哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)課件

1、哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)韓韓 雪雪 蕾蕾哺乳動(dòng)物胚胎哺乳動(dòng)物胚胎(piti)(piti)干細(xì)胞技術(shù)干細(xì)胞技術(shù)第一頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)主要主要(zhyo)(zhyo)內(nèi)容內(nèi)容一、胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)一、胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)二、胚胎干細(xì)胞研究的意義二、胚胎干細(xì)胞研究的意義三、胚胎干細(xì)胞研究的歷史與進(jìn)展三、胚胎干細(xì)胞研究的歷史與進(jìn)展四四 .胚胎干細(xì)胞的分離胚胎干細(xì)胞的分離(fnl)培養(yǎng)基本程序培養(yǎng)基本程序五五.ES細(xì)胞的保存細(xì)胞的保存六六.ES細(xì)胞的鑒定細(xì)胞的鑒定七七.ES細(xì)胞技術(shù)目前存在的問題細(xì)胞技術(shù)目前存在的問題八八.ES細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展方向細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展方向第二頁，共七十頁。哺

2、乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)干細(xì)胞功功 能能 組織組織(zzh)(zzh)發(fā)生發(fā)生 全能全能(qunnng)(qunnng)干干細(xì)胞細(xì)胞 多能多能(du nn)(du nn)干細(xì)胞干細(xì)胞 專能干細(xì)胞專能干細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞 組織干細(xì)胞組織干細(xì)胞 干細(xì)胞分類干細(xì)胞分類 第三頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)全能(qunnng)干細(xì)胞Totipotent stem cells 具有無限分化潛能的細(xì)胞。可以具有無限分化潛能的細(xì)胞。可以(ky)(ky)分化成人體的各種分化成人體的各種細(xì)胞，這些細(xì)胞構(gòu)成人體的各種組織器官，如細(xì)胞，這些細(xì)胞構(gòu)成人體的各種組織器官，如胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞。 第四頁，共七十

3、頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)多能(du nn)干細(xì)胞Multipotent stem cells 具有可分化具有可分化(fnhu)(fnhu)出一種器官的多種組織潛能的干細(xì)胞出一種器官的多種組織潛能的干細(xì)胞，即能夠形成兩種或兩種以上類型細(xì)胞的干細(xì)胞。具有自，即能夠形成兩種或兩種以上類型細(xì)胞的干細(xì)胞。具有自我增殖和分化我增殖和分化(fnhu)(fnhu)兩種功能。兩種功能。 骨髓造血骨髓造血(zo xu)(zo xu)干細(xì)胞干細(xì)胞就是典型的多能干細(xì)胞，移植造血就是典型的多能干細(xì)胞，移植造血干細(xì)胞治療白血病、再生障礙性貧血等血液疾病。干細(xì)胞治療白血病、再生障礙性貧血等血液疾病。第五頁，共七十頁。哺乳

4、動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)專能干細(xì)胞 多能多能(du nn)(du nn)干細(xì)胞進(jìn)一步分化成專能干細(xì)胞，只能分化成干細(xì)胞進(jìn)一步分化成專能干細(xì)胞，只能分化成某一類型的細(xì)胞。又稱單能干細(xì)胞。某一類型的細(xì)胞。又稱單能干細(xì)胞。 如如表皮干細(xì)胞表皮干細(xì)胞只能分化產(chǎn)生角化表皮細(xì)胞。只能分化產(chǎn)生角化表皮細(xì)胞。 第六頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)胚胎(piti)性干細(xì)胞 來自早期胚胎、原始生殖細(xì)胞或畸胎瘤組織等源于胚來自早期胚胎、原始生殖細(xì)胞或畸胎瘤組織等源于胚胎的干細(xì)胞，其基本特性是具有穩(wěn)定地在體外自我更新胎的干細(xì)胞，其基本特性是具有穩(wěn)定地在體外自我更新(gngxn)(gngxn)、并穩(wěn)定地維持正常核型和發(fā)育

5、全能或多能性、能分、并穩(wěn)定地維持正常核型和發(fā)育全能或多能性、能分化為屬于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層范疇的各種類型分化細(xì)化為屬于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層范疇的各種類型分化細(xì)胞，甚至參與個(gè)體發(fā)育，又稱為萬能細(xì)胞胞，甚至參與個(gè)體發(fā)育，又稱為萬能細(xì)胞( (Multipotent stem cells ) )。 第七頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)組織(zzh)干細(xì)胞 指分布在成年指分布在成年(chngnin)(chngnin)生物體組織中負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組生物體組織中負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組織細(xì)胞功能的干細(xì)胞。又稱為成體干細(xì)胞織細(xì)胞功能的干細(xì)胞。又稱為成體干細(xì)胞(Adult stem cells)。 第八

6、頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)一、胚胎一、胚胎(piti)(piti)干細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)干細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)1.定義定義哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞（哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞（Embryo Derived Stem Cells）又稱又稱ES或或EK細(xì)胞細(xì)胞，是從早期胚胎或胎兒，是從早期胚胎或胎兒(ti r)中分中分離出來的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞系。一方面具有離出來的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞系。一方面具有自我更新能力，另一方面具有分化潛能。自我更新能力，另一方面具有分化潛能。第九頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)第十頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)2.來源來源(liyun)： 囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

7、（ICM） 早期胚胎的種細(xì)胞或胎兒的原始生早期胚胎的種細(xì)胞或胎兒的原始生殖細(xì)胞。殖細(xì)胞。ICM在胚胎著床前：分化出原始內(nèi)胚層，緊貼著在胚胎著床前：分化出原始內(nèi)胚層，緊貼著囊胚腔的內(nèi)層生長，最后發(fā)育為卵黃膜；囊胚腔的內(nèi)層生長，最后發(fā)育為卵黃膜；ICM在胚胎著床后：分化為原始外胚層，進(jìn)一在胚胎著床后：分化為原始外胚層，進(jìn)一步分化為胚胎的步分化為胚胎的3個(gè)種細(xì)胞層，進(jìn)一步發(fā)育為胎兒。個(gè)種細(xì)胞層，進(jìn)一步發(fā)育為胎兒。 內(nèi)消呼肝胰內(nèi)消呼肝胰（內(nèi)胚層發(fā)育為消化系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，（內(nèi)胚層發(fā)育為消化系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，肝臟，胰臟）肝臟，胰臟） 外表感神仙外表感神仙（外胚層發(fā)育為表皮，感覺，神經(jīng)系）（外胚層發(fā)育為表皮，

