豬瘟檢測方法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上豬瘟檢測方法豬瘟間接血凝試驗操作方法 （一）試驗材料 196孔110120°V型醫(yī)用血凝板 210100微升可調(diào)微量移液器 3塑料咀 4豬瘟間接血凝抗原（豬瘟正向血凝診斷液），每瓶5毫升，可檢測血清2530頭份 5陽性對照血清，每瓶2毫升；陰性對照血清，每瓶2毫升6稀釋液每瓶10毫升7待檢血清每份0.20.5毫升（56水浴滅活30分鐘） （二）操作步驟 1檢測前，應(yīng)將凍干診斷液，每瓶加稀釋液5毫升浸泡710天后方可應(yīng)用。 2稀釋待檢血清：在血凝板上的第1孔第6孔各加稀釋液50微升。吸取待檢血清50微升加入第1孔，混勻后從中取出50微升加入第2孔，依此類推直至

2、第6孔混勻后丟棄50微升，從第1孔第6孔的血清稀釋度依次為1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64。 3稀釋陰性和陽性對照血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀釋液60微升，取陰性血清20微升混勻取出30微升丟棄。此孔即為陰性血清對照孔。 在血凝板上的第12排第1孔加稀釋液70微升，第27孔各加稀釋液50微升，取陽性血清10微升加入第1孔混勻，并從中取出50微升加入第2孔混勻后取出50微升加入第3孔直到第7孔混勻后棄50微升，該孔的陽性血清稀釋度為1：512。 4在血凝板上的第1排第8孔加稀釋液50微升，作為稀釋液對照孔。 5判定方法和標(biāo)準(zhǔn)：先觀察陰性血清對照孔和稀釋液對照孔，紅血球

3、應(yīng)全部沉入孔底，無凝集現(xiàn)象（）或呈（+）的輕度凝集為合格；陽性血清對照應(yīng)呈（+）凝集為合格。 在以上3孔對照合格的前提下，觀察待檢血清各孔的凝集程度，以呈“+”凝集的待檢血清最大稀釋度為其血凝效價（血凝價）。血清的血凝價達(dá)到1：16為免疫合格。 “-”表示紅細(xì)胞100%沉于孔底，完全不凝集 “+”表示約有25%的紅細(xì)胞發(fā)生凝集 “+”表示50%紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集 “+”表示75%紅細(xì)胞凝集 “+“表示90100%紅細(xì)胞凝集 6注意事項（1） 勿用90°或130°血凝板，以免誤判。（2） 污染嚴(yán)重或溶血嚴(yán)重的血清樣品不宜檢測。（3） 凍干血凝抗原，必須加稀釋液浸泡710天，方可使

4、用，否則易發(fā)生自凝現(xiàn)象。（4） 用過的血凝板，應(yīng)及時沖冼干凈，勿用毛刷或其他硬物刷洗板孔，以免影響孔內(nèi)光潔度。（5） 使用血凝抗原時，必須充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉積。（6） 液體血凝抗原48貯存有效期四個月，可直接使用。凍干血凝抗原48貯存有效期三年。（7） 如來不及判定結(jié)果或靜置2小時結(jié)果不清晰，也可放置第2天判定。（8） 每次檢測，只設(shè)陰性、陽性血清和稀釋液對照各1孔。（9） 稀釋不同的試劑要素時，必須更換塑料咀。（10）血凝板和塑料咀洗凈后，自然干燥，可重復(fù)使用。(李樹春)豬瘟病毒強(qiáng)弱毒鑒別診斷ELISA操作方法（一）試驗材料 1豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原和豬瘟強(qiáng)毒單抗純化酶聯(lián)抗原，分別供

5、檢測經(jīng)豬瘟弱毒疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體和感染豬瘟強(qiáng)毒后產(chǎn)生的抗體之用。2酶標(biāo)抗體3豬瘟陽性、陰性血清4酶聯(lián)板及其他必要的試劑。（二）操作步驟 1用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原、豬瘟強(qiáng)毒單抗純化酶聯(lián)抗原各作100倍稀釋，以100微升分別加入做好標(biāo)記的酶聯(lián)板孔中，置濕盒于4過夜。2棄去孔內(nèi)液體。用洗滌液沖洗酶聯(lián)板3次，每次間隔35分鐘，拍干。3用稀釋液將待檢血清作400倍稀釋，每孔加100微升。同時，將豬瘟陽性、陰性血清以100稀釋作對照，37培育1.52小時。4重復(fù)第2步。5用稀釋液將兔抗豬IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物作100倍稀釋，每孔加入100微升，37培育1.52小時。6重復(fù)第2步。 7每孔

6、加入底物溶液（每塊板所需的底物溶液按鄰苯二胺5毫克+底物緩沖液5毫升+30%過氧化氫18.75微升配制）100微升，室溫下觀察顯色反應(yīng)（一般陰性對照孔略微顯色，立即終止反應(yīng)，并以陰性孔作空白調(diào)零）。8 每孔加入終止液50微升，于酶聯(lián)讀數(shù)儀上測定490nm波長的光密度（OD）。（三）判定標(biāo)準(zhǔn)在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上：OD>0.2為豬瘟弱毒抗體陽性 OD<0.2為豬瘟弱毒抗體陰性在豬瘟強(qiáng)毒酶聯(lián)板上：OD0.5為豬瘟強(qiáng)毒抗體陽性 OD<0.5為豬瘟強(qiáng)毒抗體陰性（四）注意事項 1運(yùn)輸單抗純化酶聯(lián)抗原時，必須使用冰盒低溫運(yùn)輸；豬瘟強(qiáng)弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原在4保存6個月，在18保存12個月。 2

7、配制洗滌液時，應(yīng)使用新鮮蒸餾水或無離子水，每次洗板后，盡量不使孔中有殘余液體，以免影響結(jié)果。 3底物溶液應(yīng)臨用前配制，待鄰苯二胺完全溶解于底物緩沖液后再加過氧化氫，混勻后立即加入孔中。1 終止反應(yīng)后，應(yīng)立即讀數(shù)。(中國獸藥監(jiān)察所)豬瘟反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)1材料準(zhǔn)備：待檢組織，勻漿器、氯仿、異丙醇、75%乙醇、生理鹽水，RNA提取試劑盒（Omega），RT-PCR試劑盒（TakaRa）等。引物：擴(kuò)增豬瘟病毒E2基因中585bp基因片段，由上海生物工程公司合成。序列為：上游引物P1：5CCTGCAAGGAAGATCACACG3 下游引物P2：5CCGTGTAGGTCACTGGTTCA3儀器設(shè)備為：PCR擴(kuò)增儀，電泳儀，凝膠電泳紫外檢測儀。2操作步驟21 樣品采集：動物病死或撲殺后，取扁桃體、淋巴結(jié)和脾組織，-20冷藏。22 樣品處理：所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5生理鹽水收集于離心管內(nèi)，-70反復(fù)凍融三次，7000r/min，離心5分鐘，取上清液。23 RNA提?。阂勒誒mega公司RNA提取試劑盒的操作程序提取總RNA。24 RT-PCR操作程序：依照TakaRa公司的一步法RNA PCR試劑盒操作程序進(jìn)行。擴(kuò)增條件為：50，反轉(zhuǎn)錄