第15章核酸的研究方法ppt課件

1、第第1515章章核酸的研究方法核酸的研究方法 制備天然核酸必需采用溫和的條件，制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分離、提純和定量測定一、核酸的分離、提純和定量測定真核真核DNADNA以核蛋白以核蛋白DNPDNP形式存在，形式存在，DNPDNP溶于水或高鹽溶液溶于水或高鹽溶液1mol/L 1mol/L N a C lN a C l ） ， 但 不 溶 于 低 鹽 溶 液） ， 但 不 溶 于 低 鹽 溶 液0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl去除蛋白質(zhì)：

2、水飽和酚，氯仿異戊去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異戊醇。醇。DNADNA沉淀：沉淀：0.3M NaAC-70%0.3M NaAC-70%乙醇乙醇（一（一DNA分離純化分離純化制備制備RNARNA時(shí)，最重要的是使時(shí)，最重要的是使RNaseRNase滅活：滅活：所有容器都要經(jīng)過高溫處理，不能高溫高所有容器都要經(jīng)過高溫處理，不能高溫高壓的用壓的用0.10.1焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯DEPCDEPC處置。處置。加入強(qiáng)變性劑如胍鹽使加入強(qiáng)變性劑如胍鹽使RNaseRNase失活；失活；在在RNARNA的反應(yīng)體系內(nèi)加入的反應(yīng)體系內(nèi)加入RNaseRNase的抑制劑的抑制劑如如RNasin)RNasin)（二（二R

3、NA的分離的分離（三核酸含量的測定（三核酸含量的測定2、定糖法、定糖法 RNA：核糖：核糖 糠醛糠醛 綠色物質(zhì)綠色物質(zhì)670-680nm） DNA：脫氧核糖：脫氧核糖+二苯胺二苯胺蘭色物質(zhì)蘭色物質(zhì)595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法、紫外吸收法1個(gè)個(gè)A50g/ml 雙鏈雙鏈DNA 40g/ml RNA或單鏈或單鏈DNA3、定磷法、定磷法 核酸含磷量為核酸含磷量為9.5% 1g磷相當(dāng)于磷相當(dāng)于10.5g核酸核酸4、瓊脂糖凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳 溴乙錠能插入溴乙錠能插入DNA分子的堿基對間形成復(fù)合物分子的堿基對間形成復(fù)合物在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光在紫外線照射下溴

4、乙錠發(fā)橘紅色熒光 熒光強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比含量成正比純純DNA DNA 比值比值1.81.8， 1.8 Pr1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染純純RNA RNA 比值比值2.02.0， 2.0 DNA 2.0 DNA、 PrPr、苯酚污染、苯酚污染（四）、核酸純度的測定OD260OD280二、核酸的沉降特性與超速離心二、核酸的沉降特性與超速離心 不同構(gòu)象的核酸線形、不同構(gòu)象的核酸線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構(gòu)象心可以將不同構(gòu)象DNADNA、RNARNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開來與蛋白質(zhì)區(qū)分開來8M CsCl，

5、45000rpm，16h密度梯度：密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡時(shí)：浮力密度平衡時(shí)：浮力密度=CsCl密度密度=離心力離心力=0 +4.22r2 - r02） 10-10 ：浮力密度：浮力密度 ：角速度弧度：角速度弧度/秒）秒）r：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離（一核酸密度的測定G-C含量與含量與DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系的浮力密度之間呈正比關(guān)系=0.1 xG-C + 1.658xG-C =（-1.658） 10 （二測定（二測定DNADNA的的G-CG-C含量含量RNADNA變性變性DNA雙鏈雙鏈DNA 蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大變性程度越大，浮力密度

6、越大（三研究核酸的構(gòu)象（三研究核酸的構(gòu)象（四用于核酸的制備（四用于核酸的制備超螺旋超螺旋DNADNA或或用于大片段用于大片段DNA的分離，精度低，但的分離，精度低，但分離范圍廣。分離范圍廣。三、核酸的凝膠電泳三、核酸的凝膠電泳（一瓊脂糖凝膠電泳（一瓊脂糖凝膠電泳用于小片段用于小片段DNA的分析的分析相對分子質(zhì)量小于相對分子質(zhì)量小于1000bp的的DNA片片斷和斷和RNA的電泳。的電泳。PAGE中一般不含中一般不含RNase，用于，用于RNA分析時(shí)不會分解樣品。分析時(shí)不會分解樣品。（二聚丙烯酰胺凝膠電泳（二聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGEPAGE）（一（一DNADNA的酶法測定的酶法測定四、核酸的核苷

