微生物的保存技術(shù)

1、第14 章 微生物的保存技術(shù)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究的需要促進(jìn)了微生物保存技術(shù)的發(fā)展。例如，當(dāng)發(fā)現(xiàn)微生物就是某些傳染性疾病的特殊病原時(shí)，為發(fā)展疫苗、抗生素和化學(xué)藥品，人們需要分離、鑒定和保存微生物。農(nóng)業(yè)上最明顯的例子就是對(duì)固氮菌的研究，關(guān)于工業(yè)應(yīng)用微生物的例子更是不勝枚舉。微生物發(fā)酵還提供了大量的食品、飲料和藥品。在分子生物學(xué)研究中，用先進(jìn)的DNA 重組技術(shù)可以修飾微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基礎(chǔ)。微生物是重要的生物資源，保存微生物的目的，不僅使微生物菌株以活的生命狀態(tài)保存下來，并使其遺傳性狀從分離時(shí)或從實(shí)驗(yàn)開始就一直保持不變。這也是保護(hù)微生物多樣性的重要

2、手段，還使后人能更好地應(yīng)用先進(jìn)技術(shù)開發(fā)和運(yùn)用微生物，為人類造福。為此，世界各發(fā)達(dá)國家都設(shè)有專門的菌種保藏機(jī)構(gòu)。如美國的典型菌種保藏中心（ATCC），英國的國家典型菌種保藏所（NCTC），日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO）等。我國也設(shè)有中國微生物菌種保藏委員會(huì)（CCCCM）。微生物的保存方法很多，根據(jù)不同的微生物菌（毒）株或不同的實(shí)驗(yàn)要求，可選用不同的保存方法。這些保存方法的原理大同小異。首先要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，再創(chuàng)造一個(gè)適合其長期休眠的環(huán)境條件，諸如低溫、干燥、缺氧、避光、缺少營養(yǎng)等，使被保存的微生物減少代謝率及繁殖和利用營養(yǎng)的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有減少代

3、謝率的方法都會(huì)導(dǎo)致一定比率的活力下降。為了防止菌株的丟失，還需要開發(fā)出不僅能減少代謝率，而且能防止活力下降的方法。與保存技術(shù)有關(guān)、但較為費(fèi)時(shí)的另一項(xiàng)關(guān)鍵性工作是檔案記錄（Halliday，Baker1985）。這一工作不僅包括菌種或毒株的培養(yǎng)史和診斷特征等方面的準(zhǔn)確記錄，還包括對(duì)保存物的定期復(fù)蘇和培養(yǎng)記錄，以確定其活力、驗(yàn)證其純度及基因的穩(wěn)定性。最常用的微生物保存法有凍干保存法和超低溫凍存法（Gherna 1981；Halliday，Baker1985；Malik 1990；Rudge 1991）。這兩種方法均可保存相當(dāng)長的時(shí)期（通?？砷L達(dá)30 年）。其他保存微生物的方法還有：低溫保存法、傳代

4、培養(yǎng)保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。14.1 細(xì)菌的凍干保存法14.1.1 一般概念凍干是目前最常用的微生物保存技術(shù)（Day，Mclellan 1995）。美國ATCC 在1985 年第16版細(xì)菌、噬菌體和rDNA 載體目錄冊(cè)及1987 年第17 版真菌酵母目錄冊(cè)中，記載有11 000 株細(xì)菌、噬菌體和rDNA 載體及 21 000 株真菌、酵母用凍干法保存（Gherna 等本章作者：田保平，韋劍珊，俞乃勝170 遺傳多樣性研究的原理與方法1981；Jong 等 1987）。凍干法是長期保存細(xì)菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏體的標(biāo)準(zhǔn)方法（Franks 1985；Berny 等 1

