膿汁與糞便標本中病原菌的檢測-1

1、實驗分組實驗分組v倆倆相對4人為一個小組,組號編在電源插座上。v每組按從前到后,從左到右的順序，分別編號為甲、乙、丙、丁。 甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁甲 乙 5丙 丁甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 講 臺左右醫(yī)學微生物學實驗醫(yī)學微生物學實驗周瑩南方醫(yī)科大學微生物學系醫(yī)學微生物學實驗醫(yī)學微生物學實驗 Medical Microbiology PracticumMedical Microbiology Practicumv醫(yī)學微生物學實驗課是一門操作技能很強的課程。v實驗課教學的主要目標是使學生了解醫(yī)學微生物

2、學主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理，樹立牢固的無菌觀念。v更重要的是培養(yǎng)學生自學能力、科學思維能力、動手能力和表達能力。 微生物學實驗室規(guī)則微生物學實驗室規(guī)則 Lab Safety RegulationLab Safety Regulation v進入實驗室必須穿白大衣（離開時反折進入實驗室必須穿白大衣（離開時反折) )，戴帽子。，戴帽子。v書本、文具放在抽屜里。書本、文具放在抽屜里。v實驗室內(nèi)不準吃東西、喝飲料，不準把任何東西放入嘴中，也不實驗室內(nèi)不準吃東西、喝飲料，不準把任何東西放入嘴中，也不要用手撫摸頭臉等部位。要用手撫摸頭臉等部位。v凡是廢棄的細菌培養(yǎng)物、帶菌材料，應放在指

3、定地點等待滅菌處凡是廢棄的細菌培養(yǎng)物、帶菌材料，應放在指定地點等待滅菌處理，不得隨便亂放或用水沖洗。理，不得隨便亂放或用水沖洗。v一旦發(fā)生意外，造成污染，應立即報告老師進行處理。一旦發(fā)生意外，造成污染，應立即報告老師進行處理。v離開實驗室前離開實驗室前, ,必須洗手。懷疑污染應及時用必須洗手。懷疑污染應及時用11新潔而滅泡手。新潔而滅泡手。v每次實驗后，實驗臺用消毒液擦拭，地板先用濕的拖把拖地以后每次實驗后，實驗臺用消毒液擦拭，地板先用濕的拖把拖地以后再掃地，實驗室用紫外線燈照射再掃地，實驗室用紫外線燈照射1 1小時。小時。實驗室器材介紹實驗室器材介紹常用器材擺放順序：電源插座常用器材擺放順序

4、：電源插座試管架試管架酒精燈酒精燈污物盤。污物盤。試管架上器材：靠近插座一側第試管架上器材：靠近插座一側第1 1列放置接種針列放置接種針, ,第第2 2列放置列放置接種環(huán)，另一側中間兩行放置油性筆和打火機。接種環(huán)，另一側中間兩行放置油性筆和打火機。器材使用后，必須放回原處，依次擺整齊。器材使用后，必須放回原處，依次擺整齊。普通冰箱普通冰箱(3(3顆星顆星* * * *) )冷藏室冷藏室( (上柜）：上柜）：溫度溫度4 488，保存培養(yǎng)基、細菌，保存培養(yǎng)基、細菌培養(yǎng)物、常用菌種培養(yǎng)物、常用菌種和抗菌素紙片和抗菌素紙片等等。冷凍室（下柜）：冷凍室（下柜）：溫度溫度1818，保存診斷血清、血，保存診

5、斷血清、血漿，長期保藏的菌種和抗菌素紙漿，長期保藏的菌種和抗菌素紙片。片。 衛(wèi)生工具：衛(wèi)生工具：掃帚掃帚,拖把拖把,撮箕撮箕,垃圾筐垃圾筐,放在冰箱放在冰箱和水池之間。和水池之間。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：35353737，一般細菌培養(yǎng)時間為一般細菌培養(yǎng)時間為18182424小時。小時。 奧林巴斯奧林巴斯 CX21CX21型型 生物顯微鏡生物顯微鏡（實驗柜內(nèi)，實驗柜內(nèi)，每人一臺）每人一臺）注意：只能橫放，不得豎放。注意：只能橫放，不得豎放。革蘭染色瓶革蘭染色瓶染色架染色架石蠟油石蠟油拭鏡紙拭鏡紙吸水紙吸水紙乙醇乙醚乙醇乙醚微生物學器材柜微生物學器材柜-1-1（西側邊臺中段）（

