流式細胞術常見實驗分析

1、 四種常見流式實驗講解四種常見流式實驗講解林奕婷林奕婷2013年年8月月14日日v 細胞凋亡的檢測與分析v DNA含量檢測與細胞周期分析v 胞內(nèi)活性氧水平的檢測與分析v 細胞表面分子的檢測與分析v 組合實驗1.1 開機-清洗（原則：先開儀器后開軟件，開機必清洗）1.2 采集樣本1.3 分析1.4 關機（原則：先關軟件后關儀器，關機前必清洗）1.5 日常維護1.1 清洗清洗1.2 樣本采集樣本采集edit WL 1.3 分析 見具體實驗的分析。 1.4 關機1.5 日常維護日常維護 保持空氣干燥，會使激光器的使用壽命長一些。 桌面不要有震動，以免光路發(fā)生偏移。 上機前檢查廢液瓶是否已滿，若已滿或

2、將滿請倒掉，用超純水沖洗兩遍，放回原位；洗滌液瓶若已空或?qū)⒖照堁a滿（ICF：ddH2O=1：4）。 實驗臺面保持整潔，廢物缸請及時倒掉。自己的東西實驗后請收走，流式專用的物品請不要帶走。 做完請記得登記。 每周在周一進行一次easycheck。 （自己在做實驗之前也可進行easycheck，流程見下面。）微珠：10L（用前震蕩混勻）Buffer：190L2.1 細胞凋亡的檢測與分析2.1.1 PI單染法2.1.2 Annexin-PI雙染法2.1.3 線粒體膜電位法凋亡啟動凋亡啟動凋亡早期凋亡早期凋亡晚期凋亡晚期2.1.1 PI單染法單染法 正常細胞DNA含量：2n4n 凋亡細胞：核內(nèi)DNA斷

3、裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丟失，胞內(nèi)DNA含量減少。PI染色后，熒光強度減小而形成一個DNA含量小于2n的分布區(qū)（亞G1峰）?；驹恚夯驹恚翰僮鞣椒ㄅc結(jié)果分析見細胞周期部分。操作方法與結(jié)果分析見細胞周期部分。優(yōu)缺點：優(yōu)缺點：優(yōu)點：簡便，快捷，價廉，應用普遍。缺點：2.1.2 Annexin-PI雙染法雙染法基本原理：基本原理：磷脂酰絲氨酸（PS）能與連接素（Annexin）發(fā)生特異結(jié)合；PI是核酸熒光染料，不能透過正常細胞膜，只能進入已經(jīng)破損的細胞膜。正常細胞：膜完整，PS不外翻PI-/Annexin-凋亡早期：膜完整，PS翻轉(zhuǎn)PI-/Annexin+凋亡晚期：PS外翻

4、，膜通透性增加PI+/Annexin+壞死細胞：膜嚴重破損，PS不外翻PI+/Annexin+ 幾乎不存在膜結(jié)構(gòu)PI+/Annexin-結(jié)果分析結(jié)果分析陰性對照PIPI/Annexin-FITCAnnexin-FITC熒光交疊熒光交疊熒光補償原理熒光補償原理熒光補償熒光補償Annexin-FITC單染優(yōu)缺點：優(yōu)缺點：2.1.3 線粒體膜電位法線粒體膜電位法基本原理：基本原理：-+488nm590nm正常細胞正常細胞線粒體膜電位下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。JC-1：親脂性陽離子熒光染料，特異性地與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，膜電位高時呈聚合體，膜電位低時呈單體。凋亡細胞凋亡細胞-+488nm529n

5、m結(jié)果分析結(jié)果分析用488nm激發(fā)，黃光和綠光通道收集熒光信號，調(diào)補償糾正綠色熒光（單體）和黃色熒光（聚合物）的重疊部分。線粒體膜電位采用比例法，即根據(jù)綠色熒光與黃色熒光陽性百分率之比。 Ratio=G.M./Y.M. 比值升高，膜電位降低，膜受損。 2.2.1 DNA倍體分析PI染色法2.2.2 S期特異性檢測2.2.3 M期特異性檢測2.2.1 DNA倍體分析倍體分析PI染色法染色法細胞周期與DNA含量變化極其FCM分析直方圖基本原理：基本原理：結(jié)果分析結(jié)果分析 Guava原軟件分析Red-ARed-WRed-WRed-AH A W在用第三方軟件分析之前，請將流式結(jié)果按如下所示導出。結(jié)果分

