MTT方法總結(jié)詳解

1、MT。法總結(jié)1. MTT原理MTT比色法是一種檢測細(xì)胞存活和增殖的方法，所用的顯色劑是一種能接 受氫原子的化合物MTT,原理是，活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的 MTT還原為藍(lán)紫色的結(jié)晶formazan(甲瓚)后者的產(chǎn)量與活細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)。 formazan可用DMSO、無水乙醇或酸化異丙醇等溶解， 在酶標(biāo)儀上以波長490nm 和570nm處進(jìn)行比色。所檢測的OD值的大小可反應(yīng)細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱。 2優(yōu)點(1)有靈敏度高，重復(fù)性好，(2)操作簡便、經(jīng)濟(jì)、快速、易自動化的優(yōu)點，(3)而且沒有3HTdR摻入試驗放射性污染，(4)還可以減少如細(xì)胞計數(shù)法、軟瓊脂克隆形成試驗中的人為性因素 缺點：

2、影響因素多，重復(fù)性較差。 MTT有毒性致突變性，操作時應(yīng)注意防護(hù) 3.步驟 接種細(xì)胞：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含 10%胎牛血清的 RPMI1604培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每 孔5X1031X104個細(xì)胞接種于96孔 培養(yǎng)板中，每孔體積200uL培養(yǎng)細(xì)胞；將培養(yǎng)板移入 CO2孵箱中，在37C、5%CO2及濕度條件下，培 養(yǎng)4h以上(至細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定).加藥物干預(yù) 2448h(培養(yǎng)時間取決于實驗?zāi)康?和要其求) 呈色：加MTT時一定要避光，測24h細(xì)胞增殖率時，于加藥干預(yù)20h后， 每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20ul, 37C,繼續(xù)孵育4h;測48h細(xì)胞增值率時, 于加藥

3、干預(yù)44h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL,繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng)后，對懸浮生長的細(xì)胞，需離心，(2000rpm. 15min);對貼壁細(xì)胞 最好也離心(2000rpm,3min).然后用1mL或3mL注射器小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清 液，每孔加入150uL DMSO振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。(4)比色：選才？ 490nm和570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上調(diào)定各孔收值， 記錄 結(jié)果。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生線。4.注意事項(1)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，接種前需計數(shù)，根據(jù)查閱文獻(xiàn)決定不同細(xì)胞的接種個數(shù)，一般以每 孔5X1031M04個細(xì)胞接種于96孔培

4、養(yǎng)板中，每孔體積200uL。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行 MTT試 驗前，對每一種細(xì)胞都具貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲 線，確定試驗中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間， 以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這 樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。(2)實驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞碉。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞碉，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。(2)避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響 試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性

5、。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。(3)加藥時，每種藥5個濃度(每個濃度相差10倍)，一個濃度設(shè)4個副孔。(4)設(shè)空白對照和正常對照，每塊板設(shè)空白復(fù)孔，內(nèi)加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞與藥物， 各做46個復(fù)孔，取平均值，主要目的是為了減少培養(yǎng)基含有的酚紅對比色的影 響。每種細(xì)胞設(shè)46個正常對照孔，含細(xì)胞不含藥物，每孔加樣100仙:/孔。(對 照，不含細(xì)胞，含藥物和培養(yǎng)基？)(5)細(xì)胞鋪板時，要充分分散，而且要加幾個孔就重新吹散一次，否則，細(xì)胞 濃度就會不同。(我曾經(jīng)試驗過，用后加的孔作試驗組與用先加的孔作對照組， 結(jié)果有些差異，也許是我的熟練程度不行！)另

