動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、第十二章：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特征體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特征 第二節(jié)第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù) 第三節(jié)第三節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定 第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞同步化細(xì)胞同步化 第五節(jié)第五節(jié) 器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動(dòng)物體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動(dòng)物體內(nèi)的組織或器官取出，模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理內(nèi)的組織或器官取出，模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，條件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)育及衰老等生命現(xiàn)象的技術(shù)。動(dòng)

2、物細(xì)胞培發(fā)育及衰老等生命現(xiàn)象的技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有很多優(yōu)越性，但也有不足之處。養(yǎng)有很多優(yōu)越性，但也有不足之處。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)，免疫學(xué)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)，免疫學(xué)，遺傳學(xué)，腫瘤學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，毒理學(xué)和臨遺傳學(xué)，腫瘤學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，毒理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)出了多種生物制品，如狂犬病疫苗，干生產(chǎn)出了多種生物制品，如狂犬病疫苗，干擾素，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素。擾素，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素。第一節(jié)體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特征第一節(jié)體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特征一、體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)（一）生物學(xué)特征的兩重性 1、基本生物學(xué)特征與體

3、內(nèi)細(xì)胞相似 體外培養(yǎng)的細(xì)胞不僅存在細(xì)胞和基質(zhì)的相互關(guān)系， 而且細(xì)胞和細(xì)胞之間在形態(tài)和機(jī)能上還存在著相互關(guān)系 2、差異性 細(xì)胞離體后，失去神經(jīng)和體液調(diào)節(jié)以及細(xì)胞間的相互影響，在體外培養(yǎng)條件下可能會(huì)出現(xiàn)分化現(xiàn)象減弱，形態(tài)功能單一化，生存一定時(shí)間后衰退死亡，出現(xiàn)連續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系等。因此體外培養(yǎng)的細(xì)胞可視為一種在特定條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本機(jī)構(gòu)和功能，也有不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。（二）培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的改變（二）培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的改變1、分化在個(gè)體發(fā)育的過程中，細(xì)胞后代的形態(tài)和功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異過程稱為細(xì)胞分化。細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其原有的功能可能會(huì)迅速改變或消失，

4、但其分化能力并未完全喪失。細(xì)胞是否分化，關(guān)鍵是在于是否存在使細(xì)胞分化的條件，把表皮細(xì)胞放在企業(yè)界面上培養(yǎng)，可分化成含大量角蛋白絲的膠質(zhì)細(xì)胞，但這種能力會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸喪失。2、去分化去分化也叫脫分化是指各種分化細(xì)胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能個(gè)性，表現(xiàn)出某種趨同性的過程。二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)當(dāng)細(xì)胞初一較好的培養(yǎng)條件時(shí)，形態(tài)上有相對(duì)的一致性。在一定程度上能反映細(xì)胞的起源以及正常和異常的區(qū)別，故可作為細(xì)胞形態(tài)學(xué)的一個(gè)指標(biāo)或依據(jù)。但它可受很多因素的影響而發(fā)生改變。（一）貼附型細(xì)胞和懸浮型細(xì)胞1、貼附型細(xì)胞（見下圖） 1） 成纖維細(xì)胞型 2 ）上皮細(xì)胞型 3 ）游走細(xì)胞型

5、 4 ）多形細(xì)胞型2、懸浮性細(xì)胞懸浮性細(xì)胞（二）細(xì)胞帖壁過程（二）細(xì)胞帖壁過程對(duì)于貼壁型細(xì)胞，在液體環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，基本呈圓形，當(dāng)附于支持物表面后，開始仍為圓形，但很快會(huì)發(fā)生形態(tài)上的改變，轉(zhuǎn)變?yōu)閳A餅形即放射延展細(xì)胞。在1/2至2小時(shí)后，過渡為極性細(xì)胞，可呈紡錘形，三角形或不規(guī)則多角形等各種形態(tài)。支持物能影響貼附，底物表面不潔不利于貼附，底物表面帶有陽(yáng)性電荷利于貼附，一些特殊物質(zhì)如LETS，細(xì)胞表面蛋白等也參與貼附過程。（三）接觸抑制和密度抑制（三）接觸抑制和密度抑制細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長(zhǎng)空間漸趨減少，最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如果培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的

6、相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接接觸抑制觸抑制當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。三、培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力三、培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力 體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)處于動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而體外培養(yǎng)細(xì)胞的生體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)處于動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或其他容器。生存空間和營(yíng)養(yǎng)是存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或其他容器。生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)增殖到一定密度時(shí)，則需分離出一部分細(xì)胞并有限的。當(dāng)增殖到一定密度時(shí)，則需分離出一部分細(xì)胞并跟新營(yíng)養(yǎng)液，否則將會(huì)影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程稱跟新營(yíng)養(yǎng)液，否則將

7、會(huì)影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程稱傳代傳代（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期、（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期、 培養(yǎng)細(xì)胞生命期是指細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)增殖和生培養(yǎng)細(xì)胞生命期是指細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類和供長(zhǎng)的時(shí)間。正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何，在細(xì)胞生存全過程中，基本經(jīng)歷以下三個(gè)體的年齡如何，在細(xì)胞生存全過程中，基本經(jīng)歷以下三個(gè)階段階段。1、原代培養(yǎng)基、原代培養(yǎng)基原代培養(yǎng)基也稱初代培養(yǎng)基，即從動(dòng)物機(jī)體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一原代培養(yǎng)基也稱初代培養(yǎng)基，即從動(dòng)物機(jī)體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)一到四周。此期的細(xì)胞移動(dòng)活躍，可見

8、細(xì)胞活次傳代階段，一般持續(xù)一到四周。此期的細(xì)胞移動(dòng)活躍，可見細(xì)胞活躍，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)的細(xì)胞于體內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞性躍，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)的細(xì)胞于體內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞性狀相似，更能代表其來源組織的細(xì)胞類型及組織特異性。狀相似，更能代表其來源組織的細(xì)胞類型及組織特異性。2、傳代期、傳代期初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱為細(xì)胞系。此期最長(zhǎng)，細(xì)胞增殖旺盛，初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱為細(xì)胞系。此期最長(zhǎng)，細(xì)胞增殖旺盛，能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期冷凍。如不冷凍

