綜合化學實驗化學生物學實驗一四 ppt課件

1、綜合化學實驗綜合化學實驗- -化學生物化學生物學實驗一、四學實驗一、四多酚氧化酶的粗提、蛋白質(zhì)含量、催多酚氧化酶的粗提、蛋白質(zhì)含量、催化活性測定及電泳分析化活性測定及電泳分析 一、實驗目的一、實驗目的 在化學生物學研討中，蛋白質(zhì)及酶是其重要的在化學生物學研討中，蛋白質(zhì)及酶是其重要的研討目的，特別是設計合成酶的抑制劑或激活研討目的，特別是設計合成酶的抑制劑或激活劑，活性測定一定需求純的酶制劑。劑，活性測定一定需求純的酶制劑。 另外在化學遺傳學或化學蛋白質(zhì)組學研討中，另外在化學遺傳學或化學蛋白質(zhì)組學研討中，當發(fā)現(xiàn)某一種小分子化合物在細胞生化途徑中當發(fā)現(xiàn)某一種小分子化合物在細胞生化途徑中起作用后，也

2、需求將可以與小分子化合物結(jié)合起作用后，也需求將可以與小分子化合物結(jié)合的蛋白質(zhì)分別提取出來，再經(jīng)過多種方法進展的蛋白質(zhì)分別提取出來，再經(jīng)過多種方法進展鑒定。鑒定。 所以，蛋白質(zhì)和酶的分別純化及電泳分析等是所以，蛋白質(zhì)和酶的分別純化及電泳分析等是化學生物學研討中一個極其重要的技術(shù)?；瘜W生物學研討中一個極其重要的技術(shù)。 本實驗選取馬鈴薯、番薯、蘑菇、茄子為實驗本實驗選取馬鈴薯、番薯、蘑菇、茄子為實驗資料，經(jīng)過組織細胞破碎勻漿、過濾、離心、資料，經(jīng)過組織細胞破碎勻漿、過濾、離心、硫酸銨沉淀等步驟獲得多酚氧化酶的粗酶液，硫酸銨沉淀等步驟獲得多酚氧化酶的粗酶液，對粗酶催化鄰苯二酚、對粗酶催化鄰苯二酚、L-

3、L-多巴的活性以及同工多巴的活性以及同工酶、分子量等進展測試。酶、分子量等進展測試。 經(jīng)過本項實驗，學習和了解蛋白質(zhì)的提取、分經(jīng)過本項實驗，學習和了解蛋白質(zhì)的提取、分別的根本原理和方法，掌握蛋白質(zhì)含量測定方別的根本原理和方法，掌握蛋白質(zhì)含量測定方法、多酚氧化酶活性的測定方法，電泳技術(shù)測法、多酚氧化酶活性的測定方法，電泳技術(shù)測定同工酶和分子量的方法，掌握相關(guān)儀器設備定同工酶和分子量的方法，掌握相關(guān)儀器設備的操作運用。的操作運用。 所提取的粗酶樣品可作為實驗三、實驗四、實所提取的粗酶樣品可作為實驗三、實驗四、實驗五、實驗六的資料。驗五、實驗六的資料。 一多酚氧化酶一多酚氧化酶 多酚氧化酶多酚氧化酶

4、(polyphenoloxidase(polyphenoloxidase，PPOPPO，EC.1.10.3.1)EC.1.10.3.1)是是植物體內(nèi)普遍存在的一類銅結(jié)合酶。它早在植物體內(nèi)普遍存在的一類銅結(jié)合酶。它早在18951895年就被年就被發(fā)現(xiàn)，直至發(fā)現(xiàn)，直至19371937年才被分別得到。隨著研討的深化，它年才被分別得到。隨著研討的深化，它被分為單酚單氧化酶被分為單酚單氧化酶( (酪氨酸酶，酪氨酸酶，EC.1.14.18.1)EC.1.14.18.1)、雙酚、雙酚氧化酶氧化酶( (兒茶酚氧化酶，兒茶酚氧化酶，EC.1.10.3.2)EC.1.10.3.2)和漆酶和漆酶(EC.1. (EC

5、.1. 10.3.1)10.3.1)。如今所說的多酚氧化酶普通是兒茶酚氧化酶和。如今所說的多酚氧化酶普通是兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱。漆酶的統(tǒng)稱。 PPOPPO通常是一種由通常是一種由4 4個亞基組成的寡聚蛋白質(zhì)，如薯蕷皂個亞基組成的寡聚蛋白質(zhì)，如薯蕷皂小球莖小球莖PPOPPO和萵苣的和萵苣的PPOPPO；但大白菜、香草中；但大白菜、香草中PPOPPO那么是由那么是由3 3個亞基聚合構(gòu)成；蘑菇的兒茶酚氧化酶那么是一種多聚個亞基聚合構(gòu)成；蘑菇的兒茶酚氧化酶那么是一種多聚酶，分重鏈酶，分重鏈(43 kD)(43 kD)和輕鏈和輕鏈(13.4 kD)(13.4 kD)。香蕉果肉中的。香蕉果肉中的PPO

