綠色熒光蛋白標(biāo)記銅綠假單胞菌生物膜形成的動(dòng)態(tài)觀察及結(jié)構(gòu)定量分

1、綠色熒光蛋白標(biāo)記銅綠假單胞菌生物膜形成的動(dòng)態(tài)觀察及結(jié)構(gòu)定量分         作者：陳波曼 余加林 劉官信 胡琳燕 李芳 楊華 【摘要】 目的 探討銅綠假單胞菌細(xì)菌生物膜(biofilm，BF)形成發(fā)展過(guò)程中空間立體結(jié)構(gòu)變化，以及BF形成過(guò)程中與其生物學(xué)行為之間的相互聯(lián)系。方法 體外建立6h和1、3及6d等4個(gè)時(shí)間組銅綠假單胞菌PAO1菌株BF模型，通過(guò)綠色熒             &

2、#160;              作者：陳波曼 余加林 劉官信 胡琳燕 李芳 楊華【摘要】【關(guān)鍵詞】  生物膜； 銅綠假單胞菌； 定量分析； 結(jié)構(gòu)    ABSTRACT  Objective  To quantify the sequential development of biofilm spatial structure in biofilm process with Image Structu

3、re Analyer (ISA) software, which will provide assistant to further research on the biological behavior of biofilm.  Methods  P.aeruginosa PAO1 biofilm model in vitro was constructed on glass slice and biofilm development was monitored in different time intervals (6 hours, 1 day, 3 days and

4、 6 days). The fluorescence images stack of different layer in biofilm model were obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM), based on fluorophores from PAO1 with green fluorescent protein (GFP) genetically tagged. Quantitative parameters describing biofilm spatial structure could be acqui

5、red after the image information was calculated by ISA software.  Results  The PAO1 biofilm process was investigated successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. The quantitative data from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth, the ra

6、te was more obvious during the first 3 days than the latter 3 days (19.6m vs. 6.1m); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.98±0.01 at 6h to 0.92±0.02 at 6d, the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.00±0.009 at 6h to 1.06±0.027 at 6d; the textura

7、l entropy (TE) increased from 0.7±0.08 at 6h to 4.3±0.09 at 6d.  Conclusions  The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with b

8、iofilm performance.    KEY WORDS  Biofilm;  Pseudomonas aeruginosa;  Quantitative analysis;  Structure    長(zhǎng)久以來(lái)，人們對(duì)細(xì)菌的認(rèn)識(shí)停留在浮游態(tài)水平上，但自然界中99%的細(xì)菌以生物膜(biofilm，BF)的形式存在。細(xì)菌BF是細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境黏附惰性或活性材料表面形成的一種與浮游細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)方式，具有環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)，抵抗吞噬細(xì)胞作用，逃避宿主免疫，尤其耐藥性極強(qiáng)等生物學(xué)特性，而B(niǎo)F

9、的許多特性均與其特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是我國(guó)醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染及重癥監(jiān)護(hù)病房感染的重要條件致病菌，近年來(lái)研究證明，該菌極易形成BF1，臨床上，有BF表型的Pa往往引起難以治愈的嚴(yán)重感染。以往研究多采用光鏡、掃描或透射電鏡等觀察細(xì)菌BF結(jié)構(gòu)，但樣本在脫水、固定、染色等處理過(guò)程中易發(fā)生結(jié)構(gòu)扭曲及關(guān)系改變。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立體外PaO1菌株BF模型，結(jié)合綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記技術(shù)，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)攝取BF發(fā)展成熟各階段不同層面的圖像，所獲圖片堆經(jīng)圖象結(jié)

10、構(gòu)分析(image structure analyer，ISA)軟件分析，獲得PAO1菌株BF發(fā)展過(guò)程相關(guān)空間結(jié)構(gòu)變化的數(shù)據(jù)，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌BF的無(wú)損傷觀察，并對(duì)BF空間結(jié)構(gòu)的定量化分析進(jìn)行了初步探索。    1  材料和方法    1.1  試劑和菌株    銅綠假單胞菌PAO1菌株(本實(shí)驗(yàn)室保存)，pGFPuv質(zhì)粒(Clontech公司)，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(日本BioFlux公司)，限制型內(nèi)切酶EcoRI和HindIII(寶生物公司)，ISA軟件(美國(guó)Montana州立大學(xué)

11、Haluk Beyenal教授提供)。    (1)PAO1菌株電感受態(tài)制備  參考單志英等2實(shí)驗(yàn)方法，將過(guò)夜增菌的PAO1菌株轉(zhuǎn)接于50ml SOB培養(yǎng)基中，37，200r/min振蕩培養(yǎng)；A600值為0.7左右時(shí)中止培養(yǎng)；2，6000r/min離心15min；菌體沉淀依次用等體積、1/2體積、1/5體積的0.3mol/L冰浴蔗糖溶液重新懸浮，洗滌菌體；2，6000r/min離心15min，最后根據(jù)菌體多少加入不同體積的0.3mol/L蔗糖溶液將菌體混勻；分裝成每管100l，直接用于電轉(zhuǎn)化。    (2)pGFPuv質(zhì)粒轉(zhuǎn)