9、則要反復(fù)倍體細(xì)胞性質(zhì)應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期冷凍。如不冷凍則要反復(fù)傳代。一般，傳代十至五十次左右，細(xì)胞增殖逐漸減慢，甚至停止，傳代。一般，傳代十至五十次左右，細(xì)胞增殖逐漸減慢，甚至停止，進(jìn)入衰退期。進(jìn)入衰退期。3、衰退期、衰退期衰退期的細(xì)胞雖然能存活，但增殖很慢并逐漸停止，進(jìn)而發(fā)生衰退死亡衰退期的細(xì)胞雖然能存活，但增殖很慢并逐漸停止，進(jìn)而發(fā)生衰退死亡傳代細(xì)胞由于目中因素的影響，可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，其標(biāo)志傳代細(xì)胞由于目中因素的影響，可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，其標(biāo)志是細(xì)胞獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即是細(xì)胞獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲得永久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無

10、限細(xì)胞系。細(xì)胞獲得永久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。轉(zhuǎn)化細(xì)胞除了比細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。轉(zhuǎn)化細(xì)胞除了比正常細(xì)胞能分裂更多的代數(shù)之外，還具有不受細(xì)胞密度的正常細(xì)胞能分裂更多的代數(shù)之外，還具有不受細(xì)胞密度的影響，不具有接觸抑制現(xiàn)象和細(xì)胞形狀不規(guī)則，出現(xiàn)異常影響，不具有接觸抑制現(xiàn)象和細(xì)胞形狀不規(guī)則，出現(xiàn)異常染色體的特性。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。染色體的特性。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。（二）培養(yǎng)細(xì)胞（二）培養(yǎng)細(xì)胞“一代一代”生存期生存期 體外培養(yǎng)的細(xì)胞當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后，都需要做傳代體外培養(yǎng)的細(xì)胞當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后，都需要做

11、傳代處理。處理。 所謂細(xì)胞所謂細(xì)胞“一代一代”是指從細(xì)胞接種到分離在培養(yǎng)是指從細(xì)胞接種到分離在培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間。它與細(xì)胞世代和倍增不同，在細(xì)胞一代中，時(shí)的一段時(shí)間。它與細(xì)胞世代和倍增不同，在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增三至六次。每一代的細(xì)胞群體都會(huì)經(jīng)歷以下四細(xì)胞能倍增三至六次。每一代的細(xì)胞群體都會(huì)經(jīng)歷以下四個(gè)階段：個(gè)階段：1、潛伏期、潛伏期 2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 3、穩(wěn)定期、穩(wěn)定期 4、衰亡、衰亡期期1、潛伏期：、潛伏期：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中懸浮狀態(tài)的懸浮期，細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中懸浮狀態(tài)的懸浮期，此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于第五表面上的

12、此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于第五表面上的過程，稱為貼壁，懸浮期結(jié)束。過程，稱為貼壁，懸浮期結(jié)束。細(xì)胞貼附于支持物后，要經(jīng)過一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處細(xì)胞貼附于支持物后，要經(jīng)過一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處于潛伏期可有運(yùn)動(dòng)行為，基本無增殖，少見分裂相。細(xì)胞潛伏期和細(xì)胞密度、于潛伏期可有運(yùn)動(dòng)行為，基本無增殖，少見分裂相。細(xì)胞潛伏期和細(xì)胞密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，24至至96h或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅

13、624h；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。伏期短。2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入對(duì)：當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。這是細(xì)胞增長(zhǎng)最旺盛的階段。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為數(shù)生長(zhǎng)期。這是細(xì)胞增長(zhǎng)最旺盛的階段。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)MI表示，即細(xì)表示，即細(xì)胞群中每胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。MI=（分裂相個(gè)數(shù)（分裂相個(gè)數(shù)/1000個(gè)細(xì)胞）個(gè)細(xì)胞）100%3、穩(wěn)定期、穩(wěn)

14、定期細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞逐漸停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞逐漸停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)再增加，故也稱平頂期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)逐漸耗盡，代謝產(chǎn)物積累，液中營(yíng)養(yǎng)逐漸耗盡，代謝產(chǎn)物積累，ph降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)培養(yǎng)即傳代，降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，甚至從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，甚至從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。4、衰亡期、衰亡期一個(gè)達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期的細(xì)胞群體，由于生長(zhǎng)環(huán)境

15、的繼續(xù)惡化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的短一個(gè)達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期的細(xì)胞群體，由于生長(zhǎng)環(huán)境的繼續(xù)惡化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的短缺，群體中細(xì)胞死亡率則逐漸上升，以致細(xì)胞死亡數(shù)逐漸超過新生細(xì)胞數(shù)，缺，群體中細(xì)胞死亡率則逐漸上升，以致細(xì)胞死亡數(shù)逐漸超過新生細(xì)胞數(shù)，群體中活細(xì)胞數(shù)下降。群體中活細(xì)胞數(shù)下降。（二）原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)（二）原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)1、原代培養(yǎng)、原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)即第一次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外原代培養(yǎng)即第一次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長(zhǎng)環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)生長(zhǎng)環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。由于原代細(xì)胞離體時(shí)間短，其原有的生物過程。由于原代細(xì)胞離體時(shí)間短，其原有的生物學(xué)特征仍然保

16、持。一般在原代培養(yǎng)時(shí)期合適于作學(xué)特征仍然保持。一般在原代培養(yǎng)時(shí)期合適于作藥物測(cè)試，細(xì)胞分化等方面的研究。藥物測(cè)試，細(xì)胞分化等方面的研究。（1）組織塊培養(yǎng)法）組織塊培養(yǎng)法1）薄層培養(yǎng)法）薄層培養(yǎng)法2）翻轉(zhuǎn)干涸法）翻轉(zhuǎn)干涸法 1、取材修剪沖洗 2、剪切成1mm3 小塊 3、移入培養(yǎng)瓶 4、分布組織小塊間距5mm 5翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液37*c靜止12h 6、翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng) 7、原代細(xì)胞培養(yǎng)（2）分散細(xì)胞培養(yǎng)法）分散細(xì)胞培養(yǎng)法1）機(jī)械分散法）機(jī)械分散法采用一些纖維成分很少的組織進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以直接用分散法采用一些纖維成分很少的組織進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以直接用分散法進(jìn)行分散?？蓪⒔M織直接用剪刀剪切，用吸

17、管吸打，這種進(jìn)行分散。可將組織直接用剪刀剪切，用吸管吸打，這種對(duì)組織損傷較大，一般可用注射器針心擠壓通過不銹鋼網(wǎng)對(duì)組織損傷較大，一般可用注射器針心擠壓通過不銹鋼網(wǎng)的方法。的方法。2）消化分散法）消化分散法使用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞的使用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞的方法。消化培養(yǎng)法可以將細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，方法。消化培養(yǎng)法可以將細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，是的細(xì)胞分散，形成懸液，適用于大量組織的分離。常用是的細(xì)胞分散，形成懸液，適用于大量組織的分離。常用的消化液有胰蛋白酶，膠原酶。另外，鏈酶蛋白酶，黏蛋的消化液有胰蛋白酶，膠原酶。另外，