8、感覺，神經(jīng)系） 其余的是中胚層其余的是中胚層第十一頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)第十二頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)3.細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)具有胚胎細(xì)胞的特性：形態(tài)上細(xì)胞體積較小，但是細(xì)胞具有胚胎細(xì)胞的特性：形態(tài)上細(xì)胞體積較小，但是細(xì)胞核較大，核質(zhì)比高，核仁較大，培育時(shí)呈克隆狀生長，核較大，核質(zhì)比高，核仁較大，培育時(shí)呈克隆狀生長，在功能上具有發(fā)育全能型，能進(jìn)行在功能上具有發(fā)育全能型，能進(jìn)行 人為定向分化。人為定向分化。普通細(xì)胞系的特性：在體外培養(yǎng)普通細(xì)胞系的特性：在體外培養(yǎng)(piyng)傳代而不發(fā)生分化，傳代而不發(fā)生分化，能進(jìn)行冷凍保存和遺傳改造。能進(jìn)行冷凍保存和遺傳改造。發(fā)育全能

9、性：發(fā)育全能性：第十三頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)1）形成畸胎瘤：將）形成畸胎瘤：將ES細(xì)胞接種同源動(dòng)物皮下可形成內(nèi)、細(xì)胞接種同源動(dòng)物皮下可形成內(nèi)、中、外三種胚層細(xì)胞。中、外三種胚層細(xì)胞。2）形成類胚體：將）形成類胚體：將ES細(xì)胞在非黏附底物中懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在非黏附底物中懸浮培養(yǎng)生長，或控制增殖生長，或控制增殖(zngzh)細(xì)胞數(shù)目，形成多種系混雜的細(xì)胞數(shù)目，形成多種系混雜的集合體集合體ES 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)全能性體現(xiàn)在：全能性體現(xiàn)在：第十四頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)3）直系分化：通過控制）直系分化：通過控制ES細(xì)胞生長環(huán)境或遺傳操縱細(xì)胞生長環(huán)境或遺傳操縱特定基因表達(dá)，特定基

10、因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化為某特定種系細(xì)胞細(xì)胞可直接分化為某特定種系細(xì)胞。新的。新的ES細(xì)胞建系后在體外生長時(shí)間越短，產(chǎn)生所有細(xì)胞建系后在體外生長時(shí)間越短，產(chǎn)生所有類型組織的可能性就越大。類型組織的可能性就越大。4）形成嵌合體：組織和器官的細(xì)胞含有兩個(gè)或兩）形成嵌合體：組織和器官的細(xì)胞含有兩個(gè)或兩個(gè)以上基因型構(gòu)建而成的完整個(gè)體，稱為個(gè)以上基因型構(gòu)建而成的完整個(gè)體，稱為(chn wi)基基因嵌合體或嵌合體動(dòng)物。將因嵌合體或嵌合體動(dòng)物。將ES細(xì)胞注射到同種動(dòng)物細(xì)胞注射到同種動(dòng)物囊胚腔中，可形成嵌合體。囊胚腔中，可形成嵌合體。ES細(xì)胞或細(xì)胞或EG細(xì)胞一旦分細(xì)胞一旦分化即喪失全能性，難以參與胚胎發(fā)育，

11、形成嵌合體?；磫适苄?，難以參與胚胎發(fā)育，形成嵌合體。第十五頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)4.功能功能在滋養(yǎng)層細(xì)胞上或在含有分化移植因子的介在滋養(yǎng)層細(xì)胞上或在含有分化移植因子的介質(zhì)中，能維持未分化狀態(tài)，并實(shí)現(xiàn)自我更新，質(zhì)中，能維持未分化狀態(tài)，并實(shí)現(xiàn)自我更新，因此可以無限因此可以無限(wxin)增殖；增殖；在體外，在誘導(dǎo)因子的作用下，可以定向分在體外，在誘導(dǎo)因子的作用下，可以定向分化；泌乳小鼠胚胎干細(xì)胞已經(jīng)在體外誘導(dǎo)分化；泌乳小鼠胚胎干細(xì)胞已經(jīng)在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼化為神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞黑色素細(xì)胞等。肌細(xì)胞黑色素細(xì)胞等。第十六頁，共七十

12、頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)ES細(xì)胞具有種系傳遞（細(xì)胞具有種系傳遞（germline transmission）能力，）能力，能夠形成嵌合體動(dòng)物（能夠形成嵌合體動(dòng)物（chimeric animal）。）。 若在體外若在體外把把ES細(xì)胞注射至另一胚泡內(nèi)，使之與受體胚胎細(xì)胞細(xì)胞注射至另一胚泡內(nèi)，使之與受體胚胎細(xì)胞混合，再移植入假孕受體子宮混合，再移植入假孕受體子宮(zgng)，可發(fā)育獲得嵌，可發(fā)育獲得嵌合體（合體（chimeric）。）。ES細(xì)胞可參與嵌合體各個(gè)器官包括生殖腺的發(fā)育。細(xì)胞可參與嵌合體各個(gè)器官包括生殖腺的發(fā)育。通過交配可以分離出帶有通過交配可以分離出帶有ES細(xì)胞遺傳性狀的個(gè)體，細(xì)胞遺傳

13、性狀的個(gè)體，這是這是ES細(xì)胞具有種系傳遞能力的一種證明。細(xì)胞具有種系傳遞能力的一種證明。第十七頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)5、ES細(xì)胞自我更新的分子細(xì)胞自我更新的分子機(jī)理機(jī)理1、LIF（白血病抑制（白血病抑制(yzh)因因子）子）:ES細(xì)胞表面的有一復(fù)細(xì)胞表面的有一復(fù)合受體，由低親和性的合受體，由低親和性的LIF受體和普通亞基受體和普通亞基gp130構(gòu)構(gòu)成異源二聚體，成異源二聚體，LIF與受與受體結(jié)合后激活體結(jié)合后激活Jak酶，通酶，通過對(duì)過對(duì)STAT3的磷酸化激活的磷酸化激活維持細(xì)胞自我更新的基因。維持細(xì)胞自我更新的基因。第十八頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)（2）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）

14、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子oct-4： oct-4是是ES細(xì)胞維細(xì)胞維持多能性和進(jìn)入分化的開關(guān)，是持多能性和進(jìn)入分化的開關(guān)，是DNA特異特異結(jié)合蛋白，通過激活或者移植靶基因的轉(zhuǎn)錄活結(jié)合蛋白，通過激活或者移植靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，維持性，維持ES細(xì)胞的自我更新。在細(xì)胞的自我更新。在ES細(xì)胞中始細(xì)胞中始終保持一定的水平，表達(dá)終保持一定的水平，表達(dá)(biod)量在量在50150%，才能實(shí)現(xiàn)自我更新和維持多能性。才能實(shí)現(xiàn)自我更新和維持多能性。Ni Wa等（等（2000）研究表明：）研究表明：STAT3和和oct-4可能作用于相同的靶基因而相互協(xié)調(diào)維持可能作用于相同的靶基因而相互協(xié)調(diào)維持ES細(xì)胞的功能。細(xì)胞的功能。第十九

