微生物遺傳與育種(09140)

1、微生物遺傳育種課程（09140）教學(xué)大綱一、課程基本信息課程中文名稱：微生物遺傳育種課程代碼：09140學(xué)時與學(xué)分：76學(xué)時4學(xué)分（理論課52學(xué)時，實驗課24學(xué)時）課程性質(zhì)：專業(yè)選修課（必選）授課對象：生物工程專業(yè)二、課程教學(xué)目標與任務(wù)微生物育種學(xué)課程是為生物工程專業(yè)本科生開設(shè)的一門重要專業(yè)選修課，可在學(xué)生學(xué)習(xí)生物化學(xué)和微生物學(xué)之后選修該課程。該課程主要教授微生物育種的理論基礎(chǔ)、誘變育種、代謝控制育種、雜交育種、原生質(zhì)體融合育種、基因工程育種的原理和方法。通過本門課程的學(xué)習(xí)，學(xué)生可以掌握微生物育種的相關(guān)原理和具體方法，為從事生物工程領(lǐng)域的生產(chǎn)和科學(xué)研究打下基礎(chǔ)。三、學(xué)時安排課程內(nèi)容與學(xué)時分配表

2、章節(jié)內(nèi)容課時第一章緒論1第二章遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)2第三章基因突變3第四章工業(yè)微生物育種誘變劑4第五章工業(yè)微生物產(chǎn)生菌的分離篩選6第六章工業(yè)微生物誘變育種6第七章工業(yè)微生物代謝控制育種6第八章工業(yè)微生物雜交育種3第九章工業(yè)微生物原生質(zhì)體育種和原生質(zhì)體融合育種6第一章微生物基因組改組育種3第一一章基因工程育種3第一二章分子定向進化育種3第一三章高通量篩選技術(shù)3第一四章工業(yè)微生物菌種復(fù)壯與保3試驗1細菌的原生質(zhì)體融合6試驗2乳酸菌篩選及抑菌作用研究6試驗3香菇雜交育種6試驗4細菌營養(yǎng)缺陷型篩選試驗6四、課程教學(xué)內(nèi)容與基本要求第一章 緒論教學(xué)目的：了解微生物育種在發(fā)酵工業(yè)中的地位，理解微生物育種的進展。基

3、本要求：通過教學(xué)，使學(xué)生了解本課程的研究對象和任務(wù)、微生物育種在發(fā)酵工業(yè)中的地位以及工業(yè)微生物育種的進展。重點與難點：重點：微生物育種的進展。難點：當前微生物育種的主要技術(shù)概覽。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 工業(yè)微生物育種在發(fā)酵工業(yè)中的地位一、 微生物菌種二、 微生物菌種的重要性三、 微生物菌種特性四、 菌種來源第二節(jié) 工業(yè)微生物育種的進展一、 自然選育二、 誘變育種三、 雜交育種四、 代謝控制育種五、 基因工程育種六、 基因組改組（genome shuffling）七、 分子定向進化（molecular directed evolution of enzyme

4、）八、 高通量篩選技術(shù)(High throughput screening,HTS)第二章 遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)教學(xué)目的：了解微生物遺傳的基本知識，掌握微生物基因組的組織與結(jié)構(gòu)。基本要求：通過教學(xué)，使學(xué)生回顧、了解微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，掌握微生物基因組的組織與結(jié)構(gòu)。重點與難點： 重點：微生物基因組的組織與結(jié)構(gòu)。難點：微生物基因組與其他生物基因組的主要區(qū)別。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 染色體一、染色體形態(tài)二、原核生物及病毒染色體結(jié)構(gòu)三、真核生物染色體結(jié)構(gòu)四、染色體數(shù)目第二節(jié) 核酸一、核酸二、RNA三、DNA第三節(jié) 基因的組織與結(jié)構(gòu)一、基因組二、基因三、遺傳密碼第三章

5、基因突變教學(xué)目的：了解基因突變的概念，掌握基因突變的本質(zhì)和表型延遲現(xiàn)象?；疽螅和ㄟ^教學(xué)，使學(xué)生了解基因突變的概念，掌握基因突變的規(guī)律和突變類型，理解突變型篩選的方法，理解影響因素和誘變作用的專一性，掌握表型、表型延遲的概念及突變的修復(fù)。重點與難點： 重點：基因突變的本質(zhì)和表型延遲現(xiàn)象。難點：基因突變的規(guī)律和突變類型，突變型篩選方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 突變的分子機制一、基因突變二、染色體畸變和染色體組變第二節(jié) 突變引起遺傳性狀改變一、突變引起遺傳性狀改變二、突變型的種類第三節(jié) 突變體的形成一、突變體的形成過程二、突變的修復(fù)三、突變的表型效應(yīng)四、表型