18、鏈酶蛋白酶，黏蛋白酶，蝸牛酶等也可以用于細(xì)胞的分化。白酶，蝸牛酶等也可以用于細(xì)胞的分化。膠原酶膠原酶是從細(xì)菌中提取的酶，對(duì)膠原和細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化是從細(xì)菌中提取的酶，對(duì)膠原和細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用，適用于分離纖維性組織，上皮組織和癌組織，作用，適用于分離纖維性組織，上皮組織和癌組織，Ga Mg 和血清成分不會(huì)影響膠原酶的消化作用，作用溫和，無和血清成分不會(huì)影響膠原酶的消化作用，作用溫和，無須機(jī)械振動(dòng)。其常用量為須機(jī)械振動(dòng)。其常用量為200iu/ml胰蛋白酶胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞

19、分離。胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。2、傳代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)增殖一段時(shí)間到達(dá)一定的細(xì)胞密度后，就應(yīng)當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)增殖一段時(shí)間到達(dá)一定的細(xì)胞密度后，就應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞分離到新的培養(yǎng)器皿并補(bǔ)充新的培養(yǎng)培養(yǎng)液進(jìn)行當(dāng)將細(xì)胞分離到新的培養(yǎng)器皿并補(bǔ)充新的培養(yǎng)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，即為細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。在首次培養(yǎng)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：培養(yǎng)，即為細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。在首次培養(yǎng)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1細(xì)胞沒有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不細(xì)胞沒有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代，要急于傳代，2原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng)，上皮樣細(xì)原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng)，上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并

20、存的情況很多見，傳代時(shí)不同的細(xì)胞胞和成纖維樣細(xì)胞并存的情況很多見，傳代時(shí)不同的細(xì)胞有不同的傳代時(shí)間，因而要根據(jù)需要注意觀察并及時(shí)進(jìn)行有不同的傳代時(shí)間，因而要根據(jù)需要注意觀察并及時(shí)進(jìn)行處理，處理，3首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多些，使細(xì)胞盡快適首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多些，使細(xì)胞盡快適應(yīng)新的環(huán)境而李宇細(xì)胞生存和增殖。應(yīng)新的環(huán)境而李宇細(xì)胞生存和增殖。貼壁細(xì)胞的傳代大都采用酶消化法來進(jìn)行。部分貼壁生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞的傳代大都采用酶消化法來進(jìn)行。部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞可用直接吹打或離心分離后傳代。懸浮細(xì)胞可直接傳細(xì)胞可用直接吹打或離心分離后傳代。懸浮細(xì)胞可直接傳代。代。 （1）貼壁細(xì)胞的消化法傳代 （2）懸浮細(xì)胞

21、的傳代（三）細(xì)胞純化（三）細(xì)胞純化1、自然純化、自然純化自然純化是利用某一細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，而排擠其他細(xì)胞生長(zhǎng)，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)細(xì)自然純化是利用某一細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，而排擠其他細(xì)胞生長(zhǎng)，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，去除其他細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。胞，去除其他細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。2、人工純化、人工純化（1）酶消化法）酶消化法： 1）先用）先用0，5%胰蛋白酶和胰蛋白酶和0，02%EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞，然后）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞，然后再換新的混合液繼續(xù)消化，之后在導(dǎo)致的顯微鏡下觀察并不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，等再換新的混合液繼續(xù)消化，之后在導(dǎo)致的顯微鏡下觀察并不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，等到半數(shù)細(xì)胞脫落下來

22、后，便立即停止消化。到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后，便立即停止消化。 2）吧消化液吸入離心管中，離心去上清，然后移入另一培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液）吧消化液吸入離心管中，離心去上清，然后移入另一培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)，再向原瓶中也不加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，置溫箱中培養(yǎng)，再向原瓶中也不加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可把成纖維細(xì)胞除凈。可把成纖維細(xì)胞除凈。（2）機(jī)械刮除法）機(jī)械刮除法 1)標(biāo)記標(biāo)記 鏡下觀察，在培養(yǎng)皿背面圈下上皮細(xì)胞生長(zhǎng)部位鏡下觀察，在培養(yǎng)皿背面圈下上皮細(xì)胞生長(zhǎng)部位 2)刮除刮除 棄培養(yǎng)基，把無菌刀深入瓶中，肉眼或顯微鏡下刮除無標(biāo)記空間棄培養(yǎng)基，把無菌刀深入瓶中，肉

23、眼或顯微鏡下刮除無標(biāo)記空間 3)沖洗沖洗 用用hanks液沖洗液沖洗1或或2次，洗出被掛掉的細(xì)胞次，洗出被掛掉的細(xì)胞 4）培養(yǎng)）培養(yǎng) 然后注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞存留，可重刮除然后注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞存留，可重刮除（3）反復(fù)貼壁法）反復(fù)貼壁法 操作方法與貼壁細(xì)胞傳代基本相同操作方法與貼壁細(xì)胞傳代基本相同（4）克隆法）克隆法（5）流式細(xì)胞儀技術(shù)）流式細(xì)胞儀技術(shù)（6）其他純化方法）其他純化方法（四）細(xì)胞的凍存復(fù)蘇及運(yùn)輸（四）細(xì)胞的凍存復(fù)蘇及運(yùn)輸1、細(xì)胞冷凍保存、細(xì)胞冷凍保存（1）細(xì)胞超低溫保存的原理）細(xì)胞超低溫保存的原理細(xì)胞在細(xì)胞在-70*c以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活

24、性降低，代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性降低，代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵在于通過期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵在于通過-200*c階段的處理過程。在此溫度范階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，易造成細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。如果不加保護(hù)直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)晶，圍內(nèi)，易造成細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。如果不加保護(hù)直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)晶，導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)濃度增高，導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)濃度增高，ph改變，部分蛋白質(zhì)變性，溶酶體膜受損而導(dǎo)致改變，部分蛋白質(zhì)變性，溶酶體膜受損而導(dǎo)致溶解酶釋放破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而造成細(xì)胞死亡。因此，為了減少細(xì)胞內(nèi)的冰溶解酶釋放破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而造成細(xì)胞死亡。

