高分辨溶解(HRM)分析課件

1、第二課第二課 高分辨溶解（高分辨溶解（HRM）分析）分析 l高分辨率熔解（High-resolution melting，簡稱HRM）分析是一門新興的技術(shù)。它僅僅通過PCR之后的熔解曲線分析，就能檢測PCR片段的微小序列差異，從而應(yīng)用在突變掃描、序列配對和基因分型等多個方面一、原理一、原理 PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列。序列中如有一個堿基發(fā)生了突變，都會改變DNA鏈的解鏈溫度。但是這個差異極小，只有零點幾攝氏度，如果儀器的分辨率不高，是根本無法檢測的。 HRM分析采用高精密儀器，在擁有飽和染料和高分辨率儀器之后，對 PCR的擴增子進行加熱，溫度從50C逐漸上升到95C。在此

2、過程中，擴增子逐漸解鏈，在到達熔解溫度（Tm）時，DNA鏈分開，熒光強度迅速降低。在HRM分析的初期，熒光強度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強度也就下降了。HRM儀器通過照相機，記錄下熒光變化的整個過程。通過對數(shù)據(jù)的作圖，就生成了熔解曲線。l雙鏈DNA的熔解分析可追溯到上世紀六十年代，當(dāng)時是通過紫外吸收來監(jiān)測的。分析需要幾微克的DNA，而樣品以0.1-1.0C/分鐘的速率緩慢加熱，常常要花上幾個小時才能完成。后來，LightCycler定量PCR儀的出現(xiàn)，讓熒光熔解分析變得流行。樣品量因毛細管而縮減至納克級，且熔解速率更快，達0.1-1.0C/秒，這樣熔解時間縮短至幾分鐘。當(dāng)時使

3、用的染料是SYBR Green I。l雙鏈DNA的熔解分析可追溯到上世紀六十年代，當(dāng)時是通過紫外吸收來監(jiān)測的。分析需要幾微克的DNA，而樣品以0.1-1.0C/分鐘的速率緩慢加熱，常常要花上幾個小時才能完成。后來，LightCycler定量PCR儀的出現(xiàn)，讓熒光熔解分析變得流行。樣品量因毛細管而縮減至納克級，且熔解速率更快，達0.1-1.0C/秒，這樣熔解時間縮短至幾分鐘。當(dāng)時使用的染料是SYBR Green I。 但是當(dāng)時這種熔解分析只能區(qū)分在片段大小和GC含量上差別較顯著的DNA序列，比如檢查PCR擴增產(chǎn)物中是否存在引物二聚體及其他非特異性的擴增。如果要區(qū)分SNP，分辨率還不夠。飽和染料和

4、非飽和染料飽和染料和非飽和染料非飽和染料非飽和染料 對PCR有抑制作用，在實驗中的使用濃度很低，遠未將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫變性時，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生重排，熒光染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位點，造成熒光信號沒有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降飽和染料飽和染料 對對PCR沒有影響，高濃度的染料飽和了沒有影響，高濃度的染料飽和了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在DNA解鏈過程中就解鏈過程中就不會發(fā)生重排，這樣熔解曲線才有了更高的分不會發(fā)生重排，這樣熔解曲線才有了更高的分辨率。目前市場上的飽和染料主要有辨率。目前市場上的飽和染料主要有LC G

5、reen、LC Green Plus、SYTO 9等幾種等幾種HRM分析儀分析儀 目前市場上有多個廠家提供HRM分析的儀器，包括Idaho Technology、Corbett（QIAGEN）、Roche等，有些是專供HRM的儀器，有些則是附帶HRM功能的定量PCR儀 HRM的發(fā)明者美國猶他大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Wittwer實驗室曾評估了市場上多臺儀器在基因分型和突變掃描上的性能。他們發(fā)現(xiàn)，對于大部分儀器的準(zhǔn)確基因分型來說，主要限制在于平板上的空間溫度差異（Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020-0.264C）。其它差異如數(shù)據(jù)密度、信噪比和熔解速率，也會影響雜合體的掃描。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，空氣加熱型儀器以及樣品溫度單

6、獨控制的儀器有著更低的Tm標(biāo)準(zhǔn)偏差（0.018-0.065），而加熱塊型儀器則在0.092-0.274。 HR-1lHR-1儀器是美國Idaho公司采用精確溫度控制技術(shù)，并結(jié)合高速的數(shù)據(jù)采集技術(shù)，配合使用高分辨的飽和LC Green熒光染料，使該儀器具有較高的靈敏度和特異性。分析時不消耗被測PCR產(chǎn)物樣品，分析結(jié)束后PCR產(chǎn)物可用于下游的分析，如測序等。HR-1特點： 升溫速率： 0.01 -1 / 秒 數(shù)據(jù)采集密度： 100 個數(shù)據(jù) / 使用 LC Green 熒光染料 反應(yīng)體系 5-20ul 分析時間： 40-45 樣品 / 小時（基于 0.3 / 秒升溫速率）HRM 的應(yīng)用領(lǐng)域的應(yīng)用領(lǐng)域

7、1 、基因的突變掃描：檢測雜合子、基因的突變掃描：檢測雜合子 SNP 、區(qū)段、區(qū)段 / 堿基缺堿基缺失、前后重復(fù)、雜合子缺失。失、前后重復(fù)、雜合子缺失。 相關(guān)研究方向： 1 ） 樣本中特定突變位點（ SNP ）的篩查，包括一個片段中多個位點的復(fù)合雜合突變的Genotyping。 2 ） 疾病相關(guān)基因（癌基因）特定區(qū)段突變位點的掃描，新突變的發(fā)現(xiàn)。 3 ） 遺傳育種中特定突變的篩查、未知突變的發(fā)現(xiàn)。 4 ） 植物抗逆性，突變與性狀關(guān)聯(lián)性的研究。 5 ） 動植物品質(zhì)相關(guān)多態(tài)性位點的研究等。2、HLA(人類白細胞抗原人類白細胞抗原 ) 基因組配型基因組配型 器官移植的 HLA 配型、同胞之間 HLA

8、 基因型確定，如快速確定 HLA 高度多態(tài)性位點的類型，及非親源關(guān)系個體間異源造血干細胞移植前的 HLA 基因型確認 。 3 、等位基因頻率分析、等位基因頻率分析 4 、物種鑒定、品種鑒定、物種鑒定、品種鑒定 1 ） 微生物品種、物種快速鑒定。 2 ） 動植物品種鑒定。 5 、甲基化研究、甲基化研究 1 甲基化位點的篩查。 2 甲基化程度分析。 用 HRM 方法檢測啟動子區(qū)域內(nèi)的甲基化，可檢測低達 0.1% 的甲基化程度；并根據(jù)已知甲基化程度的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品的甲基化百分比進行測定。 HRM 是一種高靈敏度的甲基化檢測方法，并且其高度的重復(fù)性和低成本將對腫瘤的研究和臨床應(yīng)用有很大幫助。 6 法醫(yī)學(xué)鑒定、親子鑒定。法