6、延遲第四章 工業(yè)微生物育種誘變劑教學(xué)目的：掌握微生物育種各種誘變劑及其誘變機理，了解誘變劑處理方法?；疽螅和ㄟ^教學(xué)，使學(xué)生掌握誘變劑的概念、常見誘變劑的種類和誘變機理，了解各種誘變劑在微生物育種中的處理方法。重點與難點：各種誘變劑的作用機理。重點：各種誘變劑的作用機理。難點：誘變劑作用機理及其在微生物育種中的處理方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 物理誘變劑一、物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng)二、非電離輻射紫外線三、電離輻射四、近年來發(fā)展的新型物理誘變劑第二節(jié) 化學(xué)誘變劑一、堿基類似物二、烷化劑三、脫氨劑（以亞硝酸為例）四、移碼誘變劑五、羥化劑（以羥胺為例）六、金屬鹽

7、類七、其他化學(xué)誘變劑八、化學(xué)誘變劑的安全操作第三節(jié) 生物誘變劑一、噬菌體二、基因誘變劑第五章 工業(yè)微生物產(chǎn)生菌的分離篩選教學(xué)目的：掌握微生物野生菌株的分離篩選方法。基本要求：通過教學(xué)，使學(xué)生掌微生物的取樣、好氧菌的分離篩選、厭氧菌的分離篩選的基本原理和方法，了解極端微生物和生物可降解塑料生產(chǎn)菌的篩選分離方法。重點與難點： 重點：微生物野生菌分離篩選程序和方法。難點：各種微生物野生菌篩選的基本原理和方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 含微生物樣品的采集一、從土壤中采樣二、根據(jù)微生物生理特點采樣三、特殊環(huán)境下采樣第二節(jié) 含微生物樣品的富集培養(yǎng)一、控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分

8、二、控制培養(yǎng)條件三、抑制不需要的菌類第三節(jié) 好氧微生物的分離一、稀釋涂布和劃線分離法二、利用平皿中的生化反應(yīng)進行分離三、組織分離法四、單細胞或單孢子分離法五、通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件進行分離第四節(jié) 厭氧微生物的分離一、厭氧培養(yǎng)中幾種除氧方法二、紅螺菌的分離三、反硝化細菌的分離四、脫氮硫桿菌的分離五、乳酸菌的分離第五節(jié) 野生型目的菌株的篩選和菌選鑒定一、初篩二、復(fù)篩三、菌株鑒定第六節(jié) 極端環(huán)境微生物的分離篩選一、極端環(huán)境微生物的采樣、分離篩選二、極端微生物酶分子生物學(xué)研究第七節(jié) 生物可降解塑料(PHA)菌株的分離篩選一、生物可降解塑料概況二、獲得生物可降解塑料的微生物途徑和菌株分離方法三、PHA的

9、合成機制和發(fā)酵特點第六章 工業(yè)微生物誘變育種教學(xué)目的：掌握微生物誘變育種的基本理論和方法?；疽螅和ㄟ^教學(xué)，使學(xué)生掌握誘變育種的基本步驟和方法，掌握營養(yǎng)缺陷型菌株、溫敏突變株、抗噬菌體突變株的誘變和篩選方法，了解微生物發(fā)酵過程的正交法和響應(yīng)面法試驗設(shè)計。重點與難點： 重點：微生物誘變育種的原理與方法。難點：誘變育種的基本原理、各種常用突變型篩選方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 誘變育種的試驗設(shè)計和準備工作一、誘變前對出發(fā)菌株的了解二、全面了解菌種特性及其與生產(chǎn)性能的關(guān)系二、了解影響菌種生長發(fā)育的主要因素四、了解菌種有效產(chǎn)物中的各種組分在代謝合成過程中與培養(yǎng)條

10、件的關(guān)系五、建立一個準確、簡便、快速檢測產(chǎn)物的方法六、研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件第二節(jié) 誘變育種的步驟與方法一、出發(fā)菌株二、出發(fā)菌株的純化三、單孢子(或單細胞)懸液的制備四、誘變劑及誘變劑量五、誘變劑的處理方式六、影響突變率的因素第三節(jié) 突變株的常規(guī)分離與篩選一、誘變育種的基本環(huán)節(jié)二、篩選的程序三、分離和篩選四、搖瓶液體培養(yǎng)五、產(chǎn)物活性測定六、搖瓶數(shù)據(jù)的調(diào)整和有關(guān)菌株特性的觀察分析七、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整八、變種的特性研究與鑒定九、誘變育種實例第四節(jié) 營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選一、營養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選二、營養(yǎng)缺陷型突變株的應(yīng)用第五節(jié) 溫敏突變株的篩選一、溫敏突變株的特性二、溫敏突變株