25、因此，為了減少細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成，一般在培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑以減少冰晶形成和細(xì)胞死亡。晶形成，一般在培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑以減少冰晶形成和細(xì)胞死亡。根據(jù)冷凍保護(hù)劑是否透過細(xì)胞膜可將其分為：根據(jù)冷凍保護(hù)劑是否透過細(xì)胞膜可將其分為：1滲透性保護(hù)劑滲透性保護(hù)劑2非滲透性保護(hù)劑非滲透性保護(hù)劑最常用的保護(hù)劑為最常用的保護(hù)劑為dmso本身對(duì)細(xì)菌有毒性作用，可自身滅菌。本身對(duì)細(xì)菌有毒性作用，可自身滅菌。（2）細(xì)胞冷凍過程）細(xì)胞冷凍過程將對(duì)數(shù)期細(xì)胞以等體積將對(duì)數(shù)期細(xì)胞以等體積20%DMSO培養(yǎng)液重懸，并分裝于冷凍管或安培平中，封培養(yǎng)液重懸，并分裝于冷凍管或安培平中，封口，然后降溫至口，然后降溫至4*c30min，冰盒

26、，冰盒10min，液氮罐氣相，液氮罐氣相2h，最后投入液氮中保，最后投入液氮中保存。存。2、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇（1）離心法）離心法1）取出冷凍管，迅速投入）取出冷凍管，迅速投入3740*c水浴中，振蕩，使之融化。水浴中，振蕩，使之融化。2）吸入到）吸入到10ml的培養(yǎng)液中，混懸，離心洗滌的培養(yǎng)液中，混懸，離心洗滌1或或2次次3）取上清加培養(yǎng)液，調(diào)濃度為）取上清加培養(yǎng)液，調(diào)濃度為1*1052*105個(gè)個(gè)/ml（2）直接鋪板法）直接鋪板法取貯存細(xì)胞，取貯存細(xì)胞，37*c水浴中快速融化，移入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)集中，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，水浴中快速融化，移入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)集中，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，密度密度3

27、*105個(gè)個(gè)/ml 培養(yǎng)培養(yǎng)1224小時(shí)，更換新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以去除冷小時(shí)，更換新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以去除冷凍劑。凍劑。3.細(xì)胞運(yùn)輸1冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸2充液法1）選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，待接近或剛連接成片時(shí)去掉培養(yǎng)液，充新培養(yǎng)液，液量達(dá)到瓶頸部，擰緊螺帽，保留微量空氣；2）妥善包轉(zhuǎn)運(yùn)送，瓶口用膠帶密封，并用棉花等做防震防壓處理。3）到目的地后，倒出大部分培養(yǎng)液，僅保留維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需液量，置于37*c培養(yǎng)，次日傳代二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法（一）懸滴培養(yǎng)法（二）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法（三）培養(yǎng)板培養(yǎng)法（四）旋轉(zhuǎn)管 培養(yǎng)法（五）灌注小室培養(yǎng)法（六）克隆培養(yǎng)法六、單細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)主

28、要分為三種，即多孔塑料板克隆六、單細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)主要分為三種，即多孔塑料板克隆細(xì)胞法、瓊脂培養(yǎng)法和飼養(yǎng)細(xì)胞層克隆法細(xì)胞法、瓊脂培養(yǎng)法和飼養(yǎng)細(xì)胞層克隆法1、多孔塑料板克隆細(xì)胞法多孔塑料板克隆細(xì)胞法首先將細(xì)胞懸液混合均勻，在每孔內(nèi)加入，首先將細(xì)胞懸液混合均勻，在每孔內(nèi)加入，0，1ml的細(xì)胞懸液。加完后的細(xì)胞懸液。加完后迅速蓋好蓋板，鏡檢，記錄含有單個(gè)細(xì)胞的孔。觀察時(shí)要特別注意孔迅速蓋好蓋板，鏡檢，記錄含有單個(gè)細(xì)胞的孔。觀察時(shí)要特別注意孔底邊緣，凡不能確認(rèn)者不要計(jì)算在內(nèi)，用筆標(biāo)記。然后于底邊緣，凡不能確認(rèn)者不要計(jì)算在內(nèi)，用筆標(biāo)記。然后于co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。等到培養(yǎng)板孔內(nèi)細(xì)胞增至進(jìn)

29、行原代和傳代培養(yǎng)。等到培養(yǎng)板孔內(nèi)細(xì)胞增至500600個(gè)時(shí)，可以個(gè)時(shí)，可以進(jìn)行分離培養(yǎng)。進(jìn)行分離培養(yǎng)。2、瓊脂培養(yǎng)、瓊脂培養(yǎng)當(dāng)瓊脂凝固時(shí)，可以把細(xì)胞接種在瓊脂表面，生長(zhǎng)成克隆后，容易分離，當(dāng)瓊脂凝固時(shí)，可以把細(xì)胞接種在瓊脂表面，生長(zhǎng)成克隆后，容易分離，適于做單細(xì)胞克隆。此外，也可以用營(yíng)養(yǎng)液配成軟瓊脂，在溶解狀態(tài)適于做單細(xì)胞克隆。此外，也可以用營(yíng)養(yǎng)液配成軟瓊脂，在溶解狀態(tài)下把細(xì)胞與之混合起來，細(xì)胞在松軟的瓊脂中攝取營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)，軟瓊下把細(xì)胞與之混合起來，細(xì)胞在松軟的瓊脂中攝取營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)，軟瓊脂培養(yǎng)是測(cè)定克隆形成率及測(cè)試轉(zhuǎn)化細(xì)胞形狀的重要手段。脂培養(yǎng)是測(cè)定克隆形成率及測(cè)試轉(zhuǎn)化細(xì)胞形狀的重要手段。3、飼

30、養(yǎng)細(xì)胞層克隆法、飼養(yǎng)細(xì)胞層克隆法此法是將飼養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)兩天后，即可接種準(zhǔn)備克隆的此法是將飼養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)兩天后，即可接種準(zhǔn)備克隆的細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞也稱為滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過特殊處理的用做克隆底細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞也稱為滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過特殊處理的用做克隆底物的細(xì)胞層物的細(xì)胞層三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是指在人工條件下，在細(xì)胞生物反動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是指在人工條件下，在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的方法。應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的方法。（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞

31、相比有顯著差別：動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞相比有顯著差別：1）動(dòng)物細(xì)胞比微）動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大的多，無細(xì)胞壁，耐機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏生物細(xì)胞大的多，無細(xì)胞壁，耐機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差感，適應(yīng)環(huán)境能力差2）倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受微）倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受微生物感染，培養(yǎng)時(shí)需要抗生素生物感染，培養(yǎng)時(shí)需要抗生素3）培養(yǎng)過程需氧量少）培養(yǎng)過程需氧量少4）培）培養(yǎng)過程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在養(yǎng)過程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在5）原代培養(yǎng)細(xì)胞）原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖一般繁殖50代即退化死亡代即退化死亡 6）代謝產(chǎn)物具有生物活性，）代謝產(chǎn)物具有生物活性， 生產(chǎn)成本高，但附加值也高

