QPCR常見(jiàn)問(wèn)題

1、QPCR中常見(jiàn)的問(wèn)題Q： ROX是什么，有什么作用A： ROX是一種熒光染料，作為參比信號(hào)校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX, 這樣由于反應(yīng)總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光 性能的差異等所引起的熒光信號(hào)波動(dòng)都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映PCR進(jìn)程。 ROX校正能夠極大地改進(jìn)定量的精確度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。Q：熒光通道的選擇A：定量PCR實(shí)驗(yàn)必須使用ROX校正熒光，占去一種熒光。TaqMan探針的淬滅基團(tuán)(TAMRA)也要占用一種熒光，對(duì)于4色檢測(cè)的儀器來(lái) 說(shuō),只剩下2種熒光可以標(biāo)記探針,對(duì)于5色檢測(cè)的儀器還有3種熒光可以使用。 如果將探針改用TaqMan M

2、GB探針，由于它的淬滅基團(tuán)是不發(fā)熒光的，比之TaqMan 探針就可以多1種熒光用于標(biāo)記探針。如果實(shí)驗(yàn)要求不高，不做ROX校正(AB 公司不推薦這樣做)，還可以再多一種熒光用于標(biāo)記探針。研究應(yīng)用本身的要求。如果研究52和基因突變，因?yàn)榻^大多數(shù)人類基因是 2態(tài)的，只存在兩種等位基因，2條探針已經(jīng)足夠。如果研究基因表達(dá)，通常是 兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個(gè)內(nèi)對(duì)照，3色也就 足夠了。Q：內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法哪種數(shù)據(jù)更精密A：是同樣可靠的。內(nèi)標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的反應(yīng)條件最接近一致, 缺點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針相互之間會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制，導(dǎo)致它 們的PCR效率有差

3、異。外標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針之間沒(méi) 有發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制的機(jī)會(huì)，但是不同管之間的反應(yīng)條件差異比同管的要大，也會(huì) 導(dǎo)致它們的PCR效率有差異。兩相比較，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的數(shù)據(jù)精確度是一樣的。熒光定量PCR問(wèn)題疑難解答Q 1.這兩天我做標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系還行，R之。但是擴(kuò)增效率只有80%另外 擴(kuò)增曲線也不光滑。2.我用SYBR作為熒光染料，樣品的熒光強(qiáng)度也挺低的只有 100-200 左右。A：曲線不光滑有時(shí)跟染料的量相關(guān)，可以加大；或者是擴(kuò)增產(chǎn)物太少了。 擴(kuò)增效率差有引物、試劑和PCR條件的原因。可以做溫度梯度摸索實(shí)驗(yàn)，尋找最 佳退火溫度（擴(kuò)增子的影響）；還可以增加Mg離子的濃度；如

4、果其他條件都好了， 還不行，那就是引物的原因。樣品稀釋準(zhǔn)確很重要，做標(biāo)準(zhǔn)曲線不好的很多原因 是倍比稀釋的問(wèn)題，正常情況10倍比稀釋時(shí)前后是相差個(gè)循環(huán)。Q：熒光定量PCR的靈敏度A：對(duì)于染料法的熒光定量來(lái)說(shuō)，Cq值在1330之間比較準(zhǔn)確，3033之間需要 再次確認(rèn)，在以上范圍內(nèi)的置信度比較差。Q：標(biāo)準(zhǔn)曲線要重復(fù)兩三次嗎A：不是，只是用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度點(diǎn)最好不要少于4個(gè)，否則標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確 性不高。Q：關(guān)于熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作A： 一般的儀器雖然聲稱能進(jìn)行單拷貝檢測(cè)，但如果不是特別設(shè)計(jì)的體系很難做 到100拷貝以下的準(zhǔn)確定量。一般用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線的最小濃度為1000拷貝，再 往下可靠性就降低了。這