6、PPO卻是單體酶。不同種植物、同一植物體的不同部位及同卻是單體酶。不同種植物、同一植物體的不同部位及同一部位的一部位的PPOPPO多基因家族的不同成員的分子量不同。多基因家族的不同成員的分子量不同。PPOPPO前體約前體約60-71 kD60-71 kD，成熟，成熟PPOPPO約約40-68 kD40-68 kD。 比較知的十幾種植物，有菠菜、梨、桃、蠶豆、胡蘿卜、比較知的十幾種植物，有菠菜、梨、桃、蠶豆、胡蘿卜、馬鈴薯、番茄、葡萄和蘋果，發(fā)現(xiàn)它們的馬鈴薯、番茄、葡萄和蘋果，發(fā)現(xiàn)它們的PPOPPO具有高度具有高度的類似性的類似性(45%-95%)(45%-95%)。整個氨基酸序列中，。整個氨基

7、酸序列中，N-N-導肽與導肽與C-C-端保守性較低，而端保守性較低，而CuACuA與與CuBCuB很保守很保守. PPO. PPO由多個基因編由多個基因編碼，表現(xiàn)出多基因家族性，少那么碼，表現(xiàn)出多基因家族性，少那么2 2或或3 3個，多那么個，多那么6 6或或7 7個基因。但有的植物，如葡萄只需個基因。但有的植物，如葡萄只需1 1個個PPOPPO基因。基因。 多酚氧化酶與植物組織培育的酶促褐變以及果蔬質(zhì)量親多酚氧化酶與植物組織培育的酶促褐變以及果蔬質(zhì)量親密相關(guān)。因此，研討多酚氧化酶酪氨酸酶的抑制，密相關(guān)。因此，研討多酚氧化酶酪氨酸酶的抑制，對防止水果、蔬菜的褐變，化裝品中的皮膚增白，以及對防止

8、水果、蔬菜的褐變，化裝品中的皮膚增白，以及因酪氨酸酶催化產(chǎn)生黑色素引起的疾病黃褐斑等色素因酪氨酸酶催化產(chǎn)生黑色素引起的疾病黃褐斑等色素冷靜性皮膚病等，具有非常重要的治療意義。由此，冷靜性皮膚病等，具有非常重要的治療意義。由此，人們利用酪氨酸酶在生物和化學的催化特性以及相對應人們利用酪氨酸酶在生物和化學的催化特性以及相對應的酪氨酸酶抑制劑，開發(fā)了它在食品、美容、環(huán)境、醫(yī)的酪氨酸酶抑制劑，開發(fā)了它在食品、美容、環(huán)境、醫(yī)藥和化學上的運用。藥和化學上的運用。二考馬斯亮蘭法二考馬斯亮蘭法BradfordBradford法法測定蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量 雙縮脲法雙縮脲法BiuretBiuret法和法和Fo

9、linFolin酚試劑法酚試劑法LowryLowry法的明法的明顯缺陷和許多限制，促使科學家們?nèi)ひ捀玫牡鞍踪|(zhì)溶液顯缺陷和許多限制，促使科學家們?nèi)ひ捀玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。測定的方法。 19761976年由年由BradfordBradford建立的考馬斯亮蘭法建立的考馬斯亮蘭法BradfordBradford法，是法，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設計的。這種蛋白質(zhì)測定法根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超越其他幾種方法的突出優(yōu)點，因此正在得到廣泛的運具有超越其他幾種方法的突出優(yōu)點，因此正在得到廣泛的運用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。用。這一方法是目前

10、靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。 考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭G-250G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由料的最大吸收峰的位置，由465nm465nm變?yōu)樽優(yōu)?95nm595nm，溶液的顏色也，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研討以為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研討以為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸特別是精氨酸和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。堿性氨基酸特別是精氨酸和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在在595nm595nm下測定的吸光度值下測定的吸光度值A(chǔ)595A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。，與蛋白質(zhì)濃度成正比。BradfordBr