11、的篩選方法三、溫敏突變株在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用第六節(jié) 抗噬菌體菌株的選育一、烈性噬菌體及其效價的測定二、溫和性噬菌體及溶源菌三、抗噬菌體菌株的選育四、抗性菌株的特性研究五、抗噬菌體菌株選育的實例第七節(jié) 微生物發(fā)酵過程優(yōu)化的正交法一、正交的含義二、正交試驗設(shè)計方法三、正交試驗結(jié)果第八節(jié) 微生物發(fā)酵過程優(yōu)化的響應(yīng)面法試驗設(shè)計（自學(xué)）一、微生物發(fā)酵過程優(yōu)化過程概述二、響應(yīng)面法三、響應(yīng)面法的應(yīng)用實例第七章 工業(yè)微生物代謝控制育種教學(xué)目的：掌握微生物代謝育種的基本理論與方法?；疽螅和ㄟ^教學(xué)，使學(xué)生掌握初級和次級代謝的調(diào)節(jié)控制以及微生物代謝控制育種的基本原理與方法。重點與難點： 重點：組成型突變株的選育和

12、營養(yǎng)缺陷型突變株選育。難點：組成型突變株、營營養(yǎng)缺陷型突變株的選育方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 概論一、初級代謝產(chǎn)物和初級代謝二、次級代謝產(chǎn)物和次級代謝三、初級代謝與次級代謝的關(guān)系第二節(jié) 初級代謝的調(diào)節(jié)控制一、酶合成的調(diào)節(jié)二、酶活性的調(diào)節(jié)三、反饋阻遏與反饋抑制的比較第三節(jié) 次級代謝的調(diào)節(jié)控制一、次級代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)二、次級代謝產(chǎn)物碳源分解調(diào)節(jié)二、次級代謝產(chǎn)物氮源分解調(diào)節(jié)四、次級代謝反饋調(diào)節(jié)五、磷酸鹽的調(diào)節(jié)六、細胞膜透性的調(diào)節(jié)第四節(jié) 代謝調(diào)節(jié)控制育種一、組成型突變株的選育二、抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育三、營養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用四、滲漏缺陷型在代謝調(diào)節(jié)

13、育種中的應(yīng)用五、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育六、細胞膜透性突變株的選育七、其他抗性突變株的選育第八章 工業(yè)微生物雜交育種教學(xué)目的：掌握微生物雜交育種的基本理論與方法。基本要求：通過教學(xué)，使學(xué)生掌握放線菌、霉菌和酵母菌雜交育種的基本理論和方法。重點與難點： 重點：雜交親本的遺傳標記的選擇。難點：細菌、放線菌和霉菌的雜交方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 微生物雜交一、雜交的意義二、微生物雜交育種基本程序三、雜交過程中親本和培養(yǎng)基的選擇四、雜交育種的遺傳標記五、雜交育種方法第二節(jié) 放線菌雜交育種一、放線菌細胞結(jié)構(gòu)與繁殖二、放線菌雜交概況和原理三、放線菌的雜交技術(shù)第三節(jié) 酵

14、母菌的雜交育種一、酵母菌的細胞結(jié)構(gòu)和菌落形態(tài)二、酵母菌的生活史和繁殖方式三、酵母茵的雜交第四節(jié) 霉菌雜交育種一、霉菌的細胞結(jié)構(gòu)和繁殖二、霉菌雜交的原理和雜交技術(shù)三、高產(chǎn)重組體的篩選第九章 工業(yè)微生物原生質(zhì)體育種和原生質(zhì)體融合育種教學(xué)目的：掌握微生物原生質(zhì)體育種和原生質(zhì)體融合育種的基本理論與方法?；疽螅和ㄟ^教學(xué)，使學(xué)生掌握放原生質(zhì)體制備、再生以及融合的方法步驟。重點與難點：重點：雜交、原生質(zhì)體融合的定義和原生質(zhì)體融合的過程及注意事項。難點：原生質(zhì)體操作過程中滲透壓的控制。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 原生質(zhì)體育種一、原生質(zhì)體再生育種二、原生質(zhì)體誘變育種三、原生

15、質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種四、原生質(zhì)體融合育種五、其他微生物原生質(zhì)體育種第二節(jié) 微生物原生質(zhì)體融合育種一、直接親本及其遺傳標記的選擇二、原生質(zhì)體制備與再生三、原生質(zhì)體融合四、融合體再生五、融合重組體檢出與遺傳特性分析六、原生質(zhì)體融合的應(yīng)用第三節(jié) 細菌原生質(zhì)體融合育種一、概述二、細菌原生質(zhì)體融合育種一般程序三、細菌原生質(zhì)體融合育種技術(shù)第四節(jié) 放線菌原生質(zhì)體融合育種一、放線菌細胞壁組成、結(jié)構(gòu)及水解二、放線菌原生質(zhì)體融合育種技術(shù)第五節(jié) 酵母菌原生質(zhì)體融合育種一、酵母菌細胞壁結(jié)構(gòu)和遺傳標記二、酵母菌原生質(zhì)體融合育種技術(shù)第六節(jié) 霉菌原生質(zhì)體融合育種一、霉菌原生質(zhì)體融合育種程序二、培養(yǎng)基及相關(guān)溶液三、霉菌原生質(zhì)體融合的