5、991；Smith1993；Day，Mclellan 1995）：將在理想條件下生長的健康的微生物細(xì)胞以相當(dāng)高的濃度（106107 個(gè)細(xì)胞ml）分裝在小滅菌瓶或安瓿內(nèi)，迅速將這些小瓶在極低溫度的液體溶劑內(nèi)水浴或用儀器超低溫冷凍（60），再用真空泵除去這些冷凍懸浮液中的水分，在真空狀態(tài)下用空氣噴燈熔解小瓶頂部的玻璃進(jìn)行熱封口，然后貯存于低于5的冰箱內(nèi)。保存溫度低（3 07 0）可以延長其活力。當(dāng)微生物濃度較高時(shí)，生存率高，保存期也長。長期保存時(shí)，貯藏溫度越低則越好。在凍干前一般要加冷凍保護(hù)劑，這樣可使細(xì)胞免除在冷凍初期因形成冰晶而造成的損害。ATCC 常規(guī)用10脫脂奶或12蔗糖作為冷凍保護(hù)劑，而

6、美國農(nóng)業(yè)部（USDA）的農(nóng)業(yè)研究服務(wù)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)人員用?；蝰R血清作為微生物的冷凍保護(hù)劑（Halliday，Baker 1985）。在菌液中加入甘油和二甲亞砜（DMSO）也可防止冷凍中微生物的死亡，但實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)不同微生物決定應(yīng)用或不用防凍劑。凍干細(xì)胞的復(fù)蘇很簡單。只要在室溫下打開安瓿，將少量液體營養(yǎng)培養(yǎng)基加入細(xì)胞中，再將重新水合的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有益于生長的培養(yǎng)基的容器內(nèi)即可。用于凍干的實(shí)驗(yàn)設(shè)施成本為 2.5 萬美元（Colwell 1986），但準(zhǔn)備凍干培養(yǎng)物的實(shí)際花銷不高。用凍干法保存的細(xì)胞其長期活力很好，這種方法也許是目前所使用的微生物保存法中效果較好和最經(jīng)濟(jì)的方法（Halliday，Ba

7、ker 1985）。但有的微生物不適宜應(yīng)用該技術(shù)，如病原微生物在凍干過程中往往由于細(xì)胞飛濺而發(fā)生污染或感染事故，所以，對(duì)于某些病原微生物還必須使用其他的貯存方法保存。14.1.2 材料（1）冷凍保護(hù)液（肌醇血清營養(yǎng)肉湯）：肌醇（Sigma，Poole，Dorset，UK） 6.67g營養(yǎng)肉湯粉（Unipath，Basingstoke，Hampshire，UK） 0.825g蒸餾水 33.3ml將上述物質(zhì)置于一個(gè)250ml 的三角燒瓶內(nèi)溶解和混合均勻后，用120高溫滅菌15 分鐘，冷卻后在無菌條件下加滅菌馬血清（Advanced Protein Product Ltd）100ml，混勻后，分裝于

8、 5ml小瓶內(nèi)。分裝好的小瓶在30下培養(yǎng)23 天，確定無菌后置30下保存，臨用前解凍。（2）冷凍管：外徑 16mm、長 36mm 的硼硅中性玻璃小管（Schubert Seals，N1595，Gosport，Hampshire，UK），使用前要經(jīng)160滅菌2 小時(shí)。（3）塞子（Type 20133A，Schubert Seals），使用前要加熱除去水分（單層放入不銹鋼托盤中，置入110 熱風(fēng)干燥箱中加熱2 小時(shí)）。（4）凍干儀（Edwards Freeze-dryer，Modulyo，Crawley，Sussex，UK）。（5）滅菌塑料加樣頭（Alpha Laboratories，Ltd，Ea

