生物化學氨基酸與肽

1、會計學1生物化學氨基酸與肽生物化學氨基酸與肽2The light produced by fireflies is the result of a reaction involving the protein luciferin and ATP, catalyzed by the enzyme luciferase. 蛋白質功能的多樣性Erythrocytes contain large amounts of the oxygen-transporting protein hemoglobin.The chemical properties of black rhinoceros horn a

2、re no different from those of bovine hooves or human fingernails, which are mainly protein keratin.319 differentR-groups: - Structure - Size - Polarity - Ionization - Hydropathygeneral structure2 marking-methods- 含有氨基與羧基 - -AA (Pro例外)- 20種有遺傳密碼 - 常見/標準AA- 可依據(jù)側鏈(R-)結構分類pKa 1.82.5pKa 8.710.71. 氨基酸結構與分

3、類 (Amino Acid, AA)4 AA大多具有兩種異構體(except for Gly, Ile & Thr)Where R H, the C is a chiral center(optical activity & configuration)(cf. 甘油醛-OHin Fig. 2-6)- 蛋白質中的AA均為L-構型 (大多右旋，少數(shù)左旋)mainly in germs & antibiotics(cf. Fig. 2-5)520種標準氨基酸可以按其側鏈分類 (cf. Tab. 2-1)EAA6Ala, Val, Leu, Ile非極性側鏈，不帶電荷，疏水性

4、，多在蛋白質內部Gly非極性，R=H，適應多種構象，多見于肽鏈轉折處Met側鏈含有非極性的甲硫醚 非極性脂肪族AA (cf. Fig. 2-1)甘氨酸丙氨酸纈氨酸亮氨酸蛋氨酸異亮氨酸 亦為C*，故有別構異構體之分側鏈的高度疏水性互作對建立及維持蛋白質3D結構非常重要7Phe疏水側鏈Tyr-OH可以形成H鍵，是某些酶的功能基團，磷?；赊D移到-OH上Trp吲哚N可作為H鍵供體Trp & Tyr 能吸收 UV (TrpTyr, Phe to a lesser extent)，是為大多數(shù)蛋白質在 280 nm具有很強光吸收的主要原因 芳香族AA苯丙氨酸酪氨酸色氨酸8Tyr和Trp的紫外吸收(

5、Phe的最大吸收在260 nm)pH 6.0濃度10-3 M(cf. Fig. 2-7)9Ser, Thr (C*)極性-OH 可與水形成H鍵，磷?；吞擎溡嗫赊D移到 -OH上Cys極性來自其-SH，其氧化可形成S-S連接的胱氨酸二聚體二硫鍵/橋在確定蛋白質 結構中具有重要作用半胱氨酸蘇氨酸絲氨酸 極性不帶電荷AA (1)glycosidic bond(cf. Fig. 2-2)10二硫鍵的可逆形成與裂解胰島素多肽鏈鏈內及鏈間的二硫鍵交連insulinA鏈：豬、狗、兔和抹香 鯨的均與人的相同B鏈：牛、豬、狗、羊和 馬的均相同胱氨酸(meso-)11Pro (a pyrrole)環(huán)繞2胺和C連鍵

6、的旋轉受到一定限制，使肽鏈中含有Pro 區(qū)段的結構柔曲性受到相應的影響多見于肽鏈轉折處Asn, Gln分別為Asp和Glu的酰胺酰胺的-NH2可作為H鍵供體，-C=O則可作為H鍵受體多在蛋白分子表面與水互作-CH2-CAsn or Gln: serves as H-acceptor ONserve as H-donor H H 極性不帶電荷AA (2)脯氨酸天冬酰胺谷氨酰胺(cf. Fig. 2-2)12Lys側鏈位的第二個1胺在中性 pH條件下帶正電荷dgbArg胍基在中性pH條件下帶正電荷；具有很強的氫鍵供體作用His唯一的一個側鏈pKa值接近于中性 pH的標準AA多見于酶的活性部位，其咪

7、唑環(huán)可 在質子化與去質子化之間轉換， 以催化反應鍵的形成和斷裂 帶正電荷AA (堿性)賴氨酸組氨酸精氨酸H-donor groups of ArgCNHNHHNHHguanidino (cf. Fig. 2-3)13-CH2-CProtonatedform of Asp or Glu: can serve as H-acceptor OO-CH2-COOcan serve as H-donor H Ionizedform of Asp or Glu: can serve as H-acceptor Asp, Glu側鏈的第二個羧基在中性pH條件下可解離而帶負電荷， 具有H鍵受體作用 帶負電荷A