32、生產(chǎn)成本高，但附加值也高1、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)2、反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)、反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)3、懸浮培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)4、固定化培養(yǎng)、固定化培養(yǎng) 是將動(dòng)物細(xì)胞與非水溶性載體結(jié)合起來，在生物反應(yīng)器中是將動(dòng)物細(xì)胞與非水溶性載體結(jié)合起來，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的方法。進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的方法。固定化培養(yǎng)（1）微載體系統(tǒng)1)微載體法2）多空載體或大孔微載體法其優(yōu)點(diǎn)：1比表面積大，是實(shí)心微載體的幾 倍甚至幾十倍2細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)，受到保護(hù)，剪切損傷少3細(xì)胞三維生長(zhǎng)，細(xì)胞密度是實(shí)心微載體的十倍以上，有的可達(dá)108個(gè)/ml 4適用于長(zhǎng)期維持培養(yǎng)5實(shí)心載體在培養(yǎng)液中濃度怎大到一定時(shí)，細(xì)胞密度反而下降，大孔微載體在濃度較高時(shí)，

33、表面碰撞增加，能促使細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)6最適合與蛋白質(zhì)生產(chǎn)，因此有人預(yù)言，大孔微載體技術(shù)將成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一種常用方式。（2）中空纖維培養(yǎng)技術(shù)(3)微囊培養(yǎng)系統(tǒng)（二）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器種類（二）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器種類1、攪拌式生物反應(yīng)器、攪拌式生物反應(yīng)器 1）供養(yǎng)方式）供養(yǎng)方式 一般情況下，攪拌式反應(yīng)器常伴有鼓泡，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供一般情況下，攪拌式反應(yīng)器常伴有鼓泡，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供所需養(yǎng)分。因動(dòng)物細(xì)胞對(duì)鼓泡敏感，所以對(duì)供養(yǎng)方式進(jìn)行改進(jìn)，生產(chǎn)了籠式所需養(yǎng)分。因動(dòng)物細(xì)胞對(duì)鼓泡敏感，所以對(duì)供養(yǎng)方式進(jìn)行改進(jìn)，生產(chǎn)了籠式供養(yǎng)方式的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器。特點(diǎn)是既能保證混合效果又有竟可能小

34、的剪切供養(yǎng)方式的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器。特點(diǎn)是既能保證混合效果又有竟可能小的剪切力，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的要求。力，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的要求。 2）攪拌器）攪拌器 改進(jìn)中，再攪拌器較薄而面積較大，或攪拌角較大而攪拌速改進(jìn)中，再攪拌器較薄而面積較大，或攪拌角較大而攪拌速度較低的情況下，可顯著降低剪切力。度較低的情況下，可顯著降低剪切力。2、氣升式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器 其是以氣體為動(dòng)力，靠導(dǎo)流裝置引導(dǎo)，形成氣液混合式的總體有序循環(huán)。其是以氣體為動(dòng)力，靠導(dǎo)流裝置引導(dǎo)，形成氣液混合式的總體有序循環(huán)。3、填充床反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器填充床反應(yīng)器中，細(xì)胞可以位于支持物表面，也可以包埋于支持物之中，培填充床反應(yīng)器中，細(xì)

35、胞可以位于支持物表面，也可以包埋于支持物之中，培養(yǎng)物流經(jīng)支持物顆粒。細(xì)胞被固定于支持物之中時(shí)，填充床反應(yīng)器每單位體養(yǎng)物流經(jīng)支持物顆粒。細(xì)胞被固定于支持物之中時(shí)，填充床反應(yīng)器每單位體積能容納大量細(xì)胞。但是，填充床式固定化細(xì)胞反應(yīng)器存在許多缺點(diǎn)。由于積能容納大量細(xì)胞。但是，填充床式固定化細(xì)胞反應(yīng)器存在許多缺點(diǎn)。由于其混合效果低，對(duì)必要的氧傳遞其混合效果低，對(duì)必要的氧傳遞,ph,溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成了困難。溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成了困難。4、流化床反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器 其是通過流體的上升運(yùn)動(dòng)使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)即流化狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)的其是通過流體的上升運(yùn)動(dòng)使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)即流化狀

36、態(tài)進(jìn)行反應(yīng)的裝置。有魚固體顆粒和流體充分地進(jìn)行混合，因而流化床反應(yīng)器具有傳熱傳裝置。有魚固體顆粒和流體充分地進(jìn)行混合，因而流化床反應(yīng)器具有傳熱傳質(zhì)性能好，可使用較小顆粒催化劑，床層壓力小等特點(diǎn)。但同時(shí)也帶來固體質(zhì)性能好，可使用較小顆粒催化劑，床層壓力小等特點(diǎn)。但同時(shí)也帶來固體催化劑磨損較大的不足。催化劑磨損較大的不足。 （三）大規(guī)模培養(yǎng)操作方式可分為分批式，流加式，半連續(xù)式，連續(xù)式和灌流式。其中，分批式，半連續(xù)式，連續(xù)式和植物細(xì)胞培養(yǎng)基本相同。1、分批式培養(yǎng)分批式培養(yǎng)是將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中和外界沒有物料交換。其體積不變，到細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成

37、積累到一定時(shí)間，一次性收獲細(xì)胞和產(chǎn)物。周期一般在三到五天，收獲產(chǎn)物一般是在細(xì)胞快要死亡或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。2、流加式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜環(huán)境下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，根據(jù)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和需求，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)基，流加速度和消耗的速率相同按底物濃度控制相應(yīng)的流加過程，從而使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至較高的濃度，目標(biāo)產(chǎn)物達(dá)到較高的水平。通常流加多在指數(shù)生長(zhǎng)后期，細(xì)胞在進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在細(xì)胞衰亡后終止整個(gè)體系，進(jìn)行分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮，純化產(chǎn)物。其特點(diǎn)是能調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物的濃度。一，可以避免因某種營(yíng)養(yǎng)成分初始濃度太高而產(chǎn)生抑制現(xiàn)象。二，能防

38、止某些限制性成分在培養(yǎng)過程中被耗盡而影響而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成，這是流加式操作和分批式操作的明顯不同。此外，由于新鮮營(yíng)養(yǎng)液的加入，整個(gè)過程中反應(yīng)體積變化，這也是其重要特征。3、半連續(xù)式培養(yǎng)、半連續(xù)式培養(yǎng)、其特點(diǎn)是培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物的體積逐漸增加，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持其特點(diǎn)是培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物的體積逐漸增加，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變；細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培不變；細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間；可進(jìn)行多次回收。養(yǎng)過程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間；可進(jìn)行多次回收。4、連續(xù)式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)