9、stleigh，Hamp-shire，UK）。（6）鋁制封口蓋。1413 方法（1）先用清洗劑（Flow Laboratories，Thame，Oxfordshire，UK，7 倍無磷實(shí)驗(yàn)室用清洗劑）清洗玻璃珠，然后用0 . 1 m o ld m 3 H C l 中和玻璃珠上的堿性，反復(fù)用自來水沖洗至珠子第14 章 微生物的保存技術(shù) 171的PH 值與自來水的pH 值相同為止，再用蒸餾水或去離子水清洗，最后置熱風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥。（2）用非選擇性固體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)瓊脂或血瓊脂）在理想的條件下培養(yǎng)（一般用有螺紋蓋的20ml 管裝的斜面培養(yǎng)基，將減少污染的機(jī)會(huì)）。（3）無菌條件下加 2ml 冷凍保護(hù)液

10、到瓊脂斜面內(nèi)。（4）將細(xì)菌與保護(hù)液充分混勻，這時(shí)的細(xì)菌濃度為1081010 個(gè)細(xì)胞ml。（5）將混勻后的細(xì)菌懸液移入剩余的3ml 保護(hù)液內(nèi)再次混勻（操作時(shí)要避免產(chǎn)生氣溶膠，尤其是操作病原菌時(shí)）。（6）吸0.5ml 混勻液，加到預(yù)先標(biāo)記好的冷凍管底部，操作時(shí)要特別小心，不要使液體漏到冷凍管外壁，以免造成污染。將塞子塞入冷凍管（但不要塞緊，以便在冷凍干燥儀中抽真空）。（7）將冷凍管放入金屬半圓支架上，置入30冰箱內(nèi)冷凍2 小時(shí)，同時(shí)將充填物（玻璃珠，2030 粒管）預(yù)冷至30，以免將盛有冷凍管的架子移入時(shí)冷凍管內(nèi)的內(nèi)容物解凍。（8）打開凍干儀的冷凝器開關(guān)，關(guān)閉冷凝器的排水閥。當(dāng)冷凝器的溫度降至50

11、時(shí)，迅速將充填裝置和冷凍管放入凍干室。然后關(guān)閉空氣閥抽真空。20 分鐘后要求真空室的壓力到300Pa。要讓凍干儀運(yùn)行124 小時(shí)，以便樣品完全干燥。（9）上述工作結(jié)束時(shí)，在真空條件下轉(zhuǎn)動(dòng)螺旋起重器，以終止運(yùn)行。（10）用高頻火花檢測器（Edwards High Vacuum）檢測冷凝管干燥器和放置期間是否維持真空環(huán)境。冷凝器內(nèi)發(fā)淺藍(lán)色或紫色光表示完全真空，深紫色或不發(fā)光表示非完全真空。（11）用鋁蓋密封冷凍管上的塞子。（12）小心移去鋁蓋和拔出塞子，使細(xì)菌復(fù)蘇。（13）加約0.5ml 營養(yǎng)肉湯到冷凍管內(nèi)，與凍干的細(xì)菌混勻，再將該肉湯接種到肉湯培養(yǎng)基中，并在理想的條件下培養(yǎng)。（14）移少量（0.

12、1ml）解凍后的菌到營養(yǎng)瓊脂板上，檢測任何可能的污染。14.2 病毒的超低溫保存法14.2.1 一般概念大多數(shù)微生物可用超低溫保存，超低溫保存法是適用范圍最廣的微生物保存法。需要復(fù)雜營養(yǎng)的微生物種，如用其他的貯存方法不能保持其活力（ 如植物的病原性真菌），通?？捎贸蜏氐姆椒ū４妫ˋTCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是將凍存在小管或安瓿里的細(xì)胞以較慢的冷凍速率（1分鐘）冷凍，直至150，再將這些小管貯存在150196的液氮中。超低溫的冷凍保護(hù)劑不同于凍干法所用的冷凍劑。ATCC 常用一種由甘油（10）、二甲亞砜（5）和培養(yǎng)液制成的混合劑保存多數(shù)的細(xì)胞株。這些化學(xué)試