8、A (酸性)天冬氨酸谷氨酸(cf. Fig. 2-2)14CH+NH3 RCOO CHNH2 RCOO CH+NH3 RCOOH+ H+ + H+ Amino acid dissolved in water exists as dipolar ion = zwitterion即可作為H+供體(酸)也可作為 H+受體(堿) AA的兩性解離 (cf. p20)質子(proton)AA兼性離子(MP300)2. 氨基酸的酸堿特性(cf. Fig. 2-8)15只有單氨基和單羧基的簡單-AA在完全質子化時可視為二元酸：可逐步給出2H+- H+ - H+ Net charge:+ 10- 1diprot

9、ic acid不存在這樣一種pH，此時COOH和NH2都占優(yōu)勢pKa 1.82.5pKa 8.710.7(cf. Fig. 2-8)16 氨基酸滴定(二元酸型)各階段優(yōu)勢離子最大緩沖區(qū)等電點isoelectric point(充分離子化但不帶凈電荷)pI = (pKn + pKn+1)+H3N-CH2-COOH+H3N-CH2-COO = 1H+ donorH+ acceptorH+ donorH+ acceptor+H3N-CH2-COOH2N-CH2-COO = 1A+ A0 A 加入堿的物質量/mol (cf. Fig. 2-9)17由二元酸型簡單AA滴定可得如下推論：- AA通常具有兩

10、個緩沖區(qū)(三元酸型例外)- AA的(平均)凈電荷與溶液的pH有關- 在生理pH時AA大多為兼性離子- 在pI時因凈電荷為零，AA溶解度最小 而容易沉淀析出(eg. pIGlu = 3.22)- 各功能基團的pKa在很大程度上受其 所處化學環(huán)境的影響(cf. next slide)18 化學環(huán)境對pKa的影響(cf. p22)類似的互作亦廣泛存在于臨近分子的化學基團之間(例如酶的活性中心) 相斥相吸羧基解離H+后兩基團相吸而使兼性離子更加穩(wěn)定H+繼續(xù)降低時，電負性O對e的吸引將使質子化氨基更容易釋出H+19A+ A0 A A2 pI = 3.22 谷氨酸滴定(三元酸型)pI 等于兼性離子兩側的p

11、Ka平均值(cf. Fig. 2-10)20A+ A2+ A0 A 組氨酸滴定(三元酸型)pI = 7.59pI 等于兼性離子兩側的pKa平均值Hb中His含量較高：本身即具有較大的緩沖能力(cf. Fig. 2-10)21- 茚三酮反應Ninhydrin在弱酸溶液中與AA共熱可使 所有帶伯氨基的AA氧化脫氨脫羧并生成 藍紫色化合物(Pro生成亮黃色)- 2,4-二硝基氟苯反應DNFB在弱堿性溶液中可與AA 發(fā)生親核芳環(huán)取代反應，生成 黃色二硝基苯基氨基酸DNP-AA- 丹磺酰氯反應DNS-Cl在弱堿性溶液中可使AA?；?生成強熒光性的丹磺酰衍生物DNS-AA- 苯異硫氰酸酯反應PITC在弱

12、堿性條件下能與AA反應 生成無色的苯乙內酰硫脲衍生物 PTH-AA均為-NH2烴基化(Sanger)(Edman)3. 氨基酸特征反應22 茚三酮反應(檢測精度可達0.550g)= -氨基與羧基共同參與 的氧化脫氨和脫羧反應- Pro與之反應時不釋出 NH3而直接生成亮黃色 化合物pH 51004-10 (Garrett)(cf. Fig. 2-13)23DNP-AADNFB/FDNBDNS-ClDNS-AAPITCPTH-AAPTC-AA -NH2的烴基化反應對酸水解穩(wěn)定(vs.肽鍵)(cf. Fig. 2-27)24ureabiuretCu2+ OH紫紅/藍紫色化合物- 雙縮脲由兩分子尿素

13、加熱至180時縮合而成，在堿性 溶液中能與CuSO4反應生成紫色絡合物- 蛋白質中的肽鍵與之類似，也能經(jīng)由該反應變?yōu)榧t紫色- 雙縮脲反應既可用于蛋白質的定性鑒定，也可經(jīng)540nm 比色定量測定(revising with Kjeldahl method) 雙縮脲反應(含2個及更多肽鍵的化合物) 蛋白質顏色反應蛋白質中的一些基團能與某些特定的試劑反應而生成有色物質，可用作定性及定量檢測依據(jù)自學cyanuramide25 黃色反應(苯環(huán)可被硝化生成硝基苯衍生物)- 含有芳香族AA (esp. Tyr & Trp)的蛋白質在溶液中 遇到硝酸時可產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變黃，再加堿 則顏色加深為橙