6、析結(jié)果分析 Modfit軟件分析結(jié)果分析結(jié)果分析 Modfit軟件分析圖片拷貝：直接Ctrl+C結(jié)果分析結(jié)果分析 Flowjo軟件分析2.2.2 S期特異性檢測期特異性檢測S期DNA合成期，S期的比例增多往往與細胞分裂的活躍程度相關。傳統(tǒng)的PI染色可以通過DNA的倍增區(qū)分G1期與G2/M期。S期則因界限不明顯，難以區(qū)分。若需要準確的統(tǒng)計S期的變化，需要加入S期的特異性標志，即BrdU。BrdU只在DNA合成時被摻入核酸，是指示DNA復制的金標準。因此可通過BrdU-Alex Fluor 488與PI復染將S期準確的區(qū)分開來。2.2.3 M期特異性檢測期特異性檢測G2期是指DNA合成后期，M期是

7、細胞分裂期。二者在細胞周期事件中所處的時項不同，所表示的生物學意義也大不相同。準確檢測M期的變化對細胞增殖、凋亡及癌癥的研究相當重要。M期的檢測標志是絲氨酸磷酸化組蛋白H3(pH3)。當細胞周期從G2期轉(zhuǎn)換到M期時，染色質(zhì)上的組蛋白H3Ser10發(fā)生磷酸化，并在有絲分裂后快速的去磷酸化。由此組蛋白H3的絲氨酸磷酸化變化將停留在G2期的細胞與M期的分裂細胞區(qū)分開來。DCFH-DA單染法DCFH-DADCFHROSDCFDCFH-DA進入細胞在細胞內(nèi)酯酶作用下脫去二脂形成不發(fā)熒光的DCFH，當細胞內(nèi)存在H2O2，O2-，OH-等ROS時被氧化成發(fā)綠色熒光的DCF。注意事項：注意事項：（1）陰性細胞

8、群（峰）和陽性細胞群（峰）分群明顯）陰性細胞群（峰）和陽性細胞群（峰）分群明顯結(jié)果分析結(jié)果分析 數(shù)據(jù)分析中幾種常見圖形及分析原則分析原則：分析原則：根據(jù)陰性對照界定陰性置信區(qū)；允許陰性對照非特異性熒光信號（假陽性率）一般小于1%5%；可記錄陽性細胞百分率或平均熒光強度。（2）樣本管與陰性對照管峰形重疊）樣本管與陰性對照管峰形重疊樣本管峰形左側(cè)右移，右側(cè)有肩峰，弱陽性的樣本常出現(xiàn)此類圖形。分析原則：分析原則：根據(jù)陰性對照界定陰性置信區(qū)，陰性置信區(qū)應設在兩曲線分離處；可記錄陽性細胞百分率（近似值）或平均熒光強度或弱陽性；允許陰性對照非特異性熒光信號（假陽性率）高些，但陽性細胞百分率（近似值）應減去

9、假陽性率。樣本管峰形整體右移。在排除非特異性染色的情況下（如設置嚴格的對照、調(diào)節(jié)抗體濃度等），方能進行分析。分析原則：分析原則：不可根據(jù)陰性對照界定陰性置信區(qū)；可記錄平均熒光強度，不可記錄陽性細胞百分率。（3）同時出現(xiàn)弱陽性峰與強陽性峰的組合圖形）同時出現(xiàn)弱陽性峰與強陽性峰的組合圖形分析原則：分析原則：根據(jù)陰性對照界定陰性置信區(qū)，陰性置信區(qū)可設在兩曲線分離處。陽性細胞既含弱陽性細胞又含強陽性細胞，但陽性細胞百分率應減去假陽性率；界定先可設在弱陽性返回基線處，陽性細胞僅表示強陽性細胞；可記錄陽性細胞百分率或平均熒光強度。2.4.1 免疫學檢測2.4.2 干細胞分析2.4.1 免疫學檢測免疫學檢測數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析2.4.2 腫瘤干細胞分析腫瘤干細胞分析MCF-7 negative controlMCF-7 CD24MCF-7 CD44MCF-7 CD24/CD440.08%0.03%89.