16、關(guān)鍵步驟第一章 微生物基因組改組育種教學(xué)目的：了解微生物基因組改組育種的原理和意義，掌握基因組改組育種的基本方法和技術(shù)?；疽螅和ㄟ^教學(xué)，使學(xué)生了解基因組改組育種的原理和意義，并通過實例，掌握基因組改組育種的基本方法和技術(shù)。重點與難點：重點：基因組改組育種。難點：基因組改組的具體原理和基本方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 微生物基因組改組育種意義和原理一、基因組改組育種概述二、基因組改組育種技術(shù)基本原理第二節(jié) 基因組改組育種技術(shù)及應(yīng)用實例一、基因組改組育種技術(shù)二、基岡組改組育種技術(shù)應(yīng)用實例第一一章 基因工程育種教學(xué)目的：了解基因工程在微生物育種中的應(yīng)用和意義

17、，掌握基因工程的主要步驟?；疽螅和ㄟ^教學(xué)，使學(xué)生了解基因工程在微生物育種中的應(yīng)用前景和實際意義，基因工程載體的構(gòu)建、重組體導(dǎo)入和重組子的篩選步驟和方法。重點與難點：重點：基因工程的主要步驟。難點：基因定位誘變方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 概述一、基因工程在微生物育種中的應(yīng)用二、基因工程原理和步驟第二節(jié) 基因工程載體一、質(zhì)粒載體二、入噬菌體載體三、柯斯質(zhì)粒載體第三節(jié) 基因工程所用的酶一、限制性內(nèi)切核酸酶二、DNA聚合酶三、依賴于DNA的RNA聚合酶四、連接酶、激酶及磷酸酶五、核酸酶第四節(jié) 基因工程的主要步驟一、DNA的制備二、目的基因的產(chǎn)生與分離二、DN

18、A的連接四、重組體導(dǎo)人大腸桿菌五、含重組質(zhì)粒的細菌菌落的鑒定六、目的基因的表達第五節(jié) 基因定位誘變一、定位誘變方法二、將變異基因送回染色體第一二章 分子定向進化育種教學(xué)目的：了解微生物分子定向進化育種的原理，掌握定向進化育種的基本技術(shù)。基本要求：通過教學(xué)，使學(xué)生了解微生物分子定向進化育種的原理，分子定向進化育種的理性設(shè)計和非理性設(shè)計的基本步驟和方法。重點與難點：重點：分子定向進化育種的原理和基本技術(shù)。難點：定向進化文庫的篩選方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 理性設(shè)計一、寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變二、PCR介導(dǎo)的定點突變?nèi)?、盒式突變第二?jié) 非理性設(shè)計蛋白質(zhì)(酶)

19、分子定向進化技術(shù)一、蛋白質(zhì)(酶)分子定向進化的發(fā)展二、蛋白質(zhì)(酶)分子定向進化策略三、定向進化文庫的篩選方法四、酶分子工程的應(yīng)用和發(fā)展前景第一三章 高通量篩選技術(shù)教學(xué)目的：了解微生物育種中高通量篩選的原理。基本要求：通過教學(xué)，使學(xué)生了解高通量篩選的基本原理，掌握高通量篩選的基本程序和方法。重點與難點：重點：高通量篩選原理。難點：高通量篩選的基本程序和方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 常用儀器設(shè)備一、微孔板二、微孔板恒溫振蕩培養(yǎng)器三、多通道移液器四、連續(xù)移液器五、多道連續(xù)移液器六、全自動移液工作站七、酶標儀(微板光度計)八、流式細胞儀九、條形碼十、數(shù)據(jù)分析軟件第

20、二節(jié) 高通量篩選技術(shù)中的常用一、漆酶的篩選二、OmpT蛋白酶的篩選第一四章 工業(yè)微生物菌種復(fù)壯與保教學(xué)目的：掌握菌種退化的原理和防止退化的方法。基本要求：通過教學(xué)，使學(xué)生掌握菌種退化和復(fù)壯的定義，理解和掌握防止退化及復(fù)壯的方法，掌握菌種保藏原理，理解菌種保藏注意事項，了解國內(nèi)外主要菌種保藏機構(gòu)。重點與難點：重點：菌種保藏的原理。難點：菌種退化的防止方法。教學(xué)方法：現(xiàn)代化教學(xué)手段，圖片展示、講述法。主要內(nèi)容：第一節(jié) 菌種的退化與復(fù)壯一、菌種退化的原因二、菌種退化的防止三、菌種的復(fù)壯及其方法第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的保藏一、菌種保藏二、菌種保藏注意事項三、目前國內(nèi)外主要菌種保藏機構(gòu)五、課程教學(xué)方式與