6、外，吹散次數(shù)過多也會影響細(xì)胞 活力。所以要熟練鞋、快些上板。(6)培養(yǎng)后，細(xì)胞的培養(yǎng)既要吸干凈，否則，殘留的蛋白會對 MTT有一定的 吸附作用，影響就過準(zhǔn)確性。我使用的是翻轉(zhuǎn)法，將培養(yǎng)液倒掉，這樣做很簡便， 又很快潔。重復(fù)性也不錯。(7)測吸光度值要有一定的時間范圍，在測定是你會發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移沒 空都會變深些，(這可能是由于 MTT在空氣中氧化的結(jié)果，我記不清了，你再 找找書，另外，具體時間我也沒有記清)(8)陽性藥物的選擇，要選擇經(jīng)典的，有說服力的，又對你的細(xì)胞有很好的殺 傷了力的藥物。別認(rèn)為簡單，我就曾經(jīng)因為陽性藥物選擇錯誤而重新做試驗， 慘痛的教訓(xùn)呀！ ！(9)如果用96孔板，周圍

7、一圈孔的值由于液體蒸發(fā)和溫度梯度原因，會誤差很大，盡量不用。(10)溶解甲膻時，如果是懸浮細(xì)胞或細(xì)胞貼壁不牢，盡量用酸性 SDS溶解， 不要棄去培養(yǎng)液，以免細(xì)胞損失。這還要求最后加入藥物和MTT時，血清濃度低于10%。6.如何計算IC50用抑制率作為Y,加藥濃度的對數(shù)作為X,進(jìn)行線形回歸，根據(jù)得到的方程求抑 制率是50%時的加藥濃度，也就是IC50oIC50的計算和LD50的計算很相似，可以用SPSS計算。以劑量為橫坐標(biāo)，以抑 制率為縱坐標(biāo)(Y)。進(jìn)行回歸分析也可以，即用抑制率作為 Y,加藥濃度的對 數(shù)作為X,進(jìn)行線形回歸，根據(jù)得到的方程求抑制率是50%時的加藥濃度，也就 是IC50。但是這有

8、要求：抑制率最好在30-70%之間才能采用回歸，因為這一段 幾乎是直線關(guān)系。我的經(jīng)驗是，因為藥物的作用通常是一條S型曲線，在藥物濃度很高或很低 的時候就接近一個平臺，所以加藥劑量的選取非常重要，在不知道藥物大概的 IC50的時候，可以各個劑量之間10倍稀釋，這樣加藥的范圍就比較寬，可以摸 索到合適的劑量，如果已經(jīng)有參考的劑量，也可以等倍稀釋。如果你得到的抑制 率能夠分布在50%上下各有幾個點，那么以線形回歸法得到的結(jié)果一般是比較準(zhǔn) 確的。MTT法本身并不是非常準(zhǔn)確，一般要重復(fù) 3次，得到的結(jié)果差不多才可信。MTT大匯總實驗前應(yīng)明確的問題1 .選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一

9、內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約 有105個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行 MTT試驗 前，要進(jìn)行預(yù)實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲 線，確定試驗中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感 性降低，太少觀察不到差異。2 .藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初 篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的 時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。3 .時間點的設(shè)定。在不同時間點的測定 OD值，/&入excel表，

10、最后得到不同時 問點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了 （到了平臺 期）那個時間點應(yīng)該就是最好的時間點（因為這個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最 明顯）。4 .培養(yǎng)時間。200ul的培養(yǎng)液對于10的45次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持 68h,如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向 G0期而趨于靜止，影響結(jié) 果，我們是在48h換液的。5 .MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。做 MTT時， 盡量無菌操作，因為細(xì)菌也可以導(dǎo)致 MTT比色OD值的升高。6 .理論未必都是對的。要根據(jù)自己的實際情況調(diào)整。7 .實驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、M

11、TT、二甲基亞碉。 對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞碉，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。8 .避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響試 驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于 10% 胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。實驗步驟貼壁細(xì)胞：1.1 集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌 PBS填充）。1.5 %CO2, 37c孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥 物，原則上，細(xì)