6、西側邊臺中段）電爐電爐微生物學器材柜微生物學器材柜-2-2（東側邊臺中段）（東側邊臺中段）酒精棉球酒精棉球碘酒棉球碘酒棉球鑷子鑷子電爐、石棉網(wǎng)電爐、石棉網(wǎng)手套手套 1500W 1500W電爐電爐安全警告安全警告1.1.電源插塞與電爐插孔接觸良好電源插塞與電爐插孔接觸良好插頭插入插座。插頭插入插座。2.2.如果培養(yǎng)基暴沸溢出，流入電爐；必須立即如果培養(yǎng)基暴沸溢出，流入電爐；必須立即切斷切斷電源、拔除插頭；電源、拔除插頭；以免以免觸電，危及生命！觸電，危及生命！東西兩側邊臺各一個電爐，每個電爐東西兩側邊臺各一個電爐，每個電爐可同時放置可同時放置4 4個個300ml300ml錐形瓶進行錐形瓶進行加熱

7、加熱。蒸餾水：蒸餾水：配制培養(yǎng)基。11新潔而滅：新潔而滅：懷疑病原菌污染，泡手35分鐘。消毒液：消毒液：擦拭實驗臺臺面。玻片缸：玻片缸：浸泡用過的載玻片。器材柜（上層）器材柜（上層）量筒量筒錐形瓶錐形瓶器材柜（中層）器材柜（中層）砝碼砝碼天平天平干粉培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基稱量紙稱量紙 牛皮紙牛皮紙硫酸紙硫酸紙 橡皮筋橡皮筋藥勺藥勺 厘米尺厘米尺砂輪砂輪 創(chuàng)可貼創(chuàng)可貼 洗耳球洗耳球洗牙球洗牙球 小吸球小吸球膿汁和糞便標本中病原菌的檢測實驗流程實驗流程(6(6次課次課1212學時）：學時）：v培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備 v細菌的分離培養(yǎng)細菌的分離培養(yǎng) v細菌的純培養(yǎng)細菌的純培養(yǎng) v細菌的形態(tài)學檢查細菌的形

8、態(tài)學檢查 v細菌的生化試驗等細菌的生化試驗等 v結果觀察、分析、總結結果觀察、分析、總結撰寫實驗論文撰寫實驗論文常見病原性球菌的檢查程序常見病原性球菌的檢查程序P47P47： 直接涂片、革蘭染色、鏡檢直接涂片、革蘭染色、鏡檢膿汁、痰、咽部分泌物膿汁、痰、咽部分泌物 觀察菌落性狀、溶血性、色素觀察菌落性狀、溶血性、色素 血瓊脂平板培養(yǎng)血瓊脂平板培養(yǎng) 涂片染色鏡檢涂片染色鏡檢 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 生化反應生化反應 純培養(yǎng)純培養(yǎng) 動物實驗動物實驗 藥敏實驗藥敏實驗血液、穿刺液血液、穿刺液 肉湯增菌培養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng) 培養(yǎng)液涂片染色境檢培養(yǎng)液涂片染色境檢 常見腸道致病菌的檢查程序常見腸道致病菌的檢

9、查程序P48P48：糞便糞便 SS SS瓊脂、伊紅美藍平板培養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍平板培養(yǎng) 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 血清學鑒定血清學鑒定 血、骨髓血、骨髓 增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng) 雙糖鐵培養(yǎng)基雙糖鐵培養(yǎng)基 染色鏡檢染色鏡檢 生化反應生化反應 膿汁和糞便標本中病原菌的檢測(一)培養(yǎng)基的制備P2消毒與滅菌P5細菌的人工培養(yǎng)無菌技術（錄像）擺斜面，傾注平板。培養(yǎng)基的制備 Preparation ofPreparation of Culture MediaCulture Media組號組號培養(yǎng)基培養(yǎng)基稱量稱量(g)(g)水量水量(ml)(ml)煮沸煮沸( (次次) )分裝分裝(ml)(ml)備注（備注（4040

