肉制品中剛果紅的測定

1、附件2 肉制品中剛果紅的測定BJS 2018071 范圍本方法規(guī)定了肉制品中剛果紅的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本方法適用于肉制品中剛果紅的測定。2 原理試樣經(jīng)氨水乙醇溶液提取，用正己烷去除提取液中的脂肪后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行測定，外標法定量。3 試劑和材料除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純或以上規(guī)格，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1 乙腈（C2H3N）：色譜純。3.1.2 甲醇（CH3OH）：色譜純。3.1.3 乙醇（C2H5OH）：色譜純。3.1.4 正己烷（C6H14）：優(yōu)級純。3.1.5 甲酸銨（CH5NO2）：色譜純。3.1.6 氨水（NH3&#

2、183;H2O）：含量25%28%。3.2 試劑的配制3.2.1 氨水乙醇溶液（20+80）：移取氨水（3.1.6）20 mL，加入80ml乙醇（3.1.3），混勻備用。3.2.2 5mmol/L甲酸銨溶液：稱取甲酸銨（3.1.5）0.315 g，加適量的水溶解，定容至1000 mL，混勻。3.3 標準品剛果紅標準樣品的分子式、相對分子量、CAS登錄號見表1，純度98 %表1 剛果紅標準樣品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量剛果紅Congo Red573-58-0C32H22N6Na2O6S2696.663.4 標準溶液的配制稱取

3、10 mg（精確到0.1 mg）剛果紅標準品于100 mL量瓶中，加入少量甲醇溶解后，用甲醇定容，得到100 g/mL的標準儲備溶液，4避光保存6個月。4 儀器和設(shè)備4.1 液相色譜四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧（ESI）離子源4.2 渦旋振蕩器4.3 組織搗碎機4.4 高速離心機，10000 r/min4.5 電子天平，感量0.0001g和0.01g4.6 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀5 分析步驟5.1 試樣制備取適量有代表性的試樣切成小塊，組織搗碎機搗碎，均質(zhì)分成兩份，作為試樣和留樣，分別裝入潔凈容器中，密封并標記，于18避光保存。5.2 樣品前處理準確稱取2 g（精確至0.01g）試樣于50 mL離心管中，加

4、入10 mL氨水乙醇溶液（3.2.1），在渦旋振蕩器上提取2 min后置于離心機中以5000 r/min離心5 min，把上層提取液溶液全部轉(zhuǎn)移至另一離心管中，用10 mL氨水乙醇溶液重復(fù)提取一次，合并提取液。在提取液中加入30 mL正己烷于渦旋振蕩器上混合2 min后，5000 r/min離心2 min，棄去正己烷，將下層溶液全部轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，60 下旋蒸至干，用5mL甲醇溶解殘渣。取部分溶解液至離心管中，10000 r/min離心10 min后，取上清液上機測試。5.3 儀器條件5.3.1 液相色譜條件a）色譜柱：C18色譜柱（3.0mm×100mm，3.5m），或性能相當者；

5、b）流動相：流動相A為5 mmol/L甲酸銨水溶液，流動相B為乙腈，流動相梯度洗脫程序見表2；6 表2 梯度洗脫程序時間/min流動相A（%）流動相B（%）080205.020806.080208.08020c）流速：0.3 mL/min；d）柱溫：35；e）進樣量：1L。6.1.1 質(zhì)譜條件a）電離方式：電噴霧負離子模式；b）檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；c）霧化氣壓力：40 psi；d）干燥氣溫度：320 ；e）干燥氣流速：9.0 L/min；f）毛細管電壓：4.0kV；g）監(jiān)測離子對、碎裂電壓和碰撞能量見表3。7 表3 剛果紅的監(jiān)測離子對、碎裂電壓和碰撞能量中文名稱監(jiān)測離子對(m/z）

6、碎裂電壓( V）碰撞能量(eV）剛果紅325.0/152.013039 325.0/416.0 *13013注： *為定量離子對7.1 定性確證進行樣品測定時，如果檢出的質(zhì)量色譜峰保留時間與標準溶液一致，并且在扣除背景后的樣品譜圖中，各定性離子的相對豐度（k）與濃度接近的同樣條件下得到的標準溶液譜圖相比，最大允許相對偏差不超過表4中規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測組分。8 表4 定性時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度/%k>50%50%k>20%20%k>10%k10%允許的相對偏差/%±20±25±30±508.1 定量

7、測定8.1.1 標準曲線的制備將剛果紅標準溶液（3.4）用甲醇逐級稀釋成0.25µg/mL、1µg/mL、5µg/mL、10µg/mL、20µg/mL的標準系列溶液，準確稱取與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性試樣2g（精確至0.01g，按5.2操作未檢出325.0/152.0和325.0/416.0離子對），分別加入標準系列溶液1mL，與試樣同時進行提取，制成最終濃度為0.05、0.2、1.0、2.0、4.0 g/mL標準系列工作溶液，將標準系列工作液上機測試，建立響應(yīng)值與濃度的線性擬合方程。標準譜圖見附錄A。8.1.2 試樣溶液的測定將試樣溶液（5.2）按

8、儀器參考條件（5.3）進行測定，得到相應(yīng)的試樣溶液的質(zhì)量色譜峰面積。根據(jù)標準曲線得到試樣溶液中剛果紅的濃度。8.2 空白試驗除不加試樣外，采用完全相同的測定步驟進行平行操作。9 結(jié)果計算按下式（1）計算試樣中剛果紅的含量：(1）式中：X試樣中剛果紅的含量，mg/kg；C試樣測定液中待測物含量，g/mL； V試樣定容體積，mL； m稱取樣品量，g；f 試樣制備過程中的稀釋倍數(shù)。測定結(jié)果以平行測定的算術(shù)平均值表示，保留2位有效數(shù)字。10 靈敏度當稱樣量為2.00 g時，本方法檢出限為0.13 mg/kg，定量限為0.45 mg/kg。11 精密度和準確度在0.5 mg/kg、1.0 mg/kg及5.0 mg/kg的添加水平下，回收率不低于70%，相對標準偏差不高于10%。附錄A剛果紅標準溶液質(zhì)量色譜圖圖1 100ng/mL剛果紅多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖本方法