12、胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天 下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度，每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個, 否則難以反應(yīng)真實情況1.6 %CO2, 37c孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4 .每孔加入20U1MTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與 MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5 .終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6 .每孔加入150ul二甲基亞碉，置搖床上低速振蕩 10min,使結(jié)晶物充分溶解 在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7 .同時設(shè)置調(diào)零孔

13、（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞碉），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的 藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞碉）懸浮細(xì)胞：1）收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度 ixi06/ml,按次序?qū)⒀a(bǔ)足的1640 （無 血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin D （有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋l g/ml, 需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20）;需檢測物10ul;細(xì)胞懸液50ul （即 5 M 04cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加 100 儲存液 100 1640）。2）置37C, 5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3）每孔加入10 ul

14、MTT溶液（5 mg/ml,即0.5%MTT）,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮 細(xì)胞推薦使用 WST-1,培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4）,直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm （630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）4）離心（1000轉(zhuǎn)x10min）,小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞碉，置搖 床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm （630nm 校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。5）同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞碉），對照孔（細(xì)胞、相同濃度 的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞碉），每組設(shè)定3復(fù)孔。MTT的配制MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后 4£避光保存

15、兩周內(nèi)有效，或配制成 5mg/ml 保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、 錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把 MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配， 直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不 能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT 需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短， 或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉 .配制MTT時用用PBS<ph=7.4»?§解，也有人用生理鹽水配，60c水浴助溶。PBS酉己方：Nacl

16、 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g調(diào) ph 7.4定容1L關(guān)于細(xì)胞的接種（鋪板）細(xì)胞過了 30代以后就不要用了，因為狀態(tài)不好了 ；培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板）， 不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實驗。接種時最好按照預(yù)實驗摸索出的密度接種，因為細(xì)胞密度在10000/ml左右時，所 測得的OD值的區(qū)間即細(xì)胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系最好，結(jié) 果最可信。如果鋪的太稀細(xì)胞的殺傷不會很明顯，太密細(xì)胞可能都會凋亡，因為細(xì)胞長的太快營養(yǎng)會不夠，最后導(dǎo)致死亡。且而細(xì)胞過密或者過少，增殖都會過 快或者過慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多采用10000/

17、ml, 100ul/ 孔。細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點來定.如果你做的藥品對細(xì)胞具有刺激作用那么 取小點的細(xì)胞濃度，如果你做的藥品對細(xì)胞具有抑制作用那么取大點的細(xì)胞濃 度，這樣與對照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到105,貼壁細(xì)胞可為103-104.其它的聲音：1 .首先細(xì)胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認(rèn)為寧少勿多。尤其是對于月中瘤細(xì)胞。10000仇是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT 方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點板濃度在 4000-5000/JI,太少的話SD值會很大。2 .MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新 手

18、，20%的波動也是常見的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一 定要過關(guān)。3 .我做的是月中瘤細(xì)胞的MTT實驗，這種細(xì)胞長的很快一開始我是用100000/ML的 濃度來接種的，結(jié)果細(xì)胞長的太湖結(jié)果是沒有梯度也沒有線性關(guān)系.后來調(diào)整濃度, 用過4000080000/ML的濃度都做過MTT實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)做的結(jié)果比較好點的是 6000070000/ML的濃度組的用40000/M的濃度的組，由于細(xì)胞少，藥物作用的梯 度還是有，只是沒有很好的線性關(guān)系.還有根據(jù)細(xì)胞生長速度以及藥物的特性（有 時間依賴性和濃度依賴性的藥物）來確定培養(yǎng)時間是48小時還是72小時.注意細(xì)胞懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞沉淀

19、下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等， 可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移 液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數(shù)過多也會影響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。首先說說我的一點經(jīng)驗：1 .吹打時懸液總量不能太多，達(dá)到吸管吸液量的 3至IJ4倍，可能比較容易混勻。 10ml的離心管里面最好裝34ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太 多又不容易吹成單細(xì)胞懸液。2 .吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所 剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均 勻。如果是吸液量1m