39、模式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式事將是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式事將細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)到最大細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)到最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)田間新鮮培養(yǎng)基。同時(shí)，含有細(xì)胞密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)田間新鮮培養(yǎng)基。同時(shí)，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可以無限連續(xù)下去。其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，講，該過程可以無限連續(xù)下去

40、。其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。細(xì)胞濃度以及細(xì)胞的生長(zhǎng)速率可維持不變。細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。細(xì)胞濃度以及細(xì)胞的生長(zhǎng)速率可維持不變。5、灌流式培養(yǎng)、灌流式培養(yǎng)是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，不斷是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，不斷將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式培養(yǎng)的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器培養(yǎng)的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在

41、取培養(yǎng)物的同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物的同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)107109個(gè)個(gè)/mL，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量。連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量。連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；反應(yīng)速率容易穩(wěn)定的處在較好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，

42、目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。這種方法最大時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。這種方法最大困難是污染概率較高，且存在長(zhǎng)期培養(yǎng)中保持細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性以及規(guī)困難是污染概率較高，且存在長(zhǎng)期培養(yǎng)中保持細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性以及規(guī)模放大過程中的工程問題。模放大過程中的工程問題。（四）動(dòng)物細(xì)胞工程表達(dá)產(chǎn)品應(yīng)用（四）動(dòng)物細(xì)胞工程表達(dá)產(chǎn)品應(yīng)用20世紀(jì)世紀(jì)60年代初，英國(guó)年代初，英國(guó)AVRI研究所在貼壁細(xì)胞系研究所在貼壁細(xì)胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)藥

43、物成功后，動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)藥物和疫苗越來越受人們的重視并在疾病防御方面也得到了應(yīng)用。和疫苗越來越受人們的重視并在疾病防御方面也得到了應(yīng)用。1、疫苗、疫苗是用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。美國(guó)公司應(yīng)用是用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。美國(guó)公司應(yīng)用SV40作為載體，作為載體，將乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，已獲得高效表達(dá)，并制成乙型將乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，已獲得高效表達(dá)，并制成乙型肝炎疫苗。目前，已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病肝炎疫苗。目前，已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病

44、病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰疹病毒疫苗和巨細(xì)胞病毒病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰疹病毒疫苗和巨細(xì)胞病毒疫苗等。這些疫苗已被大規(guī)模應(yīng)用。疫苗等。這些疫苗已被大規(guī)模應(yīng)用。2、單克隆抗體、單克隆抗體應(yīng)用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)各種不同的單克隆抗體是經(jīng)濟(jì)可靠地方法。英國(guó)應(yīng)用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)各種不同的單克隆抗體是經(jīng)濟(jì)可靠地方法。英國(guó)的的Celltech公司采用公司采用100L和和1000L自動(dòng)氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)各種生產(chǎn)單克隆自動(dòng)氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)各種生產(chǎn)單克隆抗體的小鼠、大鼠和人的細(xì)胞株，生產(chǎn)各種單克隆抗體的產(chǎn)品，已應(yīng)用于疾病抗體的小鼠、大鼠和人的細(xì)胞株，生產(chǎn)各

45、種單克隆抗體的產(chǎn)品，已應(yīng)用于疾病診斷、治療和免疫學(xué)研究。診斷、治療和免疫學(xué)研究。3、基因重組產(chǎn)品、基因重組產(chǎn)品動(dòng)物細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)譯和加工較大或更復(fù)雜的蛋白質(zhì)。此外動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)譯和加工較大或更復(fù)雜的蛋白質(zhì)。此外動(dòng)物細(xì)胞還可以把人們所需的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液內(nèi)，而從培養(yǎng)液分離蛋白質(zhì)還可以把人們所需的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液內(nèi)，而從培養(yǎng)液分離蛋白質(zhì)要比細(xì)胞勻漿更容易。因此，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式可大量生產(chǎn)基因要比細(xì)胞勻漿更容易。因此，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式可大量生產(chǎn)基因重組產(chǎn)品。如美國(guó)的重組產(chǎn)品。如美國(guó)的En -dotronic公司用公司用Acusyst-P型中空纖維培養(yǎng)型中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)出了

46、免疫球蛋白系統(tǒng)生產(chǎn)出了免疫球蛋白G、A和和M，尿激酶，人生長(zhǎng)激素，乙型肝炎，尿激酶，人生長(zhǎng)激素，乙型肝炎表面抗原等產(chǎn)品。表面抗原等產(chǎn)品。目前，國(guó)內(nèi)外采用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的藥物主要有重組人粒細(xì)胞集落刺激目前，國(guó)內(nèi)外采用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的藥物主要有重組人粒細(xì)胞集落刺激因子、因子、a-2a干擾素、干擾素、a-2b干擾素、干擾素、y-干擾素、人白細(xì)胞介素干擾素、人白細(xì)胞介素-2、重組、重組人紅細(xì)胞生成素、表皮生長(zhǎng)因子和重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。人紅細(xì)胞生成素、表皮生長(zhǎng)因子和重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。第三節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定一、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定和細(xì)胞系（株）的建立一、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定

47、和細(xì)胞系（株）的建立 由于體內(nèi)和體外環(huán)境不同，培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性與體內(nèi)細(xì)胞有所不同。在培養(yǎng)由于體內(nèi)和體外環(huán)境不同，培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性與體內(nèi)細(xì)胞有所不同。在培養(yǎng)細(xì)胞期間，要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)性檢測(cè)，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、營(yíng)養(yǎng)液和微生細(xì)胞期間，要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)性檢測(cè)，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、營(yíng)養(yǎng)液和微生物污染等方面。一旦細(xì)胞生長(zhǎng)成形態(tài)上單一的細(xì)胞群或細(xì)系后，還要做一系列的細(xì)胞物污染等方面。一旦細(xì)胞生長(zhǎng)成形態(tài)上單一的細(xì)胞群或細(xì)系后，還要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)方面的檢測(cè)。生物學(xué)方面的檢測(cè)。（一）、細(xì)胞形態(tài)觀察（一）、細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞形態(tài)的觀察內(nèi)容主要包括細(xì)胞的形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小