21、考核方式1教學(xué)方式課堂教授為主，輔以實踐（實驗）教學(xué)。2考核方式閉卷考試：成績占70%；實驗成績占20%，平時綜合成績占10%。六、參考教材及教學(xué)參考資料參考教材：施巧琴、吳松剛，工業(yè)微生物育種學(xué)（第三版），科學(xué)出版社，2009年03月出版。參考資料：1 諸葛健，李華鐘，王正祥，微生物遺傳育種學(xué)（第一版），化學(xué)工業(yè)出版社，2009年02月出版。2 金志華、林建平、梅樂和，工業(yè)微生物遺傳育種學(xué)原理與應(yīng)用（第一版），化學(xué)工業(yè)出版社，2006年01月出版。3 汪天虹，微生物分子育種原理與技術(shù)（第一版）， 化學(xué)工業(yè)出版社，2005年08月出版。七、實驗教學(xué)內(nèi)容與要求（一）實驗教學(xué)目的與基本要求1教學(xué)目

22、的：（1）使學(xué)生全面了解微生物遺傳育種學(xué)實驗的科學(xué)內(nèi)容和基本原理,熟練實驗的操作方法和實驗中所用的儀器、設(shè)備和藥品；（2）訓(xùn)練學(xué)生正確掌握實驗的操作方法和技能,學(xué)會進行綜合實驗或設(shè)計的設(shè)計、準備、操作和結(jié)果分析；（3）培養(yǎng)學(xué)生對實驗原理、方法和結(jié)果進行正確的分析、理解, 仔細觀察、認真思考的科學(xué)素養(yǎng)和分析問題、解決問題的能力. 2基本要求：（1）以小組為單位自主設(shè)計試驗； （2）按照給定的題目（或自選題目)設(shè)計試驗方案；（3）按照試驗方案進行試驗操作；（4）實驗時,實驗室應(yīng)保持安靜,切勿高聲喧嘩和隨意走動；（5）實驗時應(yīng)認真進行觀察和操作,做好實驗的記錄,有疑難問題向老師請教；（6）實驗完畢后

23、,必須將所有用過的玻璃器皿清洗干凈,用過的器物放回原處，未經(jīng)老師同意,實驗室中的任何菌種和物品不得帶出室外。（7）寫出完整的試驗報告。（二）實驗內(nèi)容與基本要求1實驗項目一覽表序號實驗項目名稱學(xué)時實驗類型實驗類別每組人數(shù)實驗室1細菌的原生質(zhì)體融合6設(shè)計型必做6微生物學(xué)實驗室2乳酸菌篩選及抑菌作用研究6設(shè)計型必做6微生物學(xué)實驗室3香菇雜交育種6設(shè)計型必做6微生物學(xué)實驗室4細菌營養(yǎng)缺陷型篩選試驗6設(shè)計型必做6微生物學(xué)實驗室5自選6設(shè)計型必做6微生物學(xué)實驗室合計4個（5選4）2實驗內(nèi)容及要求實驗一 細菌的原生質(zhì)體融合一、實驗?zāi)康暮鸵螅?. 了解原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物基礎(chǔ)研究和改良菌種遺傳性狀方面的

24、應(yīng)用。2. 掌握細菌原生質(zhì)體融合的操作方法。二、儀器設(shè)備： 培養(yǎng)皿、移液管、試管、容量瓶、錐形瓶、燒杯、離心管、吸管、顯微鏡、離心機、分光光度計比色計、細菌過濾器、微波爐、高壓滅菌鍋、等。 三、實驗材料：1 菌種和培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌菌株T4412 （ade- his-）和TT2 （ade- pro-）或其他具有不同選擇標記的菌株（可購買或通過誘變篩選獲得）。完全培養(yǎng)基（CM，液體和液體），基本培養(yǎng)基（MM），補充基本培養(yǎng)基（SM），再生補充基本培養(yǎng)基（SMR），酪蛋白培養(yǎng)基（測蛋白酶活性用）。2. 試劑（1）緩沖液 0.1mol/L pH 6.0 磷酸緩沖液。 高滲緩沖液：

25、于上述緩沖液中加入0.8 mol/L 甘露醇。（2）原生質(zhì)體穩(wěn)定液（SMM）0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 順丁烯二酸，調(diào)pH 6.5。（3）促融合劑40聚乙二醇（PEG-4000）的SMM 溶液。（4）溶菌酶液取酶活性為4000 U/g的溶菌酶，用SMM 溶液配制，終濃度為2 mg/mL，過濾除菌備用。四、教學(xué)方法：講述、自查資料學(xué)習(xí)、討論。五、實驗內(nèi)容提要：細菌原生質(zhì)體融合（bacterial protoplast fusion）是20世紀70年代發(fā)展起來的重要的基因重組技術(shù)，現(xiàn)已經(jīng)成為細菌遺傳育種的一項基本技術(shù)。該技術(shù)不但可以改良菌種遺傳性狀