20、l多的吸管，總液量在5ml左右為益3 .吸的時候要在懸液底部，然后提起來一點，但是吹下去的時候不要離開液面， 否則容易吹打出氣泡。4 .吹打次數(shù)100左右，就可以吹打均勻了（有人認(rèn)為加細(xì)胞前吹打 30-50次基 本就差不多均勻了。加細(xì)胞的時候每接種2孔反復(fù)吹打3次，每吹打3次后槍頭 垂懸與細(xì)胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）5 .向每孔中用槍頭加入細(xì)胞時不要太快， 否則你會發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在加入的瞬間會由于 槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻 的分散會產(chǎn)生接觸抑制，影響細(xì)胞的生長。所以速度不能太快也不能太慢。 我習(xí) 慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右

21、3下，在往返回復(fù)3下移動，目的是 使得細(xì)胞能分散的均勻些。（鋪板技術(shù)是 MTT實驗的關(guān)鍵，也是基礎(chǔ)，一定要 練好。曾經(jīng)有同學(xué)用漩渦振蕩器混勻細(xì)胞， 最后細(xì)胞全死了，建議不要采用這種 方法混勻細(xì)胞。加入MTT個人認(rèn)為MTT最關(guān)鍵的是你的細(xì)胞數(shù)目和你加入真正起作用的的 MTT的適當(dāng) 比例，具體細(xì)胞數(shù)目和真正起作用的的 MTT之間的關(guān)系確實不好確定，我認(rèn)為 MTT多加一些比少加好一些MTT的量各家報道不同，一般是過量的，所以 10ul即夠了。如果不使用96孔 板，培養(yǎng)基超過100ul, MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓 MTT與培養(yǎng)基混勻，不過這個應(yīng)該關(guān)系不大。如加入MTT后都有

22、個別孔立即變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染的可能性趣大 ，另外MTT稀 釋彳爰加入系田胞前遢是需要以謾濾的方式滋菌懸宜 .且在加MTT前可以先在鏡下 觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的因為血清中白蛋白對大部分的藥物都有結(jié)合效應(yīng)，所以可以單獨將藥物和MTT加在一起，看會不會起反應(yīng)。如果不起反應(yīng)，就不用去除含藥物的培液，直接加 MTT即可。如何清除上清 百家爭鳴：1 .加DMSO前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會吸去，可在這之前 先用平板離心機(jī)離心96孔板，2000r, 5分鐘，然后吸掉上清（如果是懸浮細(xì)胞， 則推薦此法，懸浮細(xì)胞要離心2500rpmX10min.且其做MTT最好用圓底型96孔

23、板, 消除上清時注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉，建議各孔吸棄150-160U1即可）。2 .我每次將MTT加入后，再孵育四個小時，然后用離心機(jī)離心 1000G5min。但 是用槍小心地吸上清，還是會將一小部分藍(lán)色結(jié)晶吸出。 所以還是建議翻轉(zhuǎn)倒扣 的方法吧！3 .另外，可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙） 2 3次，比用成I的辦法更不容 易使細(xì)胞脫離出來。可以輕拍，或者傾斜一點幫助吸液，發(fā)現(xiàn)紫色結(jié)晶幾乎沒有 肉眼可見的掉脫，但前提是你本身細(xì)胞貼壁要比較牢，半貼壁生長的細(xì)胞容易脫 離。假如藥物作用時間長的話，陰性對照組可能由于細(xì)胞過多而使加入MTT后 形成的結(jié)晶漂起來，這樣就不能直接倒掉上清。4 .做

