小鼠環(huán)磷酸腺苷cAMP酶聯(lián)免疫分析

1、小鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用。檢測范圍： 96T20pg/ml-480pg/ml使用目的：本試劑盒用于測定小鼠細胞質(zhì)中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量。實驗原理本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平。用純化的小鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，再與HRP標記的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的環(huán)磷酸腺苷(cAMP

2、)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中小鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度。 試劑盒組成 130倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶2酶標試劑6ml×1瓶8標準品（960pg/ml）0.5ml×1瓶3酶標包被板12孔×8條9標準品稀釋液1.5ml×1瓶4樣品稀釋液6ml×1瓶10說明書1份5顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張 6顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個標本要求 1標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行

3、試驗，可將標本放于-20保存，但應避免反復凍融2不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。480pg/ml5號標準品150l的原倍標準品加入150l標準品稀釋液240pg/ml4號標準品150l的5號標準品加入150l標準品稀釋液120pg/ml3號標準品150l的4號標準品加入150l標準品稀釋液60pg/ml2號標準品150l的3號標準品加入150l標準品稀釋液30pg/ml1號標準品150l的2號標準品加入150l標準品稀釋液2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加

4、樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50l，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40l，然后再加待測樣品10l（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置37溫育30分鐘。 4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標試劑50l，空白孔除外。 7. 溫育：操作同3。8. 洗滌：操作同5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50l，再加入顯色劑B50l，輕輕震蕩混勻，

5、37避光顯色15分鐘.10. 終止：每孔加終止液50l，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。操作程序總結：計算 以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 注意事項1試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。2濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。3各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6底物請避光保存。7嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為