10、人份）人份）1 1營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)瓊脂11.411.43003004 4瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)瓊脂2.92.975753 35 51515支，中試管，斜面支，中試管，斜面5 57 7營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯1.11.150501 13 31515支，小試管，液體支，小試管，液體8 81010半固體瓊脂半固體瓊脂1.51.550503 33 31515支，小試管，高層支，小試管，高層公共培基，勿作標記！公共培基，勿作標記！培養(yǎng)基的制備 Preparation ofPreparation of Culture MediaCulture Media組號組號培養(yǎng)基培養(yǎng)

11、基稱量稱量(g)(g)水量水量(ml)(ml)煮沸煮沸( (次次) )分裝分裝(ml)(ml)備注（備注（3636人份）人份）1 1營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)瓊脂11.411.43003003 3瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)瓊脂2.72.770703 35 51414支，中試管，斜面支，中試管，斜面6 67 7營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯1.31.360601 13 32020支，小試管，液體支，小試管，液體8 81010半固體瓊脂半固體瓊脂1.31.345453 33 31414支，小試管，高層支，小試管，高層公共培基，勿作標記！公共培基，勿作標記！培養(yǎng)基的制備 Prepara

12、tion ofPreparation of Culture MediaCulture Media組號組號培養(yǎng)基培養(yǎng)基稱量稱量(g)(g)水量水量(ml)(ml)煮沸煮沸( (次次) )分裝分裝(ml)(ml)備注（備注（3232人份）人份）1 1營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)瓊脂11.411.43003003 3瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)瓊脂2.32.360603 35 51212支，中試管，斜面支，中試管，斜面6 6、7 7營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯1.21.255551 13 31818支，小試管，液體支，小試管，液體8 8、9 9半固體瓊脂半固體瓊脂1.61.655553

13、33 31818支，小試管，高層支，小試管，高層公共培基，勿作標記！公共培基，勿作標記！ 培養(yǎng)基隔石棉網(wǎng)煮沸，使完全溶解。營養(yǎng)肉湯煮沸培養(yǎng)基隔石棉網(wǎng)煮沸，使完全溶解。營養(yǎng)肉湯煮沸1 1次，含瓊脂的次，含瓊脂的培養(yǎng)基煮沸培養(yǎng)基煮沸3 3次次( (煮至煮至剛剛冒泡剛剛冒泡, ,立即放置臺面，半分鐘后再煮立即放置臺面，半分鐘后再煮) )。加熱時加熱時,常搖動。常搖動。沸騰時，不能搖動！沸騰時，不能搖動！用洗耳球和刻度吸管分裝培養(yǎng)基。用洗耳球和刻度吸管分裝培養(yǎng)基。棉塞棉塞1/21/2塞入試管口內(nèi)，松緊合適。塞入試管口內(nèi)，松緊合適。放試管筐內(nèi)，罩上硫酸紙放試管筐內(nèi)，罩上硫酸紙和牛皮紙，扎好橡皮筋。和牛皮

14、紙，扎好橡皮筋。培養(yǎng)基趁熱分裝培養(yǎng)基趁熱分裝培養(yǎng)基裝筐待滅菌培養(yǎng)基裝筐待滅菌量筒量筒錐形瓶錐形瓶砝碼砝碼干粉培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基試管筐試管筐天平天平邊臺柜子內(nèi)器材邊臺柜子內(nèi)器材邊臺抽屜內(nèi)器材邊臺抽屜內(nèi)器材試管（棉塞），刻度吸管，洗耳試管（棉塞），刻度吸管，洗耳球，稱量紙，藥勺，硫酸紙、牛球，稱量紙，藥勺，硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋皮紙、橡皮筋, ,厘米尺。厘米尺。 稱量紙置于左盤，游碼稱量紙置于左盤，游碼移至標尺左端移至標尺左端“0”0”點位置點位置上，指針應對準中線，取得上，指針應對準中線，取得平衡。否則將杠桿兩端的調(diào)平衡。否則將杠桿兩端的調(diào)整螺母旋動調(diào)節(jié)平衡。整螺母旋動調(diào)節(jié)平衡。 秤物時秤物時“物