24、MTT時，這一步驟一定要小心，不要采用倒的方式。因為貼壁不牢的細(xì)胞I會被倒掉，從而影響OD值。懸浮細(xì)胞，不要翻板，離心后也不要翻板，這個方 法害死人。5 .加完MTT反應(yīng)3 4h后，從培養(yǎng)箱取出96孔板的動作要輕柔，避免振蕩結(jié)晶, 使其滑落.你可以試著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸，有的細(xì)胞可 以用排槍一起吸，有的則要耐心的一個個用槍頭吸，槍尖的力度和方向要保證每 個孔都一致。不要讓槍頭接觸到孔底，且一旦傾斜孔板后就不要反復(fù)傾斜放平， 這樣也會使結(jié)晶脫落。6 .用醫(yī)用的注射器加上針頭吸取液體的，吸取時要把板子斜放，沿著壁吸取就好 了！這次MTT我用1ml針頭仔細(xì)吸培養(yǎng)液，覺得比其它方

25、法可靠，一般不會吸走 紫色結(jié)晶.避免消除上清而改進(jìn)的方法由于一般可離心96孔板的離心機(jī)不好找。既使是貼壁細(xì)胞做MTT時，用DMSO 溶解得到結(jié)果也不好，不是得不到預(yù)期結(jié)果就是可重復(fù)性差。解決方法1:用以下文獻(xiàn)方法：周建軍等，評價抗癌物質(zhì)活性的改良MTT方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993, 24 （10） : 455-457具體方法：配三聯(lián)溶解液：10%SDS, 5%異丁醇，0.012mol/LHCL,蒸儲水溶解。三聯(lián)溶解液：SDS10g,異丁醇5ml, 10M HCl 0.1ml用雙蒸水溶解配成100ml溶 液操作：在培養(yǎng)板上加一定密度的細(xì)胞懸液，90ul/孔；如需給藥，則再于同時（懸 浮細(xì)胞）

26、或4h后（貼壁細(xì)胞）加入不同濃度的藥物10ul/孔，均設(shè)三復(fù)孔。另外， 每塊板上另沒一個調(diào)零孔（只加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞和藥物）。培養(yǎng)2d后，加入MTT 溶液20ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h,然后加入上述三聯(lián)液100ul/孔，于37度放置過 夜后，用酶標(biāo)儀測各孔A570值。優(yōu)點：簡化操作，提高了可靠性。解決方法2:日本同仁有一種新試劑CCK-8試劑，CCK-8試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有 WST_8其化學(xué)名稱為： 2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唾單鈉鹽,它在 電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（

27、1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞， 線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲染料（Formazan dy© 。生成的甲物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。CCK-8試劑中已預(yù)先配入了進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析所需的成分，無需再用緩沖液或培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋；同時，CCK-8試劑無需任何放射性同位素和有機(jī)溶劑。因此，無需特別的技巧，就可使每一位使用者準(zhǔn)確、快速地得 到重現(xiàn)性好的實驗結(jié)果。優(yōu)點1、簡便只需一步即可得到結(jié)果2、省時毋需預(yù)制，即開即用廠3、安全毋需放射性同位素和有機(jī)溶劑一4、快 速 省去了溶解除沉操作5、靈敏度高靈敏度高于MTT6、

28、重現(xiàn)性好步驟少；無損失；結(jié)果準(zhǔn)確就是比較貴，如果經(jīng)費充足，用這個是不錯的 進(jìn)行細(xì)胞增殖分析的使用方法：1、接種細(xì)胞懸液100小巾96孔板內(nèi)，預(yù)先置于37C , 5% CO 2飽和濕度培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng)。2、在每個孔內(nèi)加入10仙的CCK-8試劑。3、把培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4小時*。4、在450nm波長處測定吸光度，參比波長為 600nm或600nm以上。解決方法3:使用MTS解決方法4:力口入DMSO在同一批實驗中最好不要更換 DMSO。加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈，沒 有去掉上清直接加DMSO, 一是沉淀會很難溶解.二培養(yǎng)液的顏色在檢測時也能 被測到，會對最后結(jié)果造成影響。但前提是不能把