5、不是稀釋或其他什么問(wèn)題，而是本身你選作標(biāo)準(zhǔn)曲線的 濃度以及定量濃度最好不要低于1000拷貝，100拷貝也勉強(qiáng)可以接受。否則即 使做出來(lái)，認(rèn)可度也不會(huì)太高。Q：熔解曲線高矮是什么意思A： Tm值相同，而峰高低有差異是表達(dá)豐度不同。同樣的擴(kuò)增產(chǎn)物也會(huì)出現(xiàn)Tm 值有微小差異，一般差異在1度以內(nèi)都可以接受。熔解曲線的縱坐標(biāo)表示熒光信 號(hào)對(duì)溫度的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)。Q：定量PCR沒(méi)有擴(kuò)增？A：把定量PCR的產(chǎn)物跑個(gè)電泳看有無(wú)產(chǎn)物，如果電泳有條帶說(shuō)明PCR是成功 的，只是熒光信號(hào)沒(méi)有讀取到，這時(shí)要調(diào)整染料或探針的濃度。如果電泳沒(méi)有條 帶,那么還要在定量PCR儀上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。雖然你在普通PCR儀上優(yōu)化過(guò)條件, 但

6、換了定量PCR儀，由于兩臺(tái)儀器的升降溫速度及溫度精密度等指標(biāo)存在差異同 樣的條件做不出PCR也是可能的。Q：熒光定量real-timePCR重復(fù)性問(wèn)題A：建議不要只加1ul，而是稀釋10倍左右然后加10ul這樣有助于改善重復(fù)性。 如果你測(cè)的是拷貝數(shù)重復(fù)性不好是很難避免的。我感覺(jué)用SYBR green作realtime的誤差還是比較大的，它的優(yōu)勢(shì)在于靈敏度高但如果想精確定量還是 比較困難的。探針?lè)ㄌ禺愋宰詈?。Q：擴(kuò)增時(shí)忘了做熔解曲線了，現(xiàn)在是不是沒(méi)法再做融解曲線了A：把定量PCR產(chǎn)物重新作熔解曲線，只是新建立一個(gè)反應(yīng)，反應(yīng)條件按照熔解 曲線的條件設(shè)定就可以了沒(méi)必要重新作定量Q：熒光閾值高怎么改進(jìn)

7、A：閾值取決于基線，基線是313cycles左右的熒光信號(hào)值標(biāo)準(zhǔn)偏差10倍?？?能是背景高，把模板純化一下。就可能是模板濃度較高，起峰早導(dǎo)致的閾值線過(guò) 高。Q：熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度和線性范圍的關(guān)系A(chǔ)： 一般大家認(rèn)為的檢測(cè)靈敏度即檢測(cè)下限，可以理解為能檢測(cè)到和準(zhǔn)確定量的 最低濃度（拷貝數(shù)）。而線性范圍為能夠檢測(cè)的區(qū)間，即可以檢測(cè)及分辨的最低濃 度到最高濃度的數(shù)量級(jí)。但兩者都與熒光定量 PCR儀器及試劑體系相關(guān)。Q： real time PCR Cq值一般在多少后認(rèn)為模板沒(méi)擴(kuò)增A：當(dāng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35個(gè)時(shí)，RealTimeRT-PCR檢測(cè)無(wú)效基因沒(méi)有表 達(dá)。當(dāng)進(jìn)入對(duì)數(shù)的循環(huán)數(shù)在32-3

8、5個(gè)循環(huán)時(shí)，需要有至少3個(gè)重復(fù)才能判斷是否 能檢測(cè)到基因的表達(dá)。Q：正常情況NTC是不應(yīng)該出現(xiàn)Cq值的嗎A如果是探針?lè)ǎ瑧?yīng)該沒(méi)有Cq值。如果是染料法，可能在30個(gè)循環(huán)后有微弱 起峰，并且軟件計(jì)算出Cq值。這時(shí)還要觀察熔解曲線，看擴(kuò)增產(chǎn)物是否是引物 二聚體。如果溶解曲線的Tm值在80度以下那么很可能是引物二聚體，這時(shí)也可 以優(yōu)化條件比如提高退火溫度等。如果溶解曲線是雙峰或更多峰，其中有與加模 板后的擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值相同的峰那么就意味著存在污染。如果是探針?lè)幮詫?duì) 照起峰肯定是污染。Q： real time PCR無(wú)結(jié)果，而用產(chǎn)物跑電泳條帶很清楚，什么問(wèn)題A：因?yàn)榧訕拥臅r(shí)間太長(zhǎng)了，熒光染料暴露時(shí)間

