微生物遺傳與分子生物學(xué)

1、微生物遺傳與分子生物學(xué)（5*15+1*25=100分）本課程主要涉及到微生物中主要的模式菌株:原核微生物: 放線菌(鏈霉菌),大腸桿菌,芽孢桿菌,乳酸菌，古菌等。真核微生物：漢遜酵母，釀酒酵母，白念珠菌等。第1章 概論基因的符號(hào)：每個(gè)基因：如色氨酸基因trp；同一表型的不同基因：如trpA或trpB等。當(dāng)染色體上發(fā)生缺失時(shí)可用表示（如trpA或trpA）；基因突變：如亮氨酸缺陷型leu-；抗藥性基因：r表示抗性，加s表示敏感如鏈霉素抗性基因表示為strr，敏感基因表示為strs。1、 微生物基因突變一般分幾種類(lèi)型,突變有什么生物學(xué)意義?（譚老師）基因突變可從突變發(fā)生方式和突變引起的表型改變和遺

2、傳物質(zhì)改變等方面進(jìn)行分類(lèi)。按突變體表型特征的不同，可把突變分為以下4個(gè)類(lèi)型:1). 形態(tài)突變型2). 生化突變型3). 致死突變型:按突變所引起的遺傳信息的改變，又可把突變分為：1). 錯(cuò)義突變 2). 同義突變3). 無(wú)義突變 根據(jù)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，可分為堿基置換、移碼、DNA片段插入和缺失。根據(jù)突變發(fā)生的方式，可分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。突變的生物學(xué)意義：基因突變導(dǎo)致了基因表達(dá)出來(lái)的性狀發(fā)生了改變，對(duì)突變個(gè)體本身來(lái)講，絕大多數(shù)是有害的，因?yàn)楝F(xiàn)有的生物基本上都適應(yīng)了現(xiàn)在的環(huán)境。但是環(huán)境是可變的，如果生物不變，那就很可能被淘汰。所以，對(duì)整個(gè)生物群體來(lái)說(shuō)，突變使群體不會(huì)滅亡。環(huán)境不斷改變，生物通

3、過(guò)不斷突變而適應(yīng), 也就使其被保存下來(lái)。最終，物種的面貌特征與祖先不同，所以說(shuō)，突變是生物進(jìn)化的內(nèi)因，是進(jìn)化的主要?jiǎng)恿Α?無(wú)數(shù)事實(shí)說(shuō)明了一個(gè)真理，即宇宙間的所有物種變是絕對(duì)的，不變則是相對(duì)的。2、 應(yīng)用于鏈霉菌基因組編輯與大片段DNA克隆的技術(shù)都有哪些？能否用在你們今后的實(shí)驗(yàn)中？（劉鋼老師） 基因組編輯是指在基因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到改造基因組的目的。鏈霉菌基因組編輯有：l I-SecI endonuclease介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)：敲除質(zhì)粒上含有一串

4、聯(lián)的與靶片段左右臂同源的兩個(gè)DNA片段以及I-SecI識(shí)別的18個(gè)堿基的位點(diǎn)（sceS）。將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌細(xì)胞，并通過(guò)抗性篩選質(zhì)粒插入到基因組上的克隆。如果發(fā)生同源單交換，該質(zhì)粒將被完整導(dǎo)入基因組靶位點(diǎn)。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)SecI，SecI在18個(gè)堿基的位點(diǎn)（sceS）切斷基因組DNA，菌體不能夠存活。如果發(fā)生同源雙交換， sceS被刪除，即使誘導(dǎo)表達(dá)SecI也不會(huì)造成基因組DNA的斷裂，菌體仍然存活，并表現(xiàn)出抗性敏感。l CRISPR-Cas9介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)：首先優(yōu)化cas9的密碼子，將其放置在強(qiáng)啟動(dòng)子之后并克隆到敲除質(zhì)粒上，敲除質(zhì)粒上含有sgRNA并置于組成型啟動(dòng)子之后， sgRNA中的引

5、導(dǎo)序列為靶位點(diǎn)的同源序列，敲除質(zhì)粒必須包括靶基因兩側(cè)的同源臂。將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將靶位點(diǎn)切斷，同時(shí)質(zhì)粒上的同源臂與基因組上的同源臂發(fā)生雙交換，將斷裂的靶基因區(qū)刪除，基因組重新連接。（CRISPR/Cas9系統(tǒng)先切斷靶序列后直接發(fā)生雙交換，最后斷裂的靶基因直接被敲除）l 位點(diǎn)特異性整合酶介導(dǎo)的基因組編輯：（cre/lox系統(tǒng)）利用兩次同源單交換分別將兩個(gè)loxP位點(diǎn)整合到目的基因片段的上下游，再將Cre蛋白表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌，在Cre蛋白的作用下，兩個(gè)loxP位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，完成目的基因片段的敲除。而環(huán)化的DNA由于不能在鏈霉菌中復(fù)制，隨著傳代而丟失。大片段D

6、NA克隆的技術(shù)：l 依賴(lài)于酵母菌的轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的大片段DNA重組克?。═AR）l 基于FBT1 attp-attB-int整合系統(tǒng)的鏈霉菌基因組DNA大片段克隆技術(shù)：通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒pSV:attB6Up導(dǎo)入鏈霉菌，卡那霉素篩選獲得pSV:attB6Up同源整合到目的位置的菌株S-attB6。再將pKC1139:attP6Dn導(dǎo)入S-attB6，在40度培養(yǎng)， pKC1139:attP6Dn通過(guò)同源單交換整合到目的位置獲得S-attB6P6。通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移將含有FBT1整合酶的pIJ10500導(dǎo)入S-attB6P6中，利用整合酶將目的基因簇環(huán)出，并克隆到載體pKC1139上。在今后的實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)用