15、頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)（3）通過移植酪氨酸磷酸酶）通過移植酪氨酸磷酸酶SHP-2和細(xì)胞外和細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶調(diào)節(jié)激酶ERK，維持，維持ES的正常功能：的正常功能：SHP-2能除去能除去(ch q)酪氨酸上磷酸基團(tuán)，作酪氨酸上磷酸基團(tuán)，作用于用于gp130受體的胞內(nèi)區(qū)，使受體的胞內(nèi)區(qū)，使gp130和其他的和其他的膜受體收到刺激后膜受體收到刺激后ERK被激活。被激活。 SHP-2和和ERK對(duì)對(duì)STAT3功能有負(fù)調(diào)控作用，抑制其功能有負(fù)調(diào)控作用，抑制其信號(hào)傳導(dǎo)。信號(hào)傳導(dǎo)。第二十頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)二、胚胎二、胚胎(piti)(piti)干細(xì)胞研究的意義干細(xì)胞研究的意義1.E

16、S細(xì)胞是研究哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生發(fā)育細(xì)胞是研究哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生發(fā)育(fy)規(guī)律極有價(jià)值的工具規(guī)律極有價(jià)值的工具第二十一頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)2.是研究細(xì)胞分化的理想手段是研究細(xì)胞分化的理想手段ES細(xì)胞僅在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或添加白血病抑細(xì)胞僅在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或添加白血病抑制因子或白細(xì)胞介素制因子或白細(xì)胞介素-6家族的培養(yǎng)液中維持家族的培養(yǎng)液中維持不分化狀態(tài)，當(dāng)培養(yǎng)液中添加分化誘導(dǎo)不分化狀態(tài)，當(dāng)培養(yǎng)液中添加分化誘導(dǎo)(yudo)劑時(shí)可以出現(xiàn)定向分化，如視黃酸誘導(dǎo)劑時(shí)可以出現(xiàn)定向分化，如視黃酸誘導(dǎo)(yudo)分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，DMSO誘導(dǎo)誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞等

17、。分化為平滑肌細(xì)胞等。通過研究通過研究ES細(xì)胞的分化特點(diǎn)，可揭示細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞的分化特點(diǎn)，可揭示細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的路徑，發(fā)現(xiàn)新的信號(hào)受體，揭示信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的路徑，發(fā)現(xiàn)新的信號(hào)受體，揭示細(xì)胞分化和調(diào)亡的機(jī)理。細(xì)胞分化和調(diào)亡的機(jī)理。第二十二頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)第二十三頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)3.研究基因功能的首選細(xì)胞研究基因功能的首選細(xì)胞由于由于ES細(xì)胞具有穩(wěn)定細(xì)胞具有穩(wěn)定(wndng)的核型，并易于的核型，并易于誘捕外源基因，因此進(jìn)行基因敲除或定向插誘捕外源基因，因此進(jìn)行基因敲除或定向插入外源基因的理想細(xì)胞。入外源基因的理想細(xì)胞。用遺傳修飾的用遺傳修飾的ES細(xì)胞生產(chǎn)嵌合體或用細(xì)

18、胞細(xì)胞生產(chǎn)嵌合體或用細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的克隆后代，通過觀察后核移植技術(shù)獲得的克隆后代，通過觀察后代的表型變化，可探明未知基因的生物學(xué)代的表型變化，可探明未知基因的生物學(xué)功能和表達(dá)調(diào)控規(guī)律。功能和表達(dá)調(diào)控規(guī)律。第二十四頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)4.是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要方法之一是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要方法之一用外源基因轉(zhuǎn)染后，篩選陽性細(xì)胞，然后注用外源基因轉(zhuǎn)染后，篩選陽性細(xì)胞，然后注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合獲得嵌合體后入到囊胚腔或其他卵裂球聚合獲得嵌合體后代，用轉(zhuǎn)染的代，用轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞分化細(xì)胞分化(fnhu)為生殖干細(xì)胞，為生殖干細(xì)胞，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因陽性動(dòng)物。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因陽性動(dòng)物。也可把轉(zhuǎn)

19、化后的也可把轉(zhuǎn)化后的ES細(xì)胞作為供體核，用細(xì)細(xì)胞作為供體核，用細(xì)胞核移植技術(shù)直接獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。胞核移植技術(shù)直接獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。第二十五頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)第二十六頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)5.ES細(xì)胞治療技術(shù)將引起一場細(xì)胞治療技術(shù)將引起一場(y chn)醫(yī)學(xué)革命醫(yī)學(xué)革命第二十七頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)人類面臨的大多數(shù)醫(yī)學(xué)難題人類面臨的大多數(shù)醫(yī)學(xué)難題,如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松、癌癥如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松、癌癥(i (i zhn)zhn)、老年性癡呆、帕金森病、嚴(yán)重?zé)齻⒓顾钃p傷和遺傳性缺陷等疾病、老年性癡呆、帕

20、金森病、嚴(yán)重?zé)齻?、脊髓損傷和遺傳性缺陷等疾病組織組織(zzh)(zzh)工程學(xué)、功能基因組學(xué)和工程學(xué)、功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)、發(fā)育生物學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)、發(fā)育生物學(xué)新藥開發(fā)與藥效、毒性新藥開發(fā)與藥效、毒性(d xn)(d xn)評(píng)估等評(píng)估等第二十八頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)6.可用于研究細(xì)胞癌變機(jī)理和新藥物的篩選可用于研究細(xì)胞癌變機(jī)理和新藥物的篩選細(xì)胞癌變主要是由于細(xì)胞癌變主要是由于(yuy)正常的細(xì)胞周期發(fā)生正常的細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，細(xì)胞無序增殖所致。紊亂，細(xì)胞無序增殖所致。ES細(xì)胞在正常的細(xì)胞在正常的培養(yǎng)環(huán)境中能維持穩(wěn)定的核型，是研究致培養(yǎng)環(huán)境中能維持穩(wěn)定的核型，是研究致癌物質(zhì)誘發(fā)細(xì)胞