13、劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)可避免內(nèi)膜的冷凍損傷。貯存在低溫容器內(nèi)的細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)必須小心操作。當(dāng)小管被加熱時(shí)，所形成的冰晶會(huì)將細(xì)胞殺死，正確操作就可避免這種事故。只要迅速將樣品解凍就能減少活力的丟失，做法是：將封口的小管迅速放入37的水中，直至所有的冰融化，然后打開管口，將內(nèi)容物移入培養(yǎng)基。172 遺傳多樣性研究的原理與方法超低溫保藏的微生物必須始終貯存在溫度非常低的環(huán)境中，因此需要液氮罐。在長期貯存的過程中必須經(jīng)常注意補(bǔ)充液氮。這種貯存方式比凍干法需要更多的經(jīng)費(fèi)，包括為了維持貯存溫度所必要的勞動(dòng)力和液氮等。14.2.2 材料病毒超低溫保存所需材料有：熱收縮塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防護(hù)手套

14、和面罩，永久性記號(hào)筆，氣體噴燈，裝液氮的保溫瓶。14.2.3 方法（1）剪一段兩端各超出冷凍管長度2cm 的熱收縮塑料管。（2）將含有澄清病毒懸液（組織培養(yǎng)的上清培養(yǎng)基，或組織培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物均可）冰浴幾分鐘，用滅菌移液管將0.2ml 冰浴過的上清懸液分裝到冷凍管內(nèi)，并將蓋子擰緊。（3）將有病毒的冷凍管放入熱收縮塑料管中部，插入正確的標(biāo)簽。（4）用噴燈小心加熱熱收縮塑料管，并使之包住冷凍管。注意不要用太高的溫度加熱熱收縮塑料管。（5）再小心加熱熱收縮塑料管的兩端，用大號(hào)鑷子夾緊管的端口至完全密封。（6）將密封好的冷凍管快速在裝有液氮的保溫瓶中冷凍（操作時(shí)要求戴面罩和手套）。（7）將冷凍過

15、的冷凍管放入液氮罐中的格子內(nèi)，同時(shí)記錄樣品的詳細(xì)的存放位置、實(shí)驗(yàn)編號(hào)和存放日期等。（8）需要用時(shí)，迅速從液氮罐內(nèi)取出所需樣品，并投入37水浴箱中解凍后，用解剖刀片在冷凍管的硅化墊圈處切開熱收縮塑料管。擰開冷凍管的蓋子時(shí)不需要除去熱收縮塑料管。14.3 低溫保存法14.3.1 材料（1）培養(yǎng)基：2 號(hào)營養(yǎng)肉湯粉（Unipath） 2.5g甘油（Sigma） 15ml蒸餾水 85ml將上述材料混勻后，分裝在5ml 瓶內(nèi)，在121下滅菌15 分鐘。（2）厭氧菌用 BGP 培養(yǎng)基其中不加瓊脂，而加 15（體積比）甘油：胰蛋白胨（Unipath） 1.0g氯化鈉 0.5g牛肉提取物 0.3g酵母提取物

16、0.5g鹽酸半胱氨酸 0.04g葡萄糖 0.1g磷酸氫二鈉 0.4g第14 章 微生物的保存技術(shù) 173甘油 15ml蒸餾水 85ml將上述材料混勻后，分裝在 10ml 瓶內(nèi)，在 121下消毒 15 分鐘。以上兩種培養(yǎng)基使用前均能在4環(huán)境中存放幾個(gè)月。（ 3 ） 玻璃珠： 將直徑為2mm 的玻璃珠（ Creative Beadcraft Ltd ； mersham ，Buckinghamshire，UK）按上述凍干法中的清洗法清洗。（4）冷凍管：在2ml 有蓋冷凍管（Nunc，Paisley，Scotland）內(nèi)存放2030 粒清洗好的玻璃珠，蓋好蓋后置121下消毒15 分鐘。消毒過的冷凍管可