15、左碼右物左碼右”，物品放在左盤上，砝碼放物品放在左盤上，砝碼放在右盤，盡可能放在秤盤在右盤，盡可能放在秤盤中心。天平保持干燥、清中心。天平保持干燥、清潔。潔。每組只用一張稱量紙！稱量皿扣除皮重！每組只用一張稱量紙！稱量皿扣除皮重！培養(yǎng)基制備程序 干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝集中放在試管筐內(nèi)，然后罩上硫酸紙、牛皮紙，用橡皮筋扎好 放入講臺邊的滅菌桶或滅菌筐內(nèi)送到高壓蒸汽滅菌室（洗刷室）。 請在 30分鐘內(nèi)完成。細菌培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)基 Culture MediaCulture Media 培養(yǎng)基是用人工的方法，將多種營養(yǎng)物質(zhì)，根據(jù)各種微生物生長繁殖的需要而合成的一種營養(yǎng)制品。它的主要成分是蛋白胨、牛

16、肉膏、氯化鈉和水，pH7.47.6。v培養(yǎng)基制備的一般程序：培養(yǎng)基制備的一般程序： 調(diào)配溶化 矯正pH 分裝滅菌檢定保存。 干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝滅菌檢定 保存。v培養(yǎng)基的制備原則：培養(yǎng)基的制備原則： (1)適當?shù)臓I養(yǎng)成分,(2)合適的酸堿度,(3)配制后必須滅菌。v培養(yǎng)基的種類（按物理性狀分類）培養(yǎng)基的種類（按物理性狀分類）液體培養(yǎng)基:不含凝固劑(瓊脂),用于增菌，純培養(yǎng),保種。固體培養(yǎng)基:含12瓊脂，用于分離培養(yǎng),純培養(yǎng),保種。半固體培基:含0.30.5瓊脂，用于動力檢測,保種。營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯 nutrient brothnutrient broth瓊脂斜面瓊脂斜面 agar sl

17、ant agar slant 瓊脂高層瓊脂高層 agar deepagar deepv培養(yǎng)基的種類（按用途分類）培養(yǎng)基的種類（按用途分類）P P3 3基礎培養(yǎng)基基礎培養(yǎng)基: :含一般細菌生長繁殖所需的基本營養(yǎng)成分，可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分，如普通平板。營養(yǎng)培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中加入血液、生長因子等特殊成分，供營養(yǎng)要求較高的細菌和須要特殊生長因子的細菌生長，如血平板。增菌培養(yǎng)基：增菌培養(yǎng)基：促進目的菌的生長，適用于含菌量較少的標本，如葡萄糖肉湯。選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入抑制劑抑制雜菌生長，有助于目的菌的生長，如EMB、SS平板。鑒別培養(yǎng)基：鑒別培養(yǎng)基：利用細菌分解能

18、力及代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，用來試驗細菌的生化反應、代謝產(chǎn)物，如糖發(fā)酵管。厭氧培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)基：氧化還原電勢低，表面用凡士林、石蠟封住，與空氣隔絕，成為無氧環(huán)境，如庖肉培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌 在冷空氣完全排盡的情況下，蒸汽壓103.43 kPa ,溫度可達到121.3 ,維持1530分鐘，可以殺滅包括細菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。v基礎培養(yǎng)基：121高壓蒸汽滅菌1530分鐘。v含糖培養(yǎng)基：115滅菌15分鐘。v雞蛋、牛奶培養(yǎng)基:75100間歇滅菌3次(1天1次)。v不耐高溫的液體成分：濾菌器濾過除菌（EK型蔡氏濾器、 G5或G6玻璃濾器、0.45um或0.