21、癌變機(jī)理的理想材料；癌物質(zhì)誘發(fā)細(xì)胞癌變機(jī)理的理想材料；在研究新藥過程中，需要對(duì)藥物的作用機(jī)理在研究新藥過程中，需要對(duì)藥物的作用機(jī)理和藥效進(jìn)行研究，和藥效進(jìn)行研究，ES細(xì)胞在體外能分化多細(xì)胞在體外能分化多種體細(xì)胞，可以直接作為實(shí)驗(yàn)材料來篩選種體細(xì)胞，可以直接作為實(shí)驗(yàn)材料來篩選新藥，可縮短新藥開發(fā)周期，且治療的針新藥，可縮短新藥開發(fā)周期，且治療的針對(duì)性強(qiáng)。對(duì)性強(qiáng)。第二十九頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)三、胚胎干細(xì)胞研究三、胚胎干細(xì)胞研究(ynji)(ynji)的歷史與進(jìn)的歷史與進(jìn)展展干細(xì)胞研究成為繼人類基因組大規(guī)模測序之后最具活干細(xì)胞研究成為繼人類基因組大規(guī)模測序之后最具活力、最有影響和最有

22、應(yīng)用前景力、最有影響和最有應(yīng)用前景(qinjng)的生命科學(xué)科研究的生命科學(xué)科研究領(lǐng)域；領(lǐng)域；1999年干細(xì)胞研究被美國年干細(xì)胞研究被美國SCIENCE雜志評(píng)為雜志評(píng)為1999年度世界十大科學(xué)之冠；年度世界十大科學(xué)之冠；2000年干細(xì)胞研究再次被年干細(xì)胞研究再次被SCIENCE雜志評(píng)為該雜志評(píng)為該年度世界十大科學(xué)成就之一。年度世界十大科學(xué)成就之一。第三十頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù) 1981年英國劍橋大學(xué)的年英國劍橋大學(xué)的Evans和和Kaufman用延緩著床用延緩著床的胚泡的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚泡的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM （inner cells mass)獲得獲得鼠的鼠的ES細(xì)胞；細(xì)胞；同

23、年同年(tngnin)美國的美國的Maryin用條件培養(yǎng)基獲得鼠的用條件培養(yǎng)基獲得鼠的ES細(xì)細(xì)胞。胞。Roberston用不同品系的鼠胚和具有不同遺傳疾病用不同品系的鼠胚和具有不同遺傳疾病的胚胎建立了細(xì)胞系并進(jìn)行了多能性和嵌合特性的分的胚胎建立了細(xì)胞系并進(jìn)行了多能性和嵌合特性的分析。析。第三十一頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù) 1998年年11月，美國威斯康星大學(xué)的科學(xué)家月，美國威斯康星大學(xué)的科學(xué)家James Thomson等從人囊胚的內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)中取得胚胎干細(xì)胞。等從人囊胚的內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)中取得胚胎干細(xì)胞。他們把胚胎干細(xì)胞與小鼠的骨髓間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了他們把胚胎干細(xì)胞與小鼠的骨髓間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了共培

24、養(yǎng)。結(jié)果表明胚胎干細(xì)胞可以進(jìn)行長達(dá)共培養(yǎng)。結(jié)果表明胚胎干細(xì)胞可以進(jìn)行長達(dá)5個(gè)月個(gè)月的非分化增殖，同時(shí)還保持著分化為滋養(yǎng)層組織及三種的非分化增殖，同時(shí)還保持著分化為滋養(yǎng)層組織及三種胚層組織的能力。這為胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用胚層組織的能力。這為胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用(yngyng)奠奠定了基礎(chǔ)。定了基礎(chǔ)。第三十二頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù) 1999年年12月，美國科學(xué)家在月，美國科學(xué)家在美國科學(xué)院院刊美國科學(xué)院院刊報(bào)告報(bào)告說，小鼠肌肉組織說，小鼠肌肉組織(j ru z zh)的成體干細(xì)胞可以的成體干細(xì)胞可以“橫向橫向分化分化”為血液細(xì)胞。隨后，世界各國的科學(xué)家相繼為血液細(xì)胞。隨后，世界各國的

25、科學(xué)家相繼證實(shí)，成體干細(xì)胞包括人類的成體干細(xì)胞具有可塑證實(shí)，成體干細(xì)胞包括人類的成體干細(xì)胞具有可塑性。性。2000年年5月，日本啟動(dòng)月，日本啟動(dòng)“千年世紀(jì)工程千年世紀(jì)工程”，以干細(xì)胞工程，以干細(xì)胞工程為核心技術(shù)的再生醫(yī)療成為這項(xiàng)工程的四大重點(diǎn)之一，為核心技術(shù)的再生醫(yī)療成為這項(xiàng)工程的四大重點(diǎn)之一，第一年度投資金額達(dá)第一年度投資金額達(dá)108億日元。億日元。 第三十三頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù) 2001年年1月，英國議會(huì)上院通過法案，允許科學(xué)家克隆月，英國議會(huì)上院通過法案，允許科學(xué)家克隆人類早期胚胎，并利用它進(jìn)行醫(yī)療研究。人類早期胚胎，并利用它進(jìn)行醫(yī)療研究。 2001年年4月，美國科學(xué)家發(fā)

26、現(xiàn)，從病人臀部和大腿處抽月，美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，從病人臀部和大腿處抽取的脂肪中，含有大量類似干細(xì)胞的細(xì)胞，這些細(xì)胞可取的脂肪中，含有大量類似干細(xì)胞的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以發(fā)育成健康的軟骨以發(fā)育成健康的軟骨(rung)和肌肉等。和肌肉等。 第三十四頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù) l2003年，美國衛(wèi)生獨(dú)立研究院（年，美國衛(wèi)生獨(dú)立研究院（National Institutes of Health，NIH）華裔科學(xué)家施松濤等人首次發(fā)現(xiàn)）華裔科學(xué)家施松濤等人首次發(fā)現(xiàn)牙齒間質(zhì)存在干細(xì)胞。牙齒間質(zhì)存在干細(xì)胞。l2005年報(bào)出干細(xì)胞研究領(lǐng)域乃至全球?qū)W術(shù)年報(bào)出干細(xì)胞研究領(lǐng)域乃至全球?qū)W術(shù)(xush)界一大界一大學(xué)

27、術(shù)學(xué)術(shù)(xush)丑聞：丑聞：2004及及2005年韓國漢城大學(xué)教授黃年韓國漢城大學(xué)教授黃禹錫有關(guān)干細(xì)胞研究的論文兩次榮登禹錫有關(guān)干細(xì)胞研究的論文兩次榮登Science雜志，雜志，結(jié)果經(jīng)各方查證證實(shí)其論文數(shù)據(jù)存在造假現(xiàn)象，結(jié)果經(jīng)各方查證證實(shí)其論文數(shù)據(jù)存在造假現(xiàn)象，2006年年Science雜志宣布撤回這兩篇論文。雜志宣布撤回這兩篇論文。 第三十五頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù) l2006年，日本科學(xué)家山中亞彌等成功誘導(dǎo)出鼠誘導(dǎo)性年，日本科學(xué)家山中亞彌等成功誘導(dǎo)出鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（多能干細(xì)胞（induced Pluripotent Stem Cell， iPS細(xì)胞），此項(xiàng)研究成功將干細(xì)胞