12、化和轉(zhuǎn)化菌株篩選  感受態(tài)細(xì)胞100l，質(zhì)粒約50ng，加入預(yù)冷的0.1cm電轉(zhuǎn)化杯中；在BioRad電轉(zhuǎn)化儀上(設(shè)置電壓1.5kv，電容25F，電阻200)進(jìn)行電擊5ms；將轉(zhuǎn)化體系加入37溫浴的800l SOC培養(yǎng)基中，37，100r/min振蕩復(fù)蘇1h；取100l菌液涂布篩選培養(yǎng)基，37，16h18h；在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且紫外燈下有綠色熒光的菌落即為實(shí)驗(yàn)需要的轉(zhuǎn)化菌株。    (3)轉(zhuǎn)化菌株中質(zhì)粒提取和酶切電泳鑒定  挑取表達(dá)強(qiáng)綠色熒光的轉(zhuǎn)化菌株單菌落，接種LBroth培養(yǎng)液，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按照BioFlux公司質(zhì)粒提取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)

13、明進(jìn)行質(zhì)粒的小量提取；0.8%瓊脂糖凝膠電泳；對(duì)照pGFPuv質(zhì)粒圖譜進(jìn)行鑒定。用EcoRI和HindIII行雙酶切，反應(yīng)溫度為37；反應(yīng)體系為HindIII 1l，EcoRI 1l，10×M緩沖液2l，提取質(zhì)粒17l，作用12h；0.8%瓊脂糖凝膠電泳。    (4)pGFPuv轉(zhuǎn)化菌株建立BF模型  挑取GFP轉(zhuǎn)化PAO1菌株單菌落接種LBroth培養(yǎng)液，37，180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；調(diào)整A600值至0.5；接種PAO1菌液于預(yù)先放置滅菌蓋玻片(8mm×8mm，作為黏附載體)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1ml；37，分4個(gè)不同

14、時(shí)間段6h、1d、3d、6d孵育，隔日換液，每個(gè)時(shí)間段重復(fù)5次。    1.2  激光共聚焦顯微鏡觀察    氬激光(488nm)激發(fā)，物鏡×20，每個(gè)模型由外(BF游離的一面)向內(nèi)(BF和玻片相貼的一面)逐層掃描(沿Z軸掃描)，每個(gè)標(biāo)本掃描816張。    1.3  運(yùn)用ISA軟件對(duì)PAO1菌株BF結(jié)構(gòu)定量化分析    將上述獲得的各時(shí)間組模型圖片堆調(diào)入ISA3D軟件，確認(rèn)圖片的完整性及順序后運(yùn)行ISA及ISA3D命令，運(yùn)行結(jié)果包括：結(jié)構(gòu)參數(shù)：

15、如結(jié)構(gòu)熵(textural entropy，TE)、結(jié)構(gòu)能(energy，E)、均一性(homogeneity，H)；平面參數(shù)：區(qū)域孔率(areal porosity，AP)、平均擴(kuò)散距離(average diffusion distance，ADD)、最大擴(kuò)散距離(maximum diffusion distance，MDD)等指標(biāo)；其它參數(shù)：如生物量(biovolume，BV)、比表面積(surface area between biomass and void，SA)、單位面積生物膜體積(biomass volume to surface area ratio，V2SA)等3。輸出數(shù)據(jù)以

16、EXCEL格式保存。    2  結(jié)果    2.1  GFP標(biāo)記的PAO1菌株構(gòu)建與發(fā)光表型觀察    通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法對(duì)PAO1菌株進(jìn)行了pGFPuv標(biāo)記。轉(zhuǎn)化菌株自然光下即可見(jiàn)綠色熒光，在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)綠色熒光；熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)化菌株菌體發(fā)出明亮的綠色熒光，細(xì)菌形態(tài)呈短棒狀，提示pGFPuv已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入了PAO1菌株中，該轉(zhuǎn)化菌株可以作為BF空間結(jié)構(gòu)定量化分析研究的模式菌。    2.2  轉(zhuǎn)化菌株質(zhì)粒提取鑒定及雙酶切鑒定    轉(zhuǎn)化菌株抽提質(zhì)粒后，電泳結(jié)果顯示在2000和3500bp之間有一條約3300bp帶，條帶與質(zhì)粒大小吻合。提取的質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切，電泳顯示在2000和3500bp之間有一條約2500bp帶，在500和1000bp之間有一條約800b