29、細(xì)胞也一起吸掉，因為這樣帶 來的誤差要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于培養(yǎng)液沒棄干凈帶來的誤差，所以要在保證細(xì)胞不被吸掉的 前提下，盡量把培養(yǎng)液吸掉。如果培養(yǎng)液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng) 液，這樣在檢測時可以盡量去除培養(yǎng)液的影響，DMSO的量也可為100ul或150ul1 .加了 DMSO后用振蕩器輕輕振蕩510min,時間控制盡量嚴(yán)格一點，放置時間 長了會影響結(jié)果值會偏大，且結(jié)果不可信.2 .加入DMSO后可用排槍反復(fù)抽吸助溶，溶解后盡快檢測。如果實驗孔不多，建議用此法，因其比振蕩溶解效果好。3 .或放入37度放孵箱15分鐘溶解結(jié)晶。振蕩是為了讓甲月贊溶解，這樣才能更好的測量吸光度，振蕩 96孔板有專的振蕩

30、 器，目的：扎破氣泡.有氣泡存在時，由于其對光的反射與折射作用（酶標(biāo)儀的原理 是通過測定特定波長透過樣品的吸光度推測樣品內(nèi)特定物質(zhì)的濃度），會導(dǎo)致結(jié)果偏移.OD值的測定至于測定波長的選擇是因顯色溶液而異的，對于DMSO,溶解后呈紫（紅）色，490nm有最大吸收值，而ATCC公司的MTT試劑盒用的不是DMSO,它的測定波 長是570。（就如ELISA實驗選用OPD作底物測定波長是492,選用TMB顯色 液則用450）;而對于SDS和酸化異丙醇，則選用570nm,并且建議以655nm作為 參考波長。DMSO溶后10分鐘內(nèi)測，越放顏色越深，而S D S做為溶解液測吸收光值，其 值可在三天內(nèi)保持不變.

31、細(xì)胞密度偏大測出的吸光度也會偏大， 細(xì)胞密度小吸光度也會偏??；另外跟細(xì)胞 狀態(tài)也有關(guān)系，細(xì)胞狀態(tài)不好的話，吸光度值也會低的；細(xì)胞數(shù)目少，或者是培 養(yǎng)的時間短，OD值也會偏低。如果各個孔的孔間差異性特別明顯的話說明有可 能存在污染，空白孔的OD值太高，很可能是細(xì)菌污染。復(fù)孔直接的OD值差別一般應(yīng)在0.10.15,差別太大考慮：1.接種細(xì)胞數(shù)不均勻， 或是接種太多，應(yīng)保證每孔一致，一般是每孔100010000個?？梢约?xì)胞細(xì)胞計 數(shù)后，加入細(xì)胞懸液，再補(bǔ)培養(yǎng)基到預(yù)定體積，并輕輕吹打幾次，使細(xì)胞均勻分 布，這樣比直接加入預(yù)定體積的細(xì)胞懸液要好，接種時應(yīng)加含血清培養(yǎng)基。2.貼壁時間：1824h,如果不夠

32、，未懸浮的細(xì)胞會被吸掉。一般為了實驗的準(zhǔn)確，每個濃度可以設(shè) 5 6個復(fù)孔，可以最后統(tǒng)計時，可以除I 去一個最高值和一個最低值，或者除去其中數(shù)據(jù)離譜的值，這些離譜數(shù)字的出現(xiàn) 與細(xì)胞是否污染，細(xì)胞是否在培養(yǎng)期間死去，是否培養(yǎng)液蒸發(fā)過多，加MTT液是否準(zhǔn)確，在37 C, 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育時間是否一定（14小時）等有 密切的關(guān)系，當(dāng)然測定 OD值的儀器工作狀態(tài)是否正常也非常重要?。ㄒ话汩_機(jī) 預(yù)熱 20min）。MTT方法的吸收度在0.20.8之間誤差較小。這和分析化學(xué)中的1 a m b e r t-beer定律有關(guān)，對朗伯-比爾定律的偏離在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn) 曲線不呈直線的情況，特別