26、、提高有用代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，還可以綜合不同菌株代謝特征，產(chǎn)生新的有用代謝產(chǎn)物，在工業(yè)生產(chǎn)和遺傳育種上展示出美好的應(yīng)用前景。同轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜交和轉(zhuǎn)染等傳統(tǒng)基因重組方式相比有以下優(yōu)點：具有廣泛適應(yīng)性和隨機性，能夠打破菌株的種屬界限，實現(xiàn)遠緣菌株間的融合；可以使遺傳物質(zhì)傳遞更為完整，獲得更多基因重組機會；可以和其他育種方法相結(jié)合，綜合雙親的多種優(yōu)良性狀；在工業(yè)菌株的選育過程中，可以實現(xiàn)定向育種；能夠用于遺傳分析等基礎(chǔ)理論研究等。細菌原生質(zhì)體融合技術(shù)的整個過程包括：親本菌株選擇、原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生及融合子檢出等主要步驟。親本注意選擇有不同標記的菌株，包括表型標記、生化標記、抗

27、藥性標記、遺傳標記等。原生質(zhì)體的制備主要通過利用蝸牛酶或溶菌酶消化細胞壁獲得。原生質(zhì)體融合常采用誘導(dǎo)法，當前常用的方法主要有化學(xué)法、物理法和生物法等，其中化學(xué)誘導(dǎo)法主要采用聚乙二醇（PEG）接合高Ca2+進行誘導(dǎo)。原生質(zhì)體再生后融合子的篩選主要是參照親本菌株不同標記型進行，通過設(shè)計實驗，淘汰親本菌株，獲得融合子。實驗二 乳酸菌篩選及抑菌作用研究一、實驗?zāi)康暮鸵螅?. 掌握乳酸菌分離純化的方法，并篩選1-2株具有廣譜抑菌效果的菌株。2. 了解乳酸菌的抑菌作用。二、儀器設(shè)備： GL-20G- 11冷凍離心機、萬分之一電子天平、不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器、冷藏冷凍箱、數(shù)顯恒溫水浴鍋、振蕩

28、培養(yǎng)箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱(20-600C)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(5-600C)、超凈工作臺、DM型電熱套、數(shù)碼相機 三、實驗材料：1樣品來源 以市售新鮮大白菜葉片或其他含乳酸菌材料為樣品來源。2培養(yǎng)墓采用改良的M17G培養(yǎng)基:胰蛋白陳5g，大豆蛋白陳5g,牛肉青5g，酵母膏，蔗糖5g，抗壞血酸, lmol/L硫酸鎂1mL,蒸餾水1000mL, pH6.8-7.0, 121滅菌15min。若配制固體培養(yǎng)基則向其中加入1.5%瓊脂。 另外，根據(jù)實際需要，需加入0.004%澳甲酚紫和15001U/mLJL酸鏈球菌素。乳酸乳球菌富集、發(fā)酵及斜面保藏：均采用改良的M17G培養(yǎng)基。指示菌培養(yǎng)基: 細菌

29、培養(yǎng)采用1.0%K2HP0;牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基:牛肉膏3g，蛋白陳log, NaCl 5g, K2HP04109，瓊脂15g,蒸餾水1000mL，自然pH, 121 0C滅菌20min；酵母菌培養(yǎng)采用1.0%K2HP04 YPG培養(yǎng)基:酵母膏l(xiāng)og蛋白陳20g;葡萄糖20g,K2HP04 log，瓊脂15g,蒸餾水1000mL, pH 7.0, 121 C滅菌20min；真菌培養(yǎng)采用1.0%K2HP04 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g,K2HP04 log，自來水1000mL, pH自然，121滅菌20min。3指示菌金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、枯草芽飽桿菌、蠟

30、狀芽抱桿菌、蘇云金芽抱桿菌,嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、釀酒酵母,熱帶假絲酵母、綠色木霉、番茄煤污尾孢霉等，選擇其中23種。4主要試劑抗壞血酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶，蛋白陳，胰蛋白膝、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、鹽酸，瓊脂，澳甲酚紫，七水硫酸鎂，氧化鈉、蔗糖、氫氧化鈉，乳酸鏈球菌素四、教學(xué)方法：講述、自查資料學(xué)習(xí)、討論。五、實驗內(nèi)容提要：乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是存在于人和動物腸道、許多食品、物料及少數(shù)臨床樣品中的一大類能發(fā)酵碳水化合物（主要為葡萄糖）產(chǎn)生大量乳酸的兼性厭氧菌。這是一群相當龐雜的細菌，目前至少可分為18個

31、屬，共有200多種，主要包括乳桿菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、片球菌（Pediococcus）、鏈球菌（Streptococcus）、腸球菌（Enterococcus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）和肉食桿菌（Carnobacterium）等屬。許多乳酸菌除產(chǎn)生乳酸、乙酸和雙乙酰外，還可產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，包括細菌素，PHA，環(huán)肽化合物等，特別是乳酸菌細菌素以其安全、高效、無毒副作用和無抗藥性等優(yōu)點，廣泛用于食品、醫(yī)藥、飼料等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。如在乳制品中，乳酸鏈球菌素已用于干酪、巴氏滅菌干酪、巴氏滅菌奶、罐藏