7、酸序列測定四、核酸的核苷酸序列測定英國英國 SangerSanger1955 1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，1958 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1975 1975 設(shè)計(jì)出設(shè)計(jì)出DNADNA測序法，測序法，1980 1980 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)合成一段與待測合成一段與待測DNADNA序列互補(bǔ)的序列互補(bǔ)的DNADNA片段群。片段群。 末端終止法末端終止法Sanger2，3雙脫氧核苷三磷酸雙脫氧核苷三磷酸ddNTP是是DNA合成鏈延伸的抑制劑。合成鏈延伸的抑制劑。MOV : MCB4.0Dideoxy sequencing of DNADNA序列分析儀：序列分析

8、儀：四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTP（二（二DNADNA的化學(xué)法測序：的化學(xué)法測序： 由由MaxamMaxam和和GilbertGilbert所發(fā)明。所發(fā)明。 其基本原理是用特異的化學(xué)試劑作用于其基本原理是用特異的化學(xué)試劑作用于DNADNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應(yīng)堿基分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈。用的多核苷酸鏈。用4 4組不同的特異反應(yīng)，可使末組不同的特異反應(yīng)，可使末端標(biāo)記的端標(biāo)記的DNADNA分子切成不同長度的片斷，其末端分子切成不同長度的片斷，其末端都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜

9、影得到測序圖譜 4 4組特異的反應(yīng)如下：組特異的反應(yīng)如下：（1 1G G反應(yīng)：用硫酸二甲酯反應(yīng)：用硫酸二甲酯DMSDMS使鳥嘌呤上的使鳥嘌呤上的N7N7原子甲原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在此處斷基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在此處斷裂裂（2 2G+AG+A反應(yīng)：用甲酸使反應(yīng)：用甲酸使A A和和G G嘌呤環(huán)上的嘌呤環(huán)上的N N原子質(zhì)子化，原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂（3 3T+CT+C反應(yīng)：用肼使反應(yīng)：用肼使T T和和C C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基除去堿基（4 4C C反應(yīng)：當(dāng)

10、有鹽存在時(shí)，只有反應(yīng)：當(dāng)有鹽存在時(shí)，只有C C與肼反應(yīng)，并被哌與肼反應(yīng)，并被哌啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂二酯鍵斷裂 32P-GCTACGTA：在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT在G處： 32p ，32p-GCTAC在C處：32P-G和 32P-GCTA在T處：32P-GC和32P-GCTACG硫酸二甲酯G）： *ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸G+A）： *A*ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/NaclC）： *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACT

11、TCGACAG 肼C+T）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG從下往上讀：CTACGTA，末端G不能讀出。32P *ACTTCGACAG（三（三RNARNA的測序的測序 RNARNA的測序方法有的測序方法有3 3個(gè)：個(gè)：（1 1用酶特異切斷用酶特異切斷RNARNA鏈：鏈：（2 2用化學(xué)試劑裂解用化學(xué)試劑裂解RNARNA（3 3逆轉(zhuǎn)錄成逆轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA20192019年年K.MullisK.Mullis發(fā)明?；静襟E為：發(fā)明?；静襟E為：1.1.設(shè)計(jì)一對引物以便有效擴(kuò)增所需要的設(shè)計(jì)一對引物以便有效擴(kuò)增所需要的DNADNA序列，并盡量減少

12、可能產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物序列，并盡量減少可能產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物2.2.優(yōu)化反應(yīng)體系：包括適量模板、引物、優(yōu)化反應(yīng)體系：包括適量模板、引物、4 4種種dNTPdNTP、Taq DNATaq DNA聚合酶和適量聚合酶和適量Mg2+Mg2+五、五、DNADNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCRPCR）3.3.選擇選擇3 3個(gè)溫度進(jìn)行熱循環(huán)：個(gè)溫度進(jìn)行熱循環(huán)：變性變性9494，454560s60s；退火，根據(jù)引物的退火，根據(jù)引物的Tm Tm ，1min1min；延伸，延伸，7272，1min1min。循環(huán)循環(huán)4.4.擴(kuò)增完成后取出一定量的反應(yīng)產(chǎn)物，檢擴(kuò)增完成后取出一定量的反應(yīng)產(chǎn)物，檢測擴(kuò)增結(jié)果：先進(jìn)行凝膠電泳，用溴化乙測擴(kuò)增結(jié)果：先進(jìn)行凝膠電泳，用溴化乙啶染色，紫外光下檢測結(jié)果啶染色，紫外光下檢測結(jié)果y=產(chǎn)物；產(chǎn)物；x=擴(kuò)增效率；擴(kuò)增效率；n循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)(1)nyx 模板模板DNA單鏈）單鏈）引物引物DNA聚合酶聚合酶Taq）dNTPMg2+MOV:MCB4.0POLY