33、是當(dāng)吸光物質(zhì)濃度較高時，明顯地看到通過原點向濃 度軸彎曲的現(xiàn)象（吸光度軸彎曲）。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線 彎曲部分進(jìn)行定量，將會引起較大的誤差。在吸光光度分析中，儀器測量不準(zhǔn)確 也是誤差的主要來源。任何光度計都有一定的測量誤差。這些誤差可能來源于光 源不穩(wěn)定，實驗條件偶然變動，讀數(shù)不準(zhǔn)確等。在光度計中，透射比的標(biāo)尺刻度均勻。吸光度標(biāo)尺刻度不均勻。對于同一儀器， 讀數(shù)的波動對透射比為一定值；而對吸光度讀數(shù)波動則不再為定值。吸光度越大， 讀數(shù)波動所引起的吸光度誤差也越大透射比很小或很大時，濃度測量誤差都較 大，即光度測量最好選吸光度讀數(shù)在刻度尺的中間而不落兩端。待測溶液的透射比T在

34、15%65%之間，或使吸光度 A在0.20.8之間，才能保證測量的相對誤 差較小。當(dāng)A=0.434(或透射比T=36.8%)時，測量的相對誤差最小。其它的聲音：1 .最好用570nm波長的濾光片，因為MTT在這個波長的吸光度是峰值，換句話 說靈敏度高。用其它波長的也有，一般是 490nm，但我的經(jīng)驗靈敏度降低一半。2 .我們用的BIO-TEK公司的ELx800，一股值在2以下都是可靠的，如果復(fù)孔之間 值相差太大就要考慮是否是實驗過程中的誤差.我曾經(jīng)看到園子的有些帖子報 道說OD值大卞S在0.2-1.2范圍內(nèi)與活細(xì)胞數(shù)有較好的線性關(guān)系，但OD值在0.3-0.9范圍內(nèi)可能更佳，若你的OD值不在這個

35、范圍內(nèi)則你實驗的細(xì)胞數(shù)可能不 太合適，應(yīng)調(diào)整你的細(xì)胞數(shù)。邊緣效應(yīng)96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不養(yǎng)細(xì)胞，否則這四行的數(shù)據(jù)會偏高或偏 低,96孔板在培養(yǎng)箱中，由于濕度不夠，而培養(yǎng)箱由于具有一定的溫度，由于溫 度梯度使得邊緣的孔水分蒸發(fā)較快，導(dǎo)致培養(yǎng)基中各種成分濃度變化增大，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不同。對于這種現(xiàn)象，要保證培養(yǎng)箱中的濕度，減少開關(guān)培養(yǎng)箱的次數(shù) 和時間。解決方法：將孔板周圍的一圈孔全部不用，影響非常大，而且最外一圈 J 一定要加水、PBS或者培養(yǎng)液，只要能防止蒸發(fā)就可以.關(guān)于如何計算IC50(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg最大劑量I:lg(最

36、大劑量/相臨劑量)P:陽性反應(yīng)率之和Pm:最大陽性反應(yīng)率Pn:最小陽性反應(yīng)率舉個例子：各組濃度 0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀釋倍數(shù) 為 10,最大濃度為 0.1,抑制率為 0.95、0.80、0.65、0.43、0.21, 0.06。代入 計算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025Bliss法:自己查閱書籍（3）IC50

37、計算軟件，見下面附件（4）自己用EXCEL做趨勢線來求IC50,關(guān)于LD50的方法與此相似?。?）在線求 IC50 或 EC50: http:/chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm結(jié)果統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)值以xis表示，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，p<0.05時為相差顯著，p<0.01 時為相差非常顯著?？梢砸詴r間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生線，專門公 式求IC50?；蛴嬎阋种坡?。細(xì)胞死亡率 %=OD對口組-OD實驗組/OD對照組 excel表中可以做兩兩比較的T-test這個你可以參考一下；你的數(shù)據(jù)應(yīng)該用多個樣 本均數(shù)的T-test,方差分析也可。用的軟件是 SPSS或者SAS?？装宓闹貜?fù)利用：培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實驗。一般