28、研究擴(kuò)充到一個(gè)新的細(xì)胞），此項(xiàng)研究成功將干細(xì)胞研究擴(kuò)充到一個(gè)新的領(lǐng)域：重編程！領(lǐng)域：重編程！l2007年，年，iPS研究取得巨大進(jìn)展：山中亞彌等人和湯研究取得巨大進(jìn)展：山中亞彌等人和湯姆森帶領(lǐng)下的華裔科學(xué)家俞君英等人分別姆森帶領(lǐng)下的華裔科學(xué)家俞君英等人分別(fnbi)在在Cell及及Science發(fā)表論文宣布成功利用人類上皮細(xì)胞誘導(dǎo)出發(fā)表論文宣布成功利用人類上皮細(xì)胞誘導(dǎo)出iPS細(xì)胞。細(xì)胞。 第三十六頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù) l2008年，美國科學(xué)家解析了年，美國科學(xué)家解析了microRNAs在干細(xì)胞發(fā)育及分化在干細(xì)胞發(fā)育及分化中的調(diào)控作用，為干細(xì)胞日后的研究提供了非常重要的參考資中

29、的調(diào)控作用，為干細(xì)胞日后的研究提供了非常重要的參考資料。料。l2009年年3月，美國白頭研究所（月，美國白頭研究所（Whitehead Institute）科學(xué)家）科學(xué)家在成功誘導(dǎo)在成功誘導(dǎo)iPS細(xì)胞細(xì)胞(xbo)后，巧妙的將誘導(dǎo)后，巧妙的將誘導(dǎo)iPS時(shí)帶入細(xì)胞時(shí)帶入細(xì)胞的基因去除，大大降低了細(xì)胞癌變風(fēng)險(xiǎn)。的基因去除，大大降低了細(xì)胞癌變風(fēng)險(xiǎn)。 l2009年年3月，湯姆森和俞君英帶領(lǐng)的研究小組在月，湯姆森和俞君英帶領(lǐng)的研究小組在iPS研究方面研究方面又邁進(jìn)一大步，他們利用質(zhì)粒作為誘導(dǎo)又邁進(jìn)一大步，他們利用質(zhì)粒作為誘導(dǎo)iPS基因的載體進(jìn)行基因的載體進(jìn)行誘導(dǎo)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞后，隨著細(xì)胞分裂丟失質(zhì)粒，可

30、以得到純凈細(xì)胞后，隨著細(xì)胞分裂丟失質(zhì)粒，可以得到純凈無外源無外源DNA的的iPS細(xì)胞，在細(xì)胞，在iPS細(xì)胞應(yīng)用安全性方面又進(jìn)一細(xì)胞應(yīng)用安全性方面又進(jìn)一步。步。 第三十七頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)四四 . .胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)(piyng)(piyng)基本基本程序程序1.胚胎干細(xì)胞的分離胚胎干細(xì)胞的分離目前目前ES細(xì)胞主要有兩個(gè)來源，即細(xì)胞主要有兩個(gè)來源，即胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和和生殖嵴中的原始生殖細(xì)胞生殖嵴中的原始生殖細(xì)胞，前者更為常用。，前者更為常用。囊胚：盡量選擇體內(nèi)受精的胚胎分離囊胚：盡量選擇體內(nèi)受精的胚胎分離ES細(xì)胞；對(duì)細(xì)胞；對(duì)于相同來源的胚胎選擇

31、色澤透亮，于相同來源的胚胎選擇色澤透亮，ICM明顯的明顯的胚胎。胚胎。胎兒性腺脊：經(jīng)酶消化后，可直接培養(yǎng)在分化抑制胎兒性腺脊：經(jīng)酶消化后，可直接培養(yǎng)在分化抑制培養(yǎng)體系中，一般培養(yǎng)體系中，一般7d傳代一次，直至出現(xiàn)細(xì)胞形傳代一次，直至出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)均一的克隆細(xì)胞團(tuán)，挑選態(tài)均一的克隆細(xì)胞團(tuán)，挑選(tioxun)后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。第三十八頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)小鼠多用小鼠多用34天的胚泡或天的胚泡或23天的桑椹天的桑椹(sn zhn)胚胚，豬取豬取810天的胚泡，天的胚泡，綿羊綿羊(minyng)取取89天的胚泡，天的胚泡，人和牛取人和牛取78天的胚泡。天的胚泡。第三十九頁

32、，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)原始生原始生殖細(xì)胞殖細(xì)胞第四十頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)從胚泡中分離出細(xì)胞團(tuán)的方法從胚泡中分離出細(xì)胞團(tuán)的方法主要免疫外科主要免疫外科學(xué)方法，顯微外科學(xué)方法學(xué)方法，顯微外科學(xué)方法和和組織培養(yǎng)法組織培養(yǎng)法等等。其中其中組織培養(yǎng)法組織培養(yǎng)法是將胚泡接種在飼養(yǎng)層上是將胚泡接種在飼養(yǎng)層上，模擬，模擬(mn)體內(nèi)胚泡的著床，更接近自然發(fā)體內(nèi)胚泡的著床，更接近自然發(fā)育過程，較易獲得胚胎干細(xì)胞集落。育過程，較易獲得胚胎干細(xì)胞集落。第四十一頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)（1）免疫外科學(xué)方法）免疫外科學(xué)方法：該法的原理是利用囊胚：該法的原理是利用囊胚腔對(duì)抗體的不通

33、透性，通過抗體、補(bǔ)體結(jié)合對(duì)細(xì)腔對(duì)抗體的不通透性，通過抗體、補(bǔ)體結(jié)合對(duì)細(xì)胞的作用，去除滋養(yǎng)層細(xì)胞，保留胞的作用，去除滋養(yǎng)層細(xì)胞，保留ICM細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)。以小鼠為例，將體外培養(yǎng)的小鼠胚泡去除透以小鼠為例，將體外培養(yǎng)的小鼠胚泡去除透明帶后，經(jīng)抗小鼠脾細(xì)胞抗血清作用一定時(shí)明帶后，經(jīng)抗小鼠脾細(xì)胞抗血清作用一定時(shí)間后再移入含新鮮豚鼠血清的培養(yǎng)液中處理，間后再移入含新鮮豚鼠血清的培養(yǎng)液中處理，這樣滋養(yǎng)層細(xì)胞即被破壞，去除死去的滋養(yǎng)這樣滋養(yǎng)層細(xì)胞即被破壞，去除死去的滋養(yǎng)層細(xì)胞即得層細(xì)胞即得ICM，將，將ICM離散成卵裂球即可接離散成卵裂球即可接種培養(yǎng)。種培養(yǎng)。此法較為簡單，且去除滋養(yǎng)層細(xì)胞較徹底