19、22um微孔濾膜） 含瓊脂的培養(yǎng)基滅菌以后，冷卻含瓊脂的培養(yǎng)基滅菌以后，冷卻50506060（溫度越高，冷凝水（溫度越高，冷凝水越多，越易污染越多，越易污染 ），以無菌操作，傾注平皿），以無菌操作，傾注平皿10ml10ml（直徑（直徑7 7厘米平厘米平皿），瓊脂凝固后形成瓊脂平板。皿），瓊脂凝固后形成瓊脂平板。 平板主要用于細菌的分離培養(yǎng)和藥敏試驗。平板主要用于細菌的分離培養(yǎng)和藥敏試驗。平板儲存待用或做細菌培養(yǎng)時，為什么要倒置？平板儲存待用或做細菌培養(yǎng)時，為什么要倒置？防止平板水分蒸發(fā)丟失。防止平板水分蒸發(fā)丟失。防止冷凝水滴于平板表面，影響單菌落形成。防止冷凝水滴于平板表面，影響單菌落形成。瓊

20、脂平板瓊脂平板 agar plateagar plate 含瓊脂的培養(yǎng)基滅菌以后，趁熱斜放，培基不超過含瓊脂的培養(yǎng)基滅菌以后，趁熱斜放，培基不超過試管長度的試管長度的2/32/3，瓊脂凝固以后形成一個傾斜的表面。，瓊脂凝固以后形成一個傾斜的表面。 斜面主要用于純菌移種和菌種保存。斜面主要用于純菌移種和菌種保存。 斜面底部的冷凝水有利于純菌移種、菌苔形成和菌斜面底部的冷凝水有利于純菌移種、菌苔形成和菌種保藏。種保藏。瓊脂斜面瓊脂斜面 agar slantagar slant怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格?無菌試驗：將待檢培養(yǎng)基置于3537培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，無任何細菌生長為合格。效果試驗：將已知的標準參

21、考菌株，接種于待檢培養(yǎng)基中，檢查細菌的生長繁殖狀況和生化反應是否與預期的結果相符合。細菌生長繁殖的方式和速度細菌生長繁殖的方式和速度v細菌繁殖方式：以二分裂方式進行無性繁殖。v繁殖速度：多數(shù)2030分鐘繁殖1代，結核桿菌1820小時繁殖一代。v細菌生長繁殖曲線細菌的生長曲線細菌的生長曲線細菌數(shù)目的對數(shù)細菌數(shù)目的對數(shù)培養(yǎng)時間培養(yǎng)時間（小時）（小時）5 10 15 20 25 30 6.06.57.07.58.08.59.0活菌數(shù)活菌數(shù)總菌數(shù)總菌數(shù)遲緩期遲緩期對數(shù)生長期對數(shù)生長期穩(wěn)定期穩(wěn)定期衰退期衰退期細菌生長曲線意義細菌生長曲線意義v遲緩期：一般14h，細菌代謝活躍，但不繁殖。v對數(shù)期：維持48

22、h，細菌快速繁殖，數(shù)目呈幾何級數(shù)增加，細菌形態(tài)、染色性、生理活性最典型、對抗生素最敏感。細菌鑒定選用此期為佳。v穩(wěn)定期： 通常維持10h，活菌數(shù)和死菌數(shù)幾乎相等，代謝產(chǎn)物形成較多。v衰亡期：培養(yǎng)18 24 h以后，代謝逐漸停滯,死菌數(shù)超過活菌數(shù)。常用玻璃器材的處理程序（示教）常用玻璃器材的處理程序（示教）v新購置的玻璃器材:2鹽酸浸泡過夜中和游離堿流水沖洗15次晾干包裝滅菌。 v無污染器皿:洗滌劑洗刷。v病原菌污染的器材（消毒、滅菌后再處理?。涸嚬?、吸管和平皿：高壓蒸汽滅菌趁熱倒出污物洗滌劑浸泡瓶子、試管、吸管用毛刷，平皿用紗布，洗刷干凈。吸管：3來蘇兒或5%石碳酸浸泡過夜。載玻片：3來蘇兒或5%石碳酸浸泡過夜 肥皂水煮沸10min 流水沖洗15次晾干待用。玻璃器材洗干凈的標準玻璃器材洗干凈的標準v1.洗滌時觀察:洗后的玻璃器材附著在內(nèi)壁上的水不是個別水珠水珠,而是一層極薄的水膜水膜。v2.干燥后觀察:對著光亮處觀看玻璃器材,非常透明, 內(nèi)外壁上不出現(xiàn)大片發(fā)白或白點,也無微