14、黃色- 皮膚、毛發(fā)、指甲遇濃硝酸都會變黃 米倫反應(酚類化合物)- 米倫試劑是硝酸汞、亞硝酸汞硝酸和亞硝酸的混合物- 蛋白質加入米倫試劑可產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變紅- Tyr及含該AA的化合物都有此反應自學26 乙醛酸反應(含吲哚基的化合物)在含Trp的蛋白溶液中加入乙醛酸后再沿試管壁慢慢注入濃硫酸，兩液層之間會出現(xiàn)紫色環(huán) 坂口反應(含胍基的化合物)Arg的胍基能與次氯酸鈉/次溴酸鈉及萘酚在NaOH溶液中產(chǎn)生紅色物質，可用于鑒定含Arg的蛋白質及定量測定Arg 福林反應(Folin-酚法)- Tyr的酚基能還原福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸 而生成藍色化合物- 為雙縮脲反應的發(fā)展，靈敏度更高自學27

15、 肽是經(jīng)由肽鍵連接的氨基酸聚合鏈反應本質為脫水縮合( acylation of :NH2)peptide bondt1/2 usu. 7yr (higher G0)Unfavorable:OH being poor leaving group4. 肽 - 蛋白質一級結構as a nucleophile (cf. p27)28A peptide of 5 AA residues“N-terminus”“C-terminus”Ser-Gly-Tyr-Ala-LeuWhats the peptide without both free N- & C-terminus?(cf. Fig. 2-

16、14)29Ionization of peptidesPeptides have only one free amino group and one free carboxyl group at either end of the chain.R-groups can ionize, and contributeto the acid-base behavior of thepeptide.But, interactions with other R-groupsand loss of the charges from the AAs-amino and -carboxyl groups ca

17、naffect R-group pKa.R側鏈的離子特性對蛋白質3D構象影響很大：非末端AA的氨基和羧基均因形成肽鍵而失去(其影響) 肽的離子化行為取決于其側鏈組成 ( a bigger AA, cf. p28)pKa 3.2, but 2.18for free LyspKa 8.5, but 9.69for free Ala30A source for the determination of the isoelectric point when the primary sequence of a peptide is provided.自學31 肽/蛋白質具有特定的等電點胃蛋白酶脲酶血紅蛋

18、白(Hb)肌紅蛋白(Mb)細胞色素c (cyt c)溶菌酶32 多肽/蛋白質具有特定的氨基酸組成(by hydrolysis)- 酸水解將使Asn/Gln 轉化為Asp/Glu，而 Trp的吲哚環(huán)則會被 氧化破壞- 堿水解會不同程度地 破壞多數(shù)AA并產(chǎn)生 消旋混合物- 酶水解不破壞AA或 產(chǎn)生消旋，但因專一 性所限而需要多種酶 協(xié)同作用33 有些蛋白質具有非氨基酸化學基團結合蛋白可依據(jù)其輔基分類34 蛋白質具有高級層次結構- 纖維蛋白的特性一般在二級結構上即可表現(xiàn)出來- 球蛋白的生物學功能往往需要以三級結構形式來實現(xiàn)- 酶等特殊球蛋白大多要在四級結構層次上才能表達其活性(covalent bo

19、nd) (hydrogen bond) (3D for a peptide) (3D for more peptides)(cf. Fig. 2-16)35自學36 生物活性肽具有重要的生理功能谷胱甘肽Glutathione(oxidative)胰島素Insulin(hexomer)阿斯巴甜Aspartame(cf. p28 & Fig. 2-15)37要點提示 蛋白質由20種標準-AA組成，不同AA的性質差異取決 于其R側鏈的不同，并可依據(jù)其極性以及在生理pH條件 下的荷電狀態(tài)而分為中性脂肪族、芳香族、極性不帶電 荷、帶正電荷(堿性)和負電荷(酸性) AA等類別 除Gly外，所有標準