34、此法較為簡單，且去除滋養(yǎng)層細(xì)胞較徹底(chd)，最為常用。最為常用。第四十二頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)（2）顯微外科學(xué)方法：）顯微外科學(xué)方法：小鼠受精后小鼠受精后3-4天，天，由子宮沖取胚泡，利用顯微操作系統(tǒng)直接從由子宮沖取胚泡，利用顯微操作系統(tǒng)直接從胚泡中吸出胚泡中吸出ICM細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng).（3）組織培養(yǎng)法）組織培養(yǎng)法:在小鼠受精在小鼠受精2.5天天后切除卵后切除卵巢，給予外源激素，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，但巢，給予外源激素，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，但延緩著床，延緩著床，4-6天后，從子宮中取胚泡進(jìn)行培天后，從子宮中取胚泡進(jìn)行培養(yǎng)。滋養(yǎng)層細(xì)胞生長并在培養(yǎng)皿底壁上鋪展養(yǎng)。滋養(yǎng)層細(xì)胞生長并在

35、培養(yǎng)皿底壁上鋪展(pzhn)，而，而ICM細(xì)胞增殖，垂直向上生長，形細(xì)胞增殖，垂直向上生長，形成卵圓柱狀結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下用玻璃針挑出成卵圓柱狀結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下用玻璃針挑出這種柱狀結(jié)構(gòu)，消化傳代。這種柱狀結(jié)構(gòu)，消化傳代。第四十三頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)2.選擇抑制細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系選擇抑制細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系由于由于ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中極易分化和失去正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中極易分化和失去正常二倍體核型，進(jìn)而失去全能性或多能性和喪失形成嵌合體動(dòng)物的能核型，進(jìn)而失去全能性或多能性和喪失形成嵌合體動(dòng)物的能力，因此需特殊的培養(yǎng)條件阻止其分化，以確保維持其全能力，因此需特殊的培養(yǎng)條件阻

36、止其分化，以確保維持其全能性或多能性。目前常用的抑制細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系有性或多能性。目前常用的抑制細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系有:1、飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系：、飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系：先用常規(guī)的培養(yǎng)液如先用常規(guī)的培養(yǎng)液如DMEM對(duì)體對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，等細(xì)胞鋪滿低壁后，用細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，等細(xì)胞鋪滿低壁后，用射線射線(shxin)照照射，使細(xì)胞分裂停止，形成特殊的細(xì)胞層，即飼養(yǎng)層。射，使細(xì)胞分裂停止，形成特殊的細(xì)胞層，即飼養(yǎng)層。然后將囊胚或然后將囊胚或PGCs與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)就可抑制與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)就可抑制ICM細(xì)細(xì)胞或胞或PGCs的分化，并促進(jìn)其分裂，進(jìn)一步分離獲得的分化，并促進(jìn)其分裂，進(jìn)一步分離獲得ES細(xì)細(xì)胞。胞。此

37、種方法效率高，結(jié)果穩(wěn)定，較為常用。此種方法效率高，結(jié)果穩(wěn)定，較為常用。第四十四頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)第四十五頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)2、條件培養(yǎng)體系：直接放入到特殊的培養(yǎng)、條件培養(yǎng)體系：直接放入到特殊的培養(yǎng)液中。這種培養(yǎng)液來源于某些液中。這種培養(yǎng)液來源于某些(mu xi)細(xì)胞如豚細(xì)胞如豚鼠肝臟細(xì)胞，人膀胱癌細(xì)胞和小鼠血管內(nèi)皮鼠肝臟細(xì)胞，人膀胱癌細(xì)胞和小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞等飼養(yǎng)一段時(shí)間后回收的液體。細(xì)胞等飼養(yǎng)一段時(shí)間后回收的液體。這些細(xì)胞在生長過程中不僅能分泌這些細(xì)胞在生長過程中不僅能分泌LIF，同時(shí)，同時(shí)IGF-II等生長因子，能促進(jìn)等生長因子，能促進(jìn)ES細(xì)胞的生長。細(xì)胞

38、的生長。第四十六頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)3、培養(yǎng)液中添加分化抑制因子體系：將分化、培養(yǎng)液中添加分化抑制因子體系：將分化抑制因子抑制因子LIF或白介素或白介素6（IL-6）家族按照一）家族按照一定濃度定濃度(nngd)直接添加到囊胚或直接添加到囊胚或PGCs的培養(yǎng)液的培養(yǎng)液中，分離中，分離ES細(xì)胞。細(xì)胞。方法簡單，且能避免飼養(yǎng)層細(xì)胞的干擾。方法簡單，且能避免飼養(yǎng)層細(xì)胞的干擾。目前只在小鼠目前只在小鼠ES細(xì)胞取得成功。細(xì)胞取得成功。第四十七頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)v小鼠采用超排卵途徑收集小鼠采用超排卵途徑收集(shuj)胚胎胚胎 雌性成年小鼠注射雌性成年小鼠注射5U孕馬血清

39、孕馬血清(xuqng)促性腺激素（促性腺激素（MPS），），48h后再注射后再注射5U人絨毛膜促性腺激素（人絨毛膜促性腺激素（HCG）；）； 與雄鼠合籠，自然與雄鼠合籠，自然(zrn)交配，陽性者為交配，陽性者為0天（即天（即0.5dpc）；）； 第三天至第四天中午（即第三天至第四天中午（即3.5 dpc4.5 dpc）分別剖取孕鼠子宮，沖出）分別剖取孕鼠子宮，沖出早期胚泡，進(jìn)一步分離培養(yǎng)建立早期胚泡，進(jìn)一步分離培養(yǎng)建立ES細(xì)胞系；細(xì)胞系； 剖取發(fā)育至剖取發(fā)育至8.5 dpc10.5 dpc時(shí)的胚胎，可建立小鼠時(shí)的胚胎，可建立小鼠EG細(xì)胞系細(xì)胞系。 第四十八頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)