48、和多少細(xì)胞形態(tài)的觀察內(nèi)容主要包括細(xì)胞的形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小和多少以及微絲微管的排列狀態(tài)等。一般生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，在相差顯微鏡下觀察，輪廓以及微絲微管的排列狀態(tài)等。一般生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，在相差顯微鏡下觀察，輪廓清晰，如細(xì)胞生長(zhǎng)條件改變或細(xì)胞功能不良時(shí)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒清晰，如細(xì)胞生長(zhǎng)條件改變或細(xì)胞功能不良時(shí)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可以變得不規(guī)則，如上皮細(xì)胞變成纖維類細(xì)胞。狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可以變得不規(guī)則，如上皮細(xì)胞變成纖維類細(xì)胞。（二）、細(xì)胞生長(zhǎng)情況（二）、細(xì)胞生長(zhǎng)情況1、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)

49、定 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是觀察細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律的重要方法。因而，在細(xì)胞的生長(zhǎng)特性觀察中，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是觀察細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律的重要方法。因而，在細(xì)胞的生長(zhǎng)特性觀察中，生長(zhǎng)曲線的測(cè)定是最為基本的指標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似生長(zhǎng)曲線的測(cè)定是最為基本的指標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“S”形。一般在傳代后形。一般在傳代后第一天細(xì)胞數(shù)有所減少，在經(jīng)過幾天的潛伏適應(yīng)期，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)到平臺(tái)期后第一天細(xì)胞數(shù)有所減少，在經(jīng)過幾天的潛伏適應(yīng)期，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)到平臺(tái)期后生長(zhǎng)穩(wěn)定，最后衰老。生長(zhǎng)穩(wěn)定，最后衰老。 在生長(zhǎng)曲線上細(xì)胞數(shù)量增加一倍的時(shí)間，稱為細(xì)胞倍增時(shí)間，可以從曲線上換算在生長(zhǎng)曲線上細(xì)胞數(shù)量增加一倍的時(shí)間，稱為細(xì)胞倍

50、增時(shí)間，可以從曲線上換算出。細(xì)胞倍增的時(shí)間區(qū)間即細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞傳代、實(shí)驗(yàn)等都應(yīng)在此區(qū)間進(jìn)行。出。細(xì)胞倍增的時(shí)間區(qū)間即細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞傳代、實(shí)驗(yàn)等都應(yīng)在此區(qū)間進(jìn)行。細(xì)胞群體倍增時(shí)間的計(jì)算方法有兩種，一為通過作圖方法在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞群體倍增時(shí)間的計(jì)算方法有兩種，一為通過作圖方法在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期找出細(xì)胞增長(zhǎng)一倍所需的時(shí)間，即倍增時(shí)間；二為通過公式按細(xì)胞倍增時(shí)間計(jì)算細(xì)期找出細(xì)胞增長(zhǎng)一倍所需的時(shí)間，即倍增時(shí)間；二為通過公式按細(xì)胞倍增時(shí)間計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。常用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法有：胞群體倍增時(shí)間。常用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法有：（1）細(xì)胞計(jì)數(shù)法）細(xì)胞計(jì)數(shù)法 1） 將細(xì)

51、胞利用一般傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液。經(jīng)計(jì)數(shù)后，精確地將將細(xì)胞利用一般傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液。經(jīng)計(jì)數(shù)后，精確地將細(xì)胞分別接種于細(xì)胞分別接種于2130個(gè)大小一致的培養(yǎng)瓶中。每瓶細(xì)胞總數(shù)要求一致，加個(gè)大小一致的培養(yǎng)瓶中。每瓶細(xì)胞總數(shù)要求一致，加入培養(yǎng)液的量也要一致。細(xì)胞接種數(shù)不能過多，也不能太少，太少細(xì)胞適應(yīng)入培養(yǎng)液的量也要一致。細(xì)胞接種數(shù)不能過多，也不能太少，太少細(xì)胞適應(yīng)期太長(zhǎng)；數(shù)量太多細(xì)胞將很快進(jìn)入增殖穩(wěn)定期，需要在短期內(nèi)進(jìn)行傳代，生期太長(zhǎng)；數(shù)量太多細(xì)胞將很快進(jìn)入增殖穩(wěn)定期，需要在短期內(nèi)進(jìn)行傳代，生長(zhǎng)曲線不能確切反應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。一般接種數(shù)量以長(zhǎng)曲線不能確切反應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。一般接

52、種數(shù)量以710天能長(zhǎng)滿而不發(fā)生天能長(zhǎng)滿而不發(fā)生生長(zhǎng)抑制為度。同種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線先后測(cè)定要采用同一接種密度，這樣才生長(zhǎng)抑制為度。同種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線先后測(cè)定要采用同一接種密度，這樣才能做縱向比較。不同細(xì)胞也要接種細(xì)胞數(shù)相同，才能進(jìn)行比較。能做縱向比較。不同細(xì)胞也要接種細(xì)胞數(shù)相同，才能進(jìn)行比較。2)每天或隔天取出每天或隔天取出3瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。一般每隔瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。一般每隔24h取取1瓶，連續(xù)觀察瓶，連續(xù)觀察一至二周或到細(xì)胞總數(shù)有一至二周或到細(xì)胞總數(shù)有 明顯減少為止。培養(yǎng)三到五天后常要給未計(jì)數(shù)的細(xì)明顯減少為止。培養(yǎng)三到五天后常要給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液。胞換液。3）以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，

53、細(xì)胞數(shù)為縱軸，連接成曲線后即成該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。）以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，連接成曲線后即成該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。（2）四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)）四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)四唑鹽是一種能接受氫原子的燃料，簡(jiǎn)稱四唑鹽是一種能接受氫原子的燃料，簡(jiǎn)稱MTT?；驹硎腔罴?xì)胞線粒體中的。基本原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在中，而死細(xì)胞無此功能。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反應(yīng)其細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，可間接

54、反應(yīng)其細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量和細(xì)結(jié)晶物形成的量和細(xì)胞數(shù)成正比。它的特點(diǎn)是靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，無放射性污染。胞數(shù)成正比。它的特點(diǎn)是靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，無放射性污染。（3）CCK-8試劑盒檢測(cè)法試劑盒檢測(cè)法其基本原理是，該試劑中含有其基本原理是，該試劑中含有WST-8，它在電子載體，它在電子載體1-甲氧基甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲酸二甲酯的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲贊產(chǎn)物。生成的數(shù)量和活細(xì)胞的數(shù)量成正比，細(xì)胞增殖越多，則顏色越深。贊產(chǎn)物。生成的