11、adford法的突出優(yōu)點法的突出優(yōu)點 1 1靈敏度高，據(jù)估計比靈敏度高，據(jù)估計比LowryLowry法約高四倍，其最低蛋白法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢丈量可達質(zhì)檢丈量可達1mg1mg。這是由于蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的。這是由于蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復合物有更高的消光系數(shù)，顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復合物有更高的消光系數(shù)，因此光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比因此光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比LowryLowry法要大的多。法要大的多。 2 2測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需求的測定，只需求5 5分鐘左右。由于染料

12、與蛋白質(zhì)結(jié)合的過分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只需程，大約只需2 2分鐘即可完成，其顏色可以在分鐘即可完成，其顏色可以在1 1小時內(nèi)堅持小時內(nèi)堅持穩(wěn)定，且在穩(wěn)定，且在5 5分鐘至分鐘至2020分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因此完全不用像此完全不用像LowryLowry法那樣費時和嚴厲地控制時間。法那樣費時和嚴厲地控制時間。 3 3干擾物質(zhì)少。如干擾干擾物質(zhì)少。如干擾LowryLowry法的法的K+K+、Na+Na+、Mg2+Mg2+離子、離子、TrisTris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTAEDTA等均不干等均

13、不干擾此測定法。擾此測定法。三多酚氧化酶催化活性測試三多酚氧化酶催化活性測試 酪氨酸酶的單酚酶活性，普通發(fā)生在黑色素合成途徑的酪氨酸酶的單酚酶活性，普通發(fā)生在黑色素合成途徑的第一步，即單酚羥化構(gòu)成鄰二酚。由于在酶催化反響中，第一步，即單酚羥化構(gòu)成鄰二酚。由于在酶催化反響中，產(chǎn)生的鄰二酚進一步被氧化成為鄰醌，所以許多研討把產(chǎn)生的鄰二酚進一步被氧化成為鄰醌，所以許多研討把單酚酶活性定義為完全把單酚轉(zhuǎn)化為鄰醌。這種活性可單酚酶活性定義為完全把單酚轉(zhuǎn)化為鄰醌。這種活性可以區(qū)分酪氨酸酶和其它的酚氧化酶，如漆酶和過氧化物以區(qū)分酪氨酸酶和其它的酚氧化酶，如漆酶和過氧化物酶。酶。 在自然界的各種生物體內(nèi)，含有

14、許多種類的酚類化合物，在自然界的各種生物體內(nèi)，含有許多種類的酚類化合物，然而只需其中的一部分可以作為多酚氧化酶或酪氨酸然而只需其中的一部分可以作為多酚氧化酶或酪氨酸酶的底物。這些酚類化合物在多酚氧化酶催化下發(fā)生酶的底物。這些酚類化合物在多酚氧化酶催化下發(fā)生一系列化學反響，最終導致水果、蔬菜產(chǎn)品的變色。其一系列化學反響，最終導致水果、蔬菜產(chǎn)品的變色。其中酪氨酸酶最重要的底物是兒茶素、多巴中酪氨酸酶最重要的底物是兒茶素、多巴3,4-3,4-二羥基二羥基苯丙氨酸、苯丙氨酸、3,4-3,4-二羥基肉桂酸酯綠原酸和酪氨酸。二羥基肉桂酸酯綠原酸和酪氨酸。 多多酚酚氧氧化化酶酶的的底底物物 多酚氧化酶也可以

15、催化許多非天然酚類化合物，但是單多酚氧化酶也可以催化許多非天然酚類化合物，但是單酚和二酚分子中取代基的位置是決議酚類化合物能否被酚和二酚分子中取代基的位置是決議酚類化合物能否被多酚氧化酶催化的一個重要要素。實驗闡明多酚氧化酶多酚氧化酶催化的一個重要要素。實驗闡明多酚氧化酶只能催化對位上有取代基的單酚羥基化，而鄰位取代的只能催化對位上有取代基的單酚羥基化，而鄰位取代的單酚和二酚由于空間位阻的緣由很難被該酶所氧化。多單酚和二酚由于空間位阻的緣由很難被該酶所氧化。多酚氧化酶也可以催化間位取代的單酚羥基化，構(gòu)成的產(chǎn)酚氧化酶也可以催化間位取代的單酚羥基化，構(gòu)成的產(chǎn)物同對位取代酚的氧化產(chǎn)物一樣，但反響速度

16、低物同對位取代酚的氧化產(chǎn)物一樣，但反響速度低4 4倍多。倍多。 OHOHHOOOHOH兒茶素OHOHCH=CHCOOCO OHOHOHOH綠原酸HOHOCH2CHCOOHNH2HOCH2CHCOOHNH2多巴酪氨酸 多酚氧化酶催化各種酚與多酚氧化酶催化各種酚與O2O2氧化為醌。本實驗氧化為醌。本實驗是采用鄰苯二酚、是采用鄰苯二酚、L-L-多巴為底物，在多巴為底物，在0.2mol/L0.2mol/L磷酸鉀緩沖液磷酸鉀緩沖液pH6.8pH6.8的反響體系中，的反響體系中，PPOPPO催化鄰催化鄰苯二酚、苯二酚、L-L-多巴構(gòu)成褐色的醌，在分光光度計多巴構(gòu)成褐色的醌，在分光光度計390390或或47