40、四、四、ES細(xì)胞和細(xì)胞和EG細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)(piyng)過程過程 vES細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)(piyng)過程過程 基本(jbn)培養(yǎng)液DMEM液液 15%20% FCS0.1mmol/L巰基乙醇巰基乙醇50U/ml青霉素、青霉素、50ug/ml鏈霉素鏈霉素-巰基乙醇是一種還原劑，其主要作用是降低氧對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷，體外培養(yǎng)必須抑制自由基的氧化，所以-巰基乙醇是保護(hù)蛋白不被自由基氧化的很好的高效的物質(zhì)。第四十九頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)將胚泡接種將胚泡接種(jizhng)于預(yù)先鋪有作為滋養(yǎng)層而無有絲分裂活性的于預(yù)先鋪有作為滋養(yǎng)層而無有絲分裂活性的單層單層MEF細(xì)胞的培養(yǎng)皿中

41、細(xì)胞的培養(yǎng)皿中 用免疫手術(shù)法分離用免疫手術(shù)法分離(fnl)胚泡的胚泡的ICM細(xì)胞，或用常規(guī)培養(yǎng)法分離出細(xì)胞，或用常規(guī)培養(yǎng)法分離出ICM細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)。細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)。 培養(yǎng)培養(yǎng)(piyng)23天天 第五十頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)免疫免疫(miny)手術(shù)法手術(shù)法 44.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋養(yǎng)外層胚層和未分化的的小鼠胚泡主要由已分化的滋養(yǎng)外層胚層和未分化的ICM細(xì)細(xì)胞組成，前者細(xì)胞表面一般已表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（胞組成，前者細(xì)胞表面一般已表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC），能），能識(shí)別其相應(yīng)抗體和形成免疫復(fù)合物，在補(bǔ)體存在識(shí)別其相應(yīng)抗體和形成免疫復(fù)合物，在補(bǔ)體存在(

42、cnzi)時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生免時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生免疫溶解。疫溶解。具體操作如下：具體操作如下： 第五十一頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)體外培養(yǎng)的胚泡，用酸性體外培養(yǎng)的胚泡，用酸性Tyrodes液（液（pH2.5）處理，去除）處理，去除(q ch)透明帶；透明帶； Hanks洗滌洗滌(xd)，加入兔抗，加入兔抗JCR小鼠脾臟細(xì)胞抗血清（抗小鼠脾臟細(xì)胞抗血清（抗H2b）；）； 移至含新鮮移至含新鮮(xn xin)豚鼠血清的培養(yǎng)液，豚鼠血清的培養(yǎng)液，Hanks液洗滌后，移至液洗滌后，移至96孔鋪有孔鋪有MEF或或STO飼養(yǎng)層細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞和DMEM基本培基本培養(yǎng)液的板內(nèi)進(jìn)一步培養(yǎng)。養(yǎng)液的板內(nèi)進(jìn)一

43、步培養(yǎng)。 30min胚泡的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞呈泡狀，發(fā)生免疫溶解；而胚泡的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞呈泡狀，發(fā)生免疫溶解；而ICM細(xì)胞不具細(xì)胞不具H2b抗抗原，細(xì)胞完整；原，細(xì)胞完整；30min第五十二頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)常規(guī)常規(guī)(chnggu)培養(yǎng)法培養(yǎng)法 未去透明帶的胚泡培養(yǎng)未去透明帶的胚泡培養(yǎng)34天，天，ICM細(xì)胞細(xì)胞(xbo)團(tuán)從貼壁胚泡內(nèi)長出來；團(tuán)從貼壁胚泡內(nèi)長出來； 胰蛋白酶和胰蛋白酶和EDTA混合混合(hnh)消化液在消化液在37消化消化5min； 解離的細(xì)胞團(tuán)移至滋養(yǎng)層的解離的細(xì)胞團(tuán)移至滋養(yǎng)層的24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)4天，可在一些孔內(nèi)見到天，可在一些孔內(nèi)見到巢

44、狀胚胎干細(xì)胞團(tuán)；巢狀胚胎干細(xì)胞團(tuán)； 胰蛋白酶消化巢狀胚胎干細(xì)胞團(tuán)并繼續(xù)培養(yǎng)，克隆和純化胰蛋白酶消化巢狀胚胎干細(xì)胞團(tuán)并繼續(xù)培養(yǎng)，克隆和純化ES細(xì)胞。細(xì)胞。視視ES細(xì)胞巢密度轉(zhuǎn)移到較大容積的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。細(xì)胞巢密度轉(zhuǎn)移到較大容積的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。第五十三頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)五五.ES.ES細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)的保存的保存1.常規(guī)常規(guī)(chnggu)保存：通過不斷的更換分化抑保存：通過不斷的更換分化抑制培養(yǎng)液，以傳代培養(yǎng)方式維持制培養(yǎng)液，以傳代培養(yǎng)方式維持ES的不分的不分化狀態(tài)。如人的化狀態(tài)。如人的ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代2年仍年仍維持不分化狀態(tài)。維持不分化

45、狀態(tài)。2.冷凍保存：通過超低溫冷凍保存使細(xì)胞的代冷凍保存：通過超低溫冷凍保存使細(xì)胞的代謝活動(dòng)完全停止，達(dá)到長期保存的目的。謝活動(dòng)完全停止，達(dá)到長期保存的目的。第五十四頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)六六.ES.ES細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)的鑒定的鑒定通過分離培養(yǎng)獲得的通過分離培養(yǎng)獲得的ICM或或PGCs細(xì)胞在傳到細(xì)胞在傳到812代時(shí)，需要通過生化或細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)的鑒定最代時(shí)，需要通過生化或細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)的鑒定最終確認(rèn)為終確認(rèn)為ES細(xì)胞系。細(xì)胞系。1.形態(tài)：呈克隆狀生長，即單個(gè)形態(tài)：呈克隆狀生長，即單個(gè)ES細(xì)胞能繁殖呈細(xì)胞能繁殖呈形態(tài)、功能和遺傳基礎(chǔ)完全相同的一簇細(xì)胞，形態(tài)、功能和遺傳基

46、礎(chǔ)完全相同的一簇細(xì)胞，并凝聚成團(tuán)，外觀形似鳥巢。并凝聚成團(tuán)，外觀形似鳥巢。2.階段特異性胚胎抗原階段特異性胚胎抗原(kngyun)(SSEA)：對(duì)細(xì)胞表：對(duì)細(xì)胞表面的面的SSEA通過化學(xué)方法檢測，先將細(xì)胞用多聚通過化學(xué)方法檢測，先將細(xì)胞用多聚甲醛固定，在用生物素標(biāo)記的二抗和辣根過氧甲醛固定，在用生物素標(biāo)記的二抗和辣根過氧化物的底物處理，來鑒定細(xì)胞表面的特異性糖化物的底物處理，來鑒定細(xì)胞表面的特異性糖蛋白。蛋白。第五十五頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)3.端粒酶檢測：通常端粒酶檢測：通常ES細(xì)胞端粒酶水平遠(yuǎn)高于其細(xì)胞端粒酶水平遠(yuǎn)高于其他他(qt)分化的體細(xì)胞，可用正常體細(xì)胞或癌細(xì)胞做分化的體

