架上滴加10-20ul 雜交瘤上清或其他待檢樣品；設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照；置 37水浴孵育0.5-1 小時(shí)。c、取出蓋片置PBS 中用磁力攪拌器洗滌15 分鐘。d、蓋片置架上，滴加工作濃度的抗鼠Ig 的熒光抗體10-20ul ， 37孵育0.5-1 小時(shí)。e、同法洗滌15 分鐘； 取出蓋片，用延緩熒光碎滅的封載劑（如緩沖甘油，9 份甘油加1 份 PBS）封

14、于干凈載玻片上。f、光顯微鏡上觀察，陽(yáng)性結(jié)果可見(jiàn)特異性熒光（FITC 為黃綠色熒光，TRITC為桔紅色熒光）。 g、細(xì)胞固定片的制備，也可改在培養(yǎng)板孔中進(jìn)行，其余步驟同上，在觀察結(jié)果時(shí)，將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下，判斷標(biāo)準(zhǔn)不變。細(xì)胞的膜熒光染色完整的活細(xì)胞的細(xì)胞膜，抗體不能透過(guò)。如果細(xì)胞在4操作，則熒光染色僅限于細(xì)胞膜。必須注意死細(xì)胞常以非特異性方式吸附大量熒光抗體，因此試驗(yàn)過(guò)程中要保證細(xì)胞的高活力?；罴?xì)胞的膜熒光染色大致步驟如下：a、 制備活性較好的細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至107 個(gè) /ml 。 b、在小試管（5× 50mm）中加入 100ul 細(xì)胞懸液，再加入100ul 待檢 Mc

15、Ab 的樣品，混勻，4作用30-90 分鐘。c、用洗滌液（PBS 900ml ，小牛血清 50ml ， 4%NaN3 50ml ）洗二次，每次加洗滌液1-5ml，1000r/min 離心 5 分鐘，棄上清。加入100ul 熒光抗體，4作用 30-90 分鐘。d、同法洗滌，將細(xì)胞重新懸于20-30ul 含10%甘油和10-100ug 苯二胺 /ml 的溶液中；滴加于載玻片上，加蓋片封載。e、立即在熒光顯微鏡上檢查。f、細(xì)胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定，立即檢查，或至少在4可保存一周。（ 3）間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)又稱(chēng)被動(dòng)血凝試驗(yàn)（PHA） ，是目前應(yīng)用較廣的檢測(cè)方法之一。本試驗(yàn)是以包

16、被可溶性抗原的紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，當(dāng)被檢抗體與包被在紅細(xì)胞上的抗原產(chǎn)生特異性反應(yīng)時(shí)，導(dǎo)致紅細(xì)胞呈凝集現(xiàn)象?？梢?jiàn)，該法具有靈敏、快速、容易操作和無(wú)需昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)，而且經(jīng)改用醛化紅細(xì)胞以后，克服原來(lái)重復(fù)性差的缺點(diǎn)。器材和試劑a、綿羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。b、緩沖液：PBS（ PH7.2） ；醋酸緩沖液。c、甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝劑等。d、血凝板，振蕩器等。多糖抗原的間接血凝試驗(yàn)a、甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：無(wú)菌采集綿羊頸靜脈血50ml， 用枸櫞酸鈉作抗凝劑；用 5 倍于紅細(xì)胞壓積的PH7.2 PBS（ Na2HPO4· 12H2O 3.58g， KH2PO40.41g， Na

17、Cl 8.01g，蒸餾水1000ml）充分洗滌5次，每次1500r/min 5-10 分鐘，直至上清測(cè)定無(wú)蛋白質(zhì)（用飽和硫酸銨滴定上清，觀察有無(wú)白色沉淀）， 再以相同緩沖液配成25%紅細(xì)胞懸液；將 25%紅細(xì)胞懸液與20%甲醛以2.5： 1 的比例混勻， 37水浴作用2 小時(shí)，每15 分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏色逐漸由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?；以PH7.2 PBS 洗滌 4 次，每次 2000r/min 10 分鐘， 再以同樣的PBS制成 25%紅細(xì)胞懸液；其后，重復(fù)醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸液，加甲醛至0.3%防腐，4保存?zhèn)溆?。b、脂多糖抗原致敏甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：取脂多糖（

18、LPS） ，以0.2mol/L PH8.0 PB 液， 調(diào)整多糖濃度至120ug/ml， 然后100水浴處理1 小時(shí)；將冷卻至37的熱處理LPS 與 6%醛化紅細(xì)胞等量混合，37攪拌作用45分鐘；取出離心2000r/min 10分鐘，以0.01mol/L PH7.2 PBS 洗滌 4次；配制成4%致敏血球，分裝，保存于4備用，或凍干保存。c、 McAb 的篩選：取待測(cè) McAb 樣品 25ul， 加入 V 型微量血凝板孔中，同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照；再加入0.5-4%致敏紅血球懸液25ul，在振蕩器上混勻30 秒；置室溫或3730-60 分鐘觀察結(jié)果。陰性對(duì)照孔應(yīng)呈緊縮的圓點(diǎn)?？扇苄缘鞍卓乖拈g接血凝試驗(yàn)a、紅細(xì)胞醛化：采用雙醛法。采綿羊或人“O”型抗凝血，每次加10 倍于紅細(xì)胞壓積的PBS 洗滌 4-6 次，然后配成 8%紅細(xì)胞懸液；向此8%紅細(xì)胞懸液緩慢加入等量含有3%3%甲醛的PBS，于室溫緩慢攪拌17 小時(shí)；其后洗滌 3 次，配成20%雙醛化紅細(xì)胞懸液，加0.1% NaN3 防腐，4保存?zhèn)溆?。b、致敏紅細(xì)胞：取20%雙醛化紅細(xì)胞0.1ml，1500r