9、太長(zhǎng)熒光基團(tuán)淬滅了；出現(xiàn)上述 問(wèn)題還有一種情況，就是熒光PCR儀的熒光采取信號(hào)值太低。如果使用探針?lè)?有熒光信號(hào)而沒(méi)有求出Cq值，可能探針濃度有問(wèn)題。Q：最佳熒光采集溫度A：采集熒光的時(shí)機(jī)不是取決于溫度而是取決于采用的方法。染料法*一般要在延伸階段的末點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，而72度延伸的效率最高所以采用染 料法時(shí)大多在72度檢測(cè)。如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在引物二聚體，也有采用更高的讀 板溫度比如76度、80度等。TaqMan探針?lè)?由于TaqMan探針是累積熒光，理論上說(shuō)在任何步驟檢測(cè)都可以 但目前TaqMan大多采用兩步法，所以在退火的末點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)即可。 分子信標(biāo)法*就要在退火的末點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。FRET探針?lè)?

10、要在退火時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)。Q：定量PCR中質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)分子為何要線性化A：因?yàn)橐獧z測(cè)的目的基因應(yīng)該是線性的。而目的基因確是連接在環(huán)狀的質(zhì)粒上 的。所以首先需要質(zhì)粒線性化并保證完全酶切，然后要回收。注意線性化的質(zhì)粒 不容易保存。所以如果有實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明不線性化的質(zhì)?？梢杂媚蔷涂梢允∪ズ芏?事情了。Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA. 線形 化與環(huán)狀質(zhì)粒比較文章。這篇文章用這

11、個(gè)質(zhì)粒對(duì)線性化和非線性化做了比較， 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看線性化并沒(méi)有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生任何改變。但是這篇文章只是擺出了 試驗(yàn)結(jié)果并沒(méi)有從原理上分析這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因。因此線性化對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的 作用并不能以這篇文章的結(jié)果來(lái)外推。就是說(shuō)可能需要更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。或者從 原理上分析了這篇文章的結(jié)果才能得出結(jié)論來(lái)說(shuō)明。Q： realtime pcr不同基因之間的閾值(threshold)是不是要一樣啊A：如果做標(biāo)準(zhǔn)曲線或者相對(duì)定量建議閾值還是一樣比較好。而且閾值一般要放 置于擴(kuò)增曲線的指數(shù)段，即熒光數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸下的線性段。如果擴(kuò)增曲線的效 率接近，閾值線的位置對(duì)于定量結(jié)果的影響是微乎其微的。Q：擴(kuò)增曲線本底不斷升

12、高是什么原因A：1、試劑質(zhì)量差是主要原因；2、模板不純是一個(gè)重要原因；Q：只要Cq值大于30都是陰性嗎A：要與對(duì)照品比對(duì)才能定性分析。不過(guò)一般Cq值大于30結(jié)果置信度降低，需 要多次確認(rèn)。常規(guī)修飾基團(tuán)分子量5 -Biotin3 -TAMARA5' -(6 FAM)3' -Dabsyl5' -HEX3' -(6 FAM)5' -TET3' -Amino Modifier C35' -Cy53' -Amino Modifier C75' -Cy33' -Thiol Modifier C3Q：待測(cè)基因的Cq值大多在182

13、5之間，但內(nèi)參的Cq值很低。第一次做時(shí)基本 都在10左右，將模板稀釋10倍后第二次的內(nèi)參照的Cq值還是在1214之間。 以這樣的數(shù)據(jù)分析會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確度嗎A：每次都做陰性對(duì)照并且陰性對(duì)照Cq為0,那Cq30就肯定不是污染，而是基 因表達(dá)量低或是模板太稀。內(nèi)參Cq為1014都正常，沒(méi)必要再稀釋模板了。不 過(guò)內(nèi)參Cq低于10,結(jié)果可能會(huì)有偏差。Q：請(qǐng)問(wèn)下現(xiàn)在的PCR熒光診斷試劑盒里面，國(guó)家規(guī)定都要求要有臨界陽(yáng)對(duì)照嗎 這些對(duì)照品是不是一定要和樣本一起提取呢還有臨界陽(yáng)用陽(yáng)性對(duì)照來(lái)稀釋來(lái)得 到可以嗎A：陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照必須要和樣品一起提取，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，這樣才有作為 對(duì)照的意義。臨界陽(yáng)性樣品是不能通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照稀釋的，除非你知道臨界陽(yáng)性的 濃度，經(jīng)過(guò)定量標(biāo)定將陽(yáng)性對(duì)照稀釋到臨界陽(yáng)性。Q： real time PCR結(jié)果熔解曲線中出