32、濃縮牛奶、高溫滅菌奶、高溫處理風(fēng)味奶、酸奶等；在肉制品中，使用乳酸鏈球菌索的有罐裝火腿、熏豬肉、成豬肉、香腸、真空包裝的新鮮牛肉等；在啤酒中，乳鏈球菌素在低pH值、含酒花物質(zhì)的環(huán)境下，活性不受影響，卻能夠有效的抑制啤酒中已發(fā)現(xiàn)的幾乎所有的革蘭氏陽性腐敗菌，從而提高啤酒的生物穩(wěn)定性。在醫(yī)藥應(yīng)用方面，乳酸菌素具有：抑菌作用，用于治療臨床上因消化不良引起的腹脹、腹瀉、胃腸炎等；改善腸道環(huán)境，能選擇性殺死腸道致病菌，保護和促進有益菌的生長，調(diào)節(jié)腸粘膜電解質(zhì)、水分平衡，調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡；提高免疫力，具有免疫調(diào)節(jié)作用，增強機體的特異性與非特異性免疫能力，激活吞噬細胞酶，刺激腸道產(chǎn)生IgA，增強機體的細胞

33、免疫和體液免疫，提高腸道免疫力；婦科陰道用藥，含乳酸菌活菌的陰道用制劑，其代謝產(chǎn)物乳酸和過氧化氫等物質(zhì)能保持陰道正常酸性環(huán)境乳酸菌可直接補充陰道內(nèi)正常生理細菌，調(diào)節(jié)陰道內(nèi)菌群平衡，抑制并消除陰道中的有害細菌的生長，故可用于由菌群紊亂而引起的細菌性陰道病的治療?；谌樗峋毦厣鲜鎏攸c，已經(jīng)引起廣大從事乳酸菌、食品添加劑、益生素及開發(fā)新藥等領(lǐng)域研究人員的極大興趣，出現(xiàn)了研究熱潮。目前的研究主要集中于新菌株和高產(chǎn)菌株的篩選以及對已知乳酸菌細菌素遺傳因子的鑒定及結(jié)構(gòu)基因的克隆和排序上。我國是一個乳酸菌資源非常豐富的國家，但對乳酸菌細菌素的研究起步較晚，除乳鏈球菌素（Nisin）外，對其他乳酸菌細菌素

34、還沒有進行很好的基礎(chǔ)研究和開發(fā)應(yīng)用研究，因而大力進行乳酸菌細菌素的研究尤其是生化、遺傳特性及基因調(diào)控方面的研究不僅具有重要的理論意義，且具有廣闊的應(yīng)用前景。乳酸菌主要從其自然生境（如各種泡菜、動物腸道、自然發(fā)酵飼料和奶制品等）中分離。分離時首先取樣，稀釋，涂布于乳酸菌分離培養(yǎng)基（BCP培養(yǎng)基），培養(yǎng)后挑取顏色變黃特征性菌落，多次劃線純化后保存于乳酸菌篩選培養(yǎng)基（改良MRS培養(yǎng)基）斜面試管中，然后通過菌落培養(yǎng)、鏡檢、生理生化及分子生物學(xué)實驗做鑒定，獲得純菌株。做抑菌測驗時，首先要進行液體培養(yǎng)獲得乳酸菌發(fā)酵液及指示菌菌懸液，然后選擇不同的方法如紙片法、牛津杯法及打孔法等測定抑菌作用。對于抑菌物質(zhì)的

35、初步鑒定，需要先排除酸和過氧化氫的干擾，可以采用過氧化氫酶、pH改變、碳酸鈣中和等方法進行。該實驗涉及到菌株的分離、純化與鑒定、菌株發(fā)酵條件優(yōu)化、抑菌作用檢測、抑菌物質(zhì)初步鑒定等內(nèi)容，可利用所學(xué)知識靈活設(shè)計。實驗三 香菇雜交育種一、實驗?zāi)康暮鸵螅?掌握雜交育種的方法和技術(shù) 2了解香菇育種的基本知識與內(nèi)容二、儀器設(shè)備： 培養(yǎng)皿、試管、容量瓶、錐形瓶、燒杯、離心管、吸管、顯微鏡、冰箱、細菌過濾器、微波爐、高壓滅菌鍋、超凈工作臺等。三、實驗材料：1菌種和培養(yǎng)基兩個不同交配型香菇菌株。可通過香菇子實體分離。PDA培養(yǎng)基，CYM培養(yǎng)基。2. 試劑瓊脂、酵母粉、蛋白胨、KH2PO4、K2HPO