17、在室溫下保存。此外，將超低溫冰箱預(yù)先冷卻到70，滅菌塑料加樣頭。14.3.2 方法（1）用非選擇性固體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)瓊脂或血瓊脂）在適宜細(xì)菌生長的條件下培養(yǎng)細(xì)菌。（2）無菌條件下加2ml 細(xì)菌懸浮液至營養(yǎng)肉湯中。（3）用一支無菌的塑料環(huán)將細(xì)菌和肉湯混勻（細(xì)菌的最終濃度為1081010 個(gè)細(xì)胞ml）。（4）按凍干法在無菌條件下將細(xì)菌分裝到有滅菌玻璃珠的冷凍管內(nèi)，反復(fù)吹打幾次，使珠子內(nèi)部的氣泡完全被細(xì)菌懸浮液所替代。（5）吸去冷凍管內(nèi)多余的液體。（6）將混有細(xì)菌和珠子的冷凍管放在架子（Jencons Scientific Ltd，Leighton，Buzzard，Bedfordshire，UK）上

18、，然后將架子放入70的冰柜內(nèi)。（7）從冰柜中取出一支冷凍管，在無菌條件下打開，用滅菌鑷子從管中取出一粒珠子，然后迅速將管子放回冰柜，以免管子內(nèi)的其余珠子融解。（8）直接將珠子接種到固體培養(yǎng)基上或液體培養(yǎng)基中，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)。14.4 傳代培養(yǎng)保存法盡管與上述方法相比，用傳代培養(yǎng)保存法保存微生物的時(shí)間較短，且會(huì)使微生物在反復(fù)傳代和適應(yīng)的過程中發(fā)生變異，但由于其簡便易行，加之一些不耐冷凍和干燥處理的微生物還需要用該法保存，所以，傳代培養(yǎng)保存法是所有使用微生物的單位都要采用的基本保存法。目前必須依靠傳代培養(yǎng)保存的微生物仍為數(shù)眾多。傳代培養(yǎng)保存法主要是保存生活態(tài)的微生物，它又分為連續(xù)用培養(yǎng)基傳代和

19、連續(xù)用活宿主傳代。斜面保存法和礦物油保存法是傳代培養(yǎng)保存的兩種最常用的方法。14.4.1 斜面保存法斜面保存法是傳代培養(yǎng)保存法的具體方法，其優(yōu)點(diǎn)是簡便，易于推廣。但用該法保存微生物的時(shí)間不太長。由于在具體操作時(shí)需要多次傳代，加之斜面培養(yǎng)基中又保持了一定的營養(yǎng)條件，因此，用這種方法保存的微生物還易產(chǎn)生變異。使用該方法保存微生物時(shí)，可將菌種接種在不同成分的斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至菌種充分生長后，放4冰箱中保存。每隔一定時(shí)間進(jìn)行接種培養(yǎng)后再行保存，如此連續(xù)不斷。一般細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌均可用此法保存。174 遺傳多樣性研究的原理與方法14.4.2 礦物油保存法礦物油保存法是傳代培養(yǎng)保存法的變相方法，也較簡單，且保存時(shí)間可達(dá)1 年以上。礦物油保存法，即是將接種在斜面培養(yǎng)基的細(xì)菌經(jīng)過培養(yǎng)后，加入滅菌的石蠟油并浸蓋住整個(gè)斜面（ 覆蓋的深度為2cm ），使之與空氣隔絕，以降低微生物的代謝率（ Gherna1981），再將浸蓋有石蠟油的斜面培養(yǎng)菌種置于約4或室溫保存即可。復(fù)蘇的方法與常規(guī)再培養(yǎng)的方法類似。盡管這種方法可使保存的細(xì)菌3 年內(nèi)不死，但不適于微生物的長期保存，因?yàn)槊扛魩啄昃捅仨殢?fù)蘇、鑒定和再貯存，從而耗費(fèi)人力和物力。霉菌、酵母菌和放線菌可用該法保存，一些不適于冷凍干燥的微生物用該法保存也有效。14.5 砂