55、數(shù)量和活細(xì)胞的數(shù)量成正比，細(xì)胞增殖越多，則顏色越深。CCK-8與與MTT的不同之處在于的不同之處在于CCK-8法生成的法生成的formazan是水溶性的，不需要再是水溶性的，不需要再吸出培養(yǎng)液加入有機(jī)溶劑溶解這一步，因此可以減少誤差。優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性和吸出培養(yǎng)液加入有機(jī)溶劑溶解這一步，因此可以減少誤差。優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性和靈敏度優(yōu)于靈敏度優(yōu)于MTT，對(duì)細(xì)胞毒性小。，對(duì)細(xì)胞毒性小。2、細(xì)胞分裂指數(shù) 分裂指數(shù)是指細(xì)胞群體中分裂細(xì)胞所占的百分比，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)/1000個(gè)細(xì)胞。獲得細(xì)胞相數(shù)值后，可以繪制成細(xì)胞分裂指數(shù)曲線。一般細(xì)胞分裂指數(shù)曲線與生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)一致，但細(xì)胞增長(zhǎng)進(jìn)入停滯期后，細(xì)胞數(shù)值增大，而分裂

56、相完全消失。3、細(xì)胞接種存活率細(xì)胞接種存活率=（貼壁存活細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）x100%4、細(xì)胞周期（1）放射性核素標(biāo)記自顯影法在細(xì)胞進(jìn)入增殖期后，可以用川標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷處理30min后，每隔30min取材，直到48h為止。觀察和計(jì)算細(xì)胞分裂相出現(xiàn)的時(shí)間、高峰和消失分裂相數(shù)，繪制成圖進(jìn)行分析。（2）流式細(xì)胞儀測(cè)定法選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用消化法制成細(xì)胞懸液，使細(xì)胞成為單個(gè)細(xì)胞，不能成團(tuán)。然后根據(jù)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)步驟進(jìn)行操作。最后通過計(jì)算機(jī)分析結(jié)果計(jì)算出細(xì)胞周期。 5、細(xì)胞活力的檢測(cè)、細(xì)胞活力的檢測(cè) 細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，某些燃料可穿透變性的細(xì)胞細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，某些燃料可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的

57、膜，與解體的DNA結(jié)合而著色。而活細(xì)胞能阻止結(jié)合而著色。而活細(xì)胞能阻止這類染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。借此可以鑒別死細(xì)胞與活這類染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。借此可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。細(xì)胞。 1）臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)）臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn) 死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞據(jù)染，從而達(dá)到區(qū)別培養(yǎng)細(xì)胞活力的目的。細(xì)胞據(jù)染，從而達(dá)到區(qū)別培養(yǎng)細(xì)胞活力的目的。 2）伊紅）伊紅Y排斥實(shí)驗(yàn)排斥實(shí)驗(yàn) 本法與臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)類似，本法與臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)類似，但用伊紅但用伊紅Y染色后，活細(xì)胞與死細(xì)胞的對(duì)比度不染色后，活細(xì)胞與死細(xì)胞的對(duì)比度不如臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)。如臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)。 3）苯胺黑排斥實(shí)驗(yàn)）苯胺黑排斥實(shí)驗(yàn) 死細(xì)胞被染成黑色，活

58、細(xì)胞死細(xì)胞被染成黑色，活細(xì)胞不被染色。不被染色。（三）培養(yǎng)細(xì)胞種屬鑒定的方法（三）培養(yǎng)細(xì)胞種屬鑒定的方法1、熒光抗體染色鑒別細(xì)胞的種屬、熒光抗體染色鑒別細(xì)胞的種屬利用間接熒光抗體染色技術(shù)對(duì)細(xì)胞系的種系進(jìn)行鑒定。步驟是用兔身上產(chǎn)生的特異性利用間接熒光抗體染色技術(shù)對(duì)細(xì)胞系的種系進(jìn)行鑒定。步驟是用兔身上產(chǎn)生的特異性抗血清標(biāo)記待檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞，然后加標(biāo)記有熒光染料異硫氰酸熒抗血清標(biāo)記待檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞，然后加標(biāo)記有熒光染料異硫氰酸熒光素的山羊抗兔免疫球蛋白抗體，加上的熒光抗體將結(jié)合到已標(biāo)記有兔抗體的靶細(xì)胞光素的山羊抗兔免疫球蛋白抗體，加上的熒光抗體將結(jié)合到已標(biāo)記有兔抗體的

59、靶細(xì)胞上，借助熒光即可看到抗原上，借助熒光即可看到抗原-抗體復(fù)合物?？贵w復(fù)合物。2同工酶譜系鑒別細(xì)胞種屬同工酶譜系鑒別細(xì)胞種屬通過確定通過確定6-磷酸葡萄糖脫氫酸，乳酸脫氫酶和核苷酸酸化酶的淀粉膠電泳的遷移率，磷酸葡萄糖脫氫酸，乳酸脫氫酶和核苷酸酸化酶的淀粉膠電泳的遷移率，鑒定細(xì)胞系的種屬。該法有高度的可靠性，鑒定細(xì)胞系的種屬。該法有高度的可靠性，G6PD、LDH、NP的電泳遷移率差異不僅的電泳遷移率差異不僅可用來鑒別細(xì)胞系種屬，還可查出種內(nèi)細(xì)胞的交叉污染。根據(jù)同種異體同工酶的表型可用來鑒別細(xì)胞系種屬，還可查出種內(nèi)細(xì)胞的交叉污染。根據(jù)同種異體同工酶的表型和正常人群體的表型頻率資料，可以估計(jì)出一

60、特定細(xì)胞系遺傳特征出現(xiàn)的頻率。和正常人群體的表型頻率資料，可以估計(jì)出一特定細(xì)胞系遺傳特征出現(xiàn)的頻率。3、染色體分析、染色體分析用顯微鏡觀察細(xì)胞核型特點(diǎn)，進(jìn)行染色體核型分析。包括檢測(cè)染色體數(shù)量，標(biāo)記染色用顯微鏡觀察細(xì)胞核型特點(diǎn)，進(jìn)行染色體核型分析。包括檢測(cè)染色體數(shù)量，標(biāo)記染色體的有無，帶型等。親緣關(guān)系近的靈長(zhǎng)類細(xì)胞系之間和人癌細(xì)胞之間的比較可用體的有無，帶型等。親緣關(guān)系近的靈長(zhǎng)類細(xì)胞系之間和人癌細(xì)胞之間的比較可用Giemsa現(xiàn)代分析現(xiàn)代分析4、人主要組織相容性抗原、人主要組織相容性抗原人主要組織相容性抗原又稱人類白細(xì)胞抗原，存在于大多數(shù)有核細(xì)胞膜上，常用的抗人主要組織相容性抗原又稱人類白細(xì)胞抗原