20、-AA的C都是不對稱的，故至少 具有兩種不同的立體構型，但在天然蛋白中都是L-型 異構體；非標準AA則往往是游離的代謝中間物或是 標準AA的衍生物 單氨基單羧基的簡單AA在低pH條件下為二元酸型陽離 子，其羧基隨著pH的增加失去質子而形成電中性的兼性 離子(是為等電點pI)，進一步加大pH將導致其氨基失去 質子而形成負離子；帶有可解離R側鏈的AA的荷電狀態(tài) 則取決于溶液pH及其pK值38要點提示 (續(xù)1) AA的氨基、羧基和R側鏈的某些基團可進行特征性化學 反應；茚三酮反應可用于AA的定性定量測試，DNFB、 DNS-Cl和PITC等則常用于測定肽鏈的N-端殘基 AA可以經(jīng)由肽鍵共價連接形成肽

21、鏈/蛋白質；細胞通常 含有數(shù)以千計的功能及生物學活性均不相同的蛋白質； 蛋白質可以是由成百上千個殘基組成的多肽鏈，也可以 是僅由少量殘基構建的寡肽鏈；簡單蛋白質的水解只生 成AA，復合蛋白質則含有其它非AA組分 蛋白質結構可分為四個層次；初級結構為AA序列以及二 硫鍵連接；二級結構是相鄰殘基形成的局部空間分布； 三級結構為整條多肽鏈呈現(xiàn)的3D構象；四級結構則涉及 到穩(wěn)定連接的多條多肽鏈/亞基所形成的特定空間聯(lián)系 39作 業(yè)1) 組成蛋白質的20種AA中，哪些是極性的？哪些是非極性的？哪一種 不能參與形成真正的肽鍵？為什么？2) 將固體AA溶解于pH 7的水中所得的溶液，有的pH7，有的pH7，

22、 這種現(xiàn)象說明了什么？3) 根據(jù)Asp的解離常數(shù)(p20，表2-1)： a) 圖示其隨溶液pH由酸至堿變化過程中的解離狀態(tài)； b) 在pI時它處于哪種解離態(tài)？ c) 計算其pI值4) Gly是由乙酸甲基上的H被一個氨基取代而成的，但其羧基的pKa要比 乙酸羧基的pKa更低，為什么？5) 與乳腺釋放乳汁有關的催產(chǎn)素是一種九肽激素： Cys-Phe-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-His-Gly-NH2， 兩個Cys之間以二硫鍵相連 。試計算當pH為2.0, 8.5和10.7時，該九 肽的凈電荷分別是多少？(已知N-末端Cys的游離氨基pKa為10.7， Glu側連羧基的pKa為4.07，

23、His側連咪唑基的pKa為6.0；二硫鍵在 上述pH條件下均穩(wěn)定，而且C-末端羧基已被酰胺化。)40一、選擇 3, 5, 7, 8, 16, 17二、填空 1, 7, 8, 15三、判斷 14, 9四、判斷 2, 5, 6, 8, 11, 15五、問答與論述 3, 12復習題(考研精解 p1620)41There are three other amino acids that are incorporated directly into proteins at the ribosome. Each uses a codon otherwise used by another amino ac

24、id, or which normally acts as a stop codon. The 21st proteinogenic amino acid is N-formylmethionine, which is the first amino acid in all bacterial proteins. It is encoded by the same codon as methionine (AUG), but because of the interaction between initiation factors and ribosome at the start of tr

25、anslation, only the tRNA for N-formylmethionine is able to bind the start codon. The 22nd proteinogenic amino acid is selenocysteine, which is encoded by a special interpretation of the opal stop codon UGA, and is an important component of some enzymes, such as glutathione peroxidase. The 23rd genet

26、ically encoded amino acid is found in the methanogenic Archaea, which can interpret the amber stop codon (UAG) as the amino acid pyrrolysine when it is followed by a sequence in the mRNA that folds into a specific stem-loop structure.N-formyl methionine Selenocysteine Pyrrolysine 自學42Ala, Val, Leu, Ile非極性側鏈，不帶電荷，疏水性，多在蛋白質內部Gly非極性，R=H，適應多種構象，多見于肽鏈轉折處Met側鏈含有非極性的甲硫醚 非極性脂肪族AA (cf. Fig. 2-1)甘氨酸丙氨酸纈氨酸亮氨酸蛋氨酸異亮氨酸 亦為C*，故有別構異構體之分側鏈的高度疏水性互作對建立及維持蛋白質3D結構非常重要43Lys側鏈位的第二個1胺在中性 pH條件下帶正電荷dgbArg胍基在中性pH條件下帶正電荷；具有很強的氫鍵供體作用His唯一的