47、細(xì)胞，可用正常體細(xì)胞或癌細(xì)胞做對(duì)照，用專用試劑盒檢測。對(duì)照，用專用試劑盒檢測。4.Apase（堿性磷酸酶）：可通過組織化學(xué)方法鑒（堿性磷酸酶）：可通過組織化學(xué)方法鑒定，細(xì)胞經(jīng)乙醇或病痛甲醛固定后，直接加入底物，定，細(xì)胞經(jīng)乙醇或病痛甲醛固定后，直接加入底物，即可鑒定即可鑒定Apase的表達(dá)水平，都應(yīng)該為陽性。的表達(dá)水平，都應(yīng)該為陽性。5.核型分析：傳到核型分析：傳到25代時(shí)需要進(jìn)行核型分析，分代時(shí)需要進(jìn)行核型分析，分析時(shí)先在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一定濃度的秋水酰胺，析時(shí)先在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一定濃度的秋水酰胺，使細(xì)胞同步在使細(xì)胞同步在M期，然后用低滲溶液處理，經(jīng)乙期，然后用低滲溶液處理，經(jīng)乙醇冰醋酸溶液

48、固定后染色和顯微照相，最后進(jìn)醇冰醋酸溶液固定后染色和顯微照相，最后進(jìn)行核型分析，檢測細(xì)胞是否維持在二倍體狀態(tài)。行核型分析，檢測細(xì)胞是否維持在二倍體狀態(tài)。第五十六頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)6.發(fā)育分化潛力：發(fā)育分化潛力：（1）體外誘導(dǎo)分化：是把）體外誘導(dǎo)分化：是把ES細(xì)胞培養(yǎng)在無細(xì)胞培養(yǎng)在無分化抑制物的普通培養(yǎng)液中，如果分化抑制物的普通培養(yǎng)液中，如果ES細(xì)胞能細(xì)胞能自動(dòng)聚合并分化形成胚狀體，可初步確認(rèn)具有自動(dòng)聚合并分化形成胚狀體，可初步確認(rèn)具有發(fā)育多能性；發(fā)育多能性；（2）畸胎瘤實(shí)驗(yàn)：把）畸胎瘤實(shí)驗(yàn)：把ES細(xì)胞注射到有免疫細(xì)胞注射到有免疫(miny)缺陷成年小鼠或遺傳同質(zhì)動(dòng)物的皮下或腎

49、缺陷成年小鼠或遺傳同質(zhì)動(dòng)物的皮下或腎臟、睪丸的被膜下，如果能形成畸胎瘤，可臟、睪丸的被膜下，如果能形成畸胎瘤，可初步判定為細(xì)胞具有多能性。初步判定為細(xì)胞具有多能性。第五十七頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)（3）嵌合體實(shí)驗(yàn)：把培養(yǎng)的）嵌合體實(shí)驗(yàn)：把培養(yǎng)的ES細(xì)胞與早期細(xì)胞與早期胚胎的卵裂球聚合，或直接把胚胎的卵裂球聚合，或直接把ES細(xì)胞注入細(xì)胞注入囊胚腔，然后讓重組胚在體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，囊胚腔，然后讓重組胚在體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，通過檢測后代的嵌合狀況，分析通過檢測后代的嵌合狀況，分析ES細(xì)胞的細(xì)胞的分化潛力。只有當(dāng)操作后的胚胎發(fā)育為分化潛力。只有當(dāng)操作后的胚胎發(fā)育為嵌合體，注入的細(xì)胞能分化為內(nèi)、中和嵌

50、合體，注入的細(xì)胞能分化為內(nèi)、中和外三胚層細(xì)胞，并參與細(xì)胞生殖干細(xì)胞外三胚層細(xì)胞，并參與細(xì)胞生殖干細(xì)胞形成時(shí)，才能確認(rèn)為形成時(shí)，才能確認(rèn)為ES細(xì)胞。細(xì)胞。目前目前(mqin)，只有小鼠、猴和人能到達(dá)以上，只有小鼠、猴和人能到達(dá)以上指標(biāo)。指標(biāo)。第五十八頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)1 如何維持體外擴(kuò)增時(shí)不分化？如何維持體外擴(kuò)增時(shí)不分化？2 分化細(xì)胞的增殖是一個(gè)瓶頸問題：數(shù)量和純度分化細(xì)胞的增殖是一個(gè)瓶頸問題：數(shù)量和純度3 如何定向誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化？明確干細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控如何定向誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化？明確干細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控機(jī)制機(jī)制4 胚胎干細(xì)胞真正用于器官克隆與移植仍需要技術(shù)上的突破胚胎干細(xì)胞真正用于

51、器官克隆與移植仍需要技術(shù)上的突破5 如何克服移植排斥問題？破壞或改變細(xì)胞許多基因的如何克服移植排斥問題？破壞或改變細(xì)胞許多基因的可行性，核移植是否激活卵細(xì)胞的沉默基因，是否改變可行性，核移植是否激活卵細(xì)胞的沉默基因，是否改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)？染色體結(jié)構(gòu)？6 胚胎干細(xì)胞的安全性如何？畸胎瘤，腫瘤胚胎干細(xì)胞的安全性如何？畸胎瘤，腫瘤(zhngli)形成形成？7 倫理之爭倫理之爭七七.ES.ES細(xì)胞技術(shù)目前細(xì)胞技術(shù)目前(mqin)(mqin)存在的問題存在的問題第五十九頁，共七十頁。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)1.ES細(xì)胞系的分裂效率低細(xì)胞系的分裂效率低主要原因是缺乏理想的分離培養(yǎng)體系主要原因是缺乏理想的分離培養(yǎng)體系(tx)，目，目前對(duì)于前對(duì)于ES干細(xì)胞維持多能性的分子機(jī)理缺乏干細(xì)胞維持多能性的分子機(jī)理缺乏了解，不能根據(jù)細(xì)胞分化特點(diǎn)和維持不分化了解，不能根據(jù)細(xì)胞分化特點(diǎn)和維持不分化的營養(yǎng)要求，建立合理的培養(yǎng)體系，是目前的營養(yǎng)要求，建立合理的培養(yǎng)體系，是目前存在的主要問題。存在的主要問題。2.ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的理論和技術(shù)水平低細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的理論和技術(shù)水平低目前的技術(shù)還無法對(duì)目前的技術(shù)還無法對(duì)ES細(xì)胞實(shí)施專一的誘導(dǎo)分細(xì)胞實(shí)施專一的誘導(dǎo)分化，即分化為特定的細(xì)胞類型，如神經(jīng)或