7、到： 我們實(shí)驗(yàn)室是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，這些技術(shù)方法對(duì)于我今后的研究室有助益的。我們平時(shí)多采用基本的遺傳操作，構(gòu)建敲除質(zhì)粒載體，然后導(dǎo)入受體菌株進(jìn)行同源重組進(jìn)行單交換，利用抗生素進(jìn)行篩選，隨后還需要進(jìn)行雙交換。我們可以考慮使用基因編輯技術(shù)來(lái)進(jìn)行遺傳操做。比如應(yīng)用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的同源重組基因編輯技術(shù)來(lái)使之直接發(fā)生雙交換而直接敲除靶標(biāo)基因，這樣操作起來(lái)并不繁瑣，也省去了些過(guò)程，并且對(duì)是否發(fā)生雙交換也比較好判斷。3、 作為絲狀細(xì)菌的鏈霉菌經(jīng)歷一個(gè)怎樣的分化過(guò)程？對(duì)其自身有何意義？（劉鋼老師）作為絲狀細(xì)菌鏈霉菌的分化過(guò)程為：1，孢子萌發(fā)形成基質(zhì)菌絲；2，基質(zhì)菌絲延伸、分枝；（光禿表型）3，向空

8、氣中生長(zhǎng)形成氣生菌絲；4，氣生菌絲產(chǎn)生螺旋和分隔；（白表型）5，分隔加深形成孢子鏈；6，孢子鏈變灰，成熟；（灰表型）7，釋放游離孢子。 鏈霉菌的發(fā)育分化過(guò)程中有部分的基質(zhì)菌絲和未分化成為孢子的氣生菌絲存在有死亡現(xiàn)象，這些菌絲的死亡發(fā)生在鏈霉菌分化過(guò)程中的特定時(shí)間和區(qū)域。，首先是死亡的菌絲體并未顯示出PCD所特有的表觀特征，其次是死亡的菌絲體并未完全消失，保留的殘?bào)w既可以作為機(jī)械支撐用于氣生菌絲分化從而脫離培養(yǎng)基表面，同時(shí)也可作為水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸通道。 對(duì)其自身的意義：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，基質(zhì)菌絲經(jīng)過(guò)頂端生長(zhǎng)和分支，在感受到環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)限制或者其他壓力后，以應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，鏈霉菌通過(guò)bld基因級(jí)聯(lián)信

9、號(hào)通路產(chǎn)生疏水分子SapB，從而賦予菌絲表面疏水特性而使其突破培養(yǎng)基表面的氣-水張力進(jìn)入繁殖性的氣生菌絲階段，然后又通過(guò)whi基因等的級(jí)聯(lián)信號(hào)通路控制下產(chǎn)生孢子，孢子成熟后飄落到適宜的環(huán)境中在進(jìn)行上述過(guò)程生活。這種分化過(guò)程可以賦予鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫的能力。進(jìn)行生殖生長(zhǎng)產(chǎn)生氣生菌絲和孢子，成熟孢子隨風(fēng)或其他生物帶到更加適宜其生活的環(huán)境中，對(duì)于鏈霉菌自身是十分重要的生活方式，使之區(qū)別物其他的原核生物，所以這種發(fā)育分化過(guò)程對(duì)于鏈霉菌自身意義重大。鏈霉菌發(fā)育分化中的細(xì)胞死亡過(guò)程其生理學(xué)意義可能在于：當(dāng)鏈霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中感受到環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)限制或者其它壓力時(shí)，通過(guò)細(xì)胞死亡可為其孢子形成提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，伴隨著

10、基質(zhì)菌絲向氣生菌絲的轉(zhuǎn)變，鏈霉菌通常會(huì)在這一時(shí)期產(chǎn)生抗生素，這對(duì)于鏈霉菌專(zhuān)一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物可能具有重要的意義。鏈霉菌發(fā)育分化和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成一般都是起始于對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)匱乏的感應(yīng)。4、 鏈霉菌為什么會(huì)產(chǎn)生如此多樣性的次級(jí)代謝產(chǎn)物？他們對(duì)鏈霉菌本身有何意義？（劉鋼老師） 次級(jí)代謝產(chǎn)物通常是指不是生物體生長(zhǎng)發(fā)育所必需的分子量小于3KDa的小分子物質(zhì)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，次級(jí)代謝實(shí)際上參與了生物體對(duì)環(huán)境因子應(yīng)答等多種生理作用。廣泛意義上的抗生素囊括了幾乎所有的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在極低的濃度在生化水平調(diào)控微生物的生長(zhǎng)過(guò)程。 抗生素是逐步合成的代謝產(chǎn)物, 每一步都需要約10

11、 一30 個(gè)基因來(lái)決定其結(jié)構(gòu)和起自我保護(hù)作用抗性基因, 以及控制結(jié)構(gòu)基因活性的調(diào)控基因, 并使它們隨特性生存需要給予表達(dá); 這常常與活性營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和抱子形成之間的轉(zhuǎn)變相一致。鏈霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)其本身的意義：當(dāng)