36、4、MnSO4、葡萄糖、蔗糖、青霉素等。四、教學(xué)方法：講述、自查資料學(xué)習(xí)、討論。五、實驗內(nèi)容提要：香菇的育種離不開性和交配型。香菇的有性生殖(Sexuality)是雙因子控制的、異宗結(jié)合的。香菇的交配型由兩個不親和因子A和B控制著有性生殖的過程，其擔孢子具有四種交配型：A1B1、A2B2、A1B2和A2B1。只有A和B因子完全不同的單核體才能交配形成可育的雙核體菌株。香菇雜交育種方法包括：（1）香菇親本的選擇。待選擇的雙親必須同時具有較多的優(yōu)良性狀、較少的缺點。這樣雜交后，由于優(yōu)勢性狀的互補性，所得后代性狀易超出雙親性狀。雜交親本在來源上和生態(tài)型上要有較大的遺傳差異。這是因為親緣關(guān)系較遠的、不

37、同地理條件來源的親本雜交后，后代出現(xiàn)優(yōu)勢的機會大，易發(fā)生基因重組，出現(xiàn)超越雙親且適應(yīng)性更強的品種。雙親要具有較好的親和力，否則不能進行正常雜交。雙親之一最好是當?shù)卦耘喾N之一而另一個親本最好為野生親本。這樣的雙親性狀優(yōu)勢互補，雜交后抗雜性也會大大增強。（2）孢子的收集。親本選定后，在大型的出菇場選擇菇形完整的子實體，可采取彈射法或其他方法收集孢子。孢子收集后，稀釋分離于PDA培養(yǎng)基上，2周左右可見孢子萌發(fā)，這時挑出單個孢子置于試管中。（3）孢子的鏡檢。挑取的擔孢子培養(yǎng)一段時間后，挑取少許菌絲放在顯微鏡上檢查，無鎖狀聯(lián)合的菌絲為單孢子萌發(fā)的菌絲，挑出備用。淘汰有鎖狀聯(lián)合的菌絲。（4）單孢子的交配。

38、將雙親的單孢萌發(fā)得到的單核菌絲進行雜交，在PDA培養(yǎng)基平板上，接種塊相距左右。培養(yǎng)2周左右，見雙親菌絲己經(jīng)融合，挑出融合處菌絲進行鏡檢，有鎖狀聯(lián)合的雙核菌絲。再將雙核菌絲培養(yǎng)1周后，與雙親做拮抗試驗，培養(yǎng)一段時間后，見與雙親拮抗且拮抗處有明顯紅褐色的隔離帶的試管挑出。這個與雙親拮抗的菌絲即所得的雜交后代。（5）出菇試驗。將雜交后代母種擴繁成一、二級種，進行鍛木或代料栽培。觀察子實體出現(xiàn)的時間、大小、性狀、產(chǎn)量，隨時詳細記錄。每個雜交后代都有自己的生理特性和形態(tài)特征，例如對溫度、濕度、光照,pH等因素的關(guān)系，以及對木材的腐蝕性、出菇早晚、菇體大小等。通過對性狀調(diào)查和比較，選出綜合性狀超過CK(對

39、照)的雜交后代，經(jīng)過23年的重復(fù)試驗，產(chǎn)量性狀相對穩(wěn)定后，就可以請專家進行現(xiàn)場測試和審定，命名后就可以應(yīng)用于生產(chǎn)。實驗四 細菌營養(yǎng)缺陷型篩選一、實驗?zāi)康暮鸵螅?.學(xué)習(xí)并掌握酵母菌氨基酸營養(yǎng)缺陷型的誘變、篩選及鑒定方法。二、儀器設(shè)備： 離心機，紫外線照射箱，冰箱，恒溫箱，高壓滅菌鍋；三角燒瓶，試管，離心管，移液管，培養(yǎng)皿，接種針等。三、實驗材料：1菌種和培養(yǎng)基大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母菌。2試劑肉湯液體培養(yǎng)基，LE肉湯液體培養(yǎng)基，基本固體培養(yǎng)基，基本液體培養(yǎng)基，無N基本液體培養(yǎng)，2N基本液體培養(yǎng)基(成分及配制方法見后)。 20種基本氨基酸，7種微生素(硫胺素，核黃素，吡哆醇，泛酸，對氨基苯甲酸，煙堿酸，生物素)，嘌呤，嘧啶；亞硝酸鈉，青霉素鈉鹽，冰乙酸，乙酸鈉，氫氧化鈉，硫酸鎂，蔗糖；生理鹽水，0.1mol/L醋酸緩沖液(pH=4.0)，0.1mol/L NaOH。 混合氨基酸(包括核苷酸)共分7組：其中第到第VI組各有6種氨基酸(包括核苷酸)，每種氨基酸(包括核苷酸)等量研細充分混合；第VII組為脯氨酸，因容易潮解，故單獨組成。各組具體組成如下： I. 賴氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、嘌吟 II. 組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸(或甘氨酸)