17、5nm475nm處使反響體系的處使反響體系的ODOD值產(chǎn)生變化，經(jīng)值產(chǎn)生變化，經(jīng)過過ODOD值上升的讀數(shù)變化確定值上升的讀數(shù)變化確定PPOPPO的酶活大小。的酶活大小。 比活力的計算：將測得的每毫升酶催化活力比活力的計算：將測得的每毫升酶催化活力OD/minOD/min除上每毫升中蛋白質(zhì)的含量，計算除上每毫升中蛋白質(zhì)的含量，計算比活力。比活力。四多酚氧化酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳四多酚氧化酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳法是指帶電荷的供試品蛋白質(zhì)、核苷酸等在惰性電泳法是指帶電荷的供試品蛋白質(zhì)、核苷酸等在惰性支持介質(zhì)如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺支持介質(zhì)如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺

18、凝膠等中，于電場的作用下，向其對應的電極方向按各凝膠等中，于電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進展泳動，使組分分別成狹窄的區(qū)帶，用適宜的自的速度進展泳動，使組分分別成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其含量檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其含量(%)(%)的方法。的方法。包括紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳包括紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳不延續(xù)電泳或圓盤電泳、梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳、不延續(xù)電泳或圓盤電泳、梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳、等點聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳、等點聚焦

19、電泳以及毛細管電泳等。電泳以及毛細管電泳等。 其中聚丙烯酰胺凝膠電泳，具有分子篩和電泳的雙重作用，其中聚丙烯酰胺凝膠電泳，具有分子篩和電泳的雙重作用，它的分辨力高，以此為電泳載體，經(jīng)過電泳方法不但可以它的分辨力高，以此為電泳載體，經(jīng)過電泳方法不但可以測定蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，而且可以測定蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，而且可以了解不同組織、不同發(fā)育細胞某些蛋白質(zhì)表達的情況，是了解不同組織、不同發(fā)育細胞某些蛋白質(zhì)表達的情況，是目前蛋白質(zhì)組學研討的重要工具之一。目前蛋白質(zhì)組學研討的重要工具之一。二、實驗過程二、實驗過程1 1，多酚氧化酶的粗提，多酚氧化酶的粗提1 1粗酶提取、

20、過濾，低粗酶提取、過濾，低溫離心得酶提取液。溫離心得酶提取液。2 2鹽析；運用硫酸銨將鹽析；運用硫酸銨將酶提取液沉淀、低溫酶提取液沉淀、低溫離心、搜集沉淀、溶離心、搜集沉淀、溶解在緩沖液中，透析解在緩沖液中，透析再再30-6030-60分鐘，離心后分鐘，離心后備用。備用。2 2，蛋白質(zhì)含量測定，蛋白質(zhì)含量測定1 1規(guī)范曲線制造。以牛血潔規(guī)范曲線制造。以牛血潔白蛋白作為規(guī)范樣。濃度為白蛋白作為規(guī)范樣。濃度為1mg/ml.1mg/ml.2 2酶提取液、沉淀后粗酶液酶提取液、沉淀后粗酶液蛋白含量測定。假設測試得蛋白含量測定。假設測試得到的光吸收值超越到的光吸收值超越0.60.6，需，需求對樣品進展稀

21、釋。求對樣品進展稀釋。3 3作圖，計算樣品蛋白含量。作圖，計算樣品蛋白含量。3 3，酶催化活性測定，酶催化活性測定1 1以鄰苯二酚為底物測定酶催以鄰苯二酚為底物測定酶催化活性；底物化活性；底物(25mmol/L)(25mmol/L)用用量量5050L L，酶液用量，酶液用量10-2010-20L L。2 2以以L-L-多巴為底物測定酶催化多巴為底物測定酶催化活性；底物活性；底物(2mg/mL)(2mg/mL)用量用量8080L L，酶液用量，酶液用量100-400100-400L L。3 3根據(jù)粗酶液蛋白濃度，計算根據(jù)粗酶液蛋白濃度，計算每毫克蛋白的活力每毫克蛋白的活力- -即比活力。即比活力。以以OD390OD390或或OD475nmOD475nm變化變化0.0010.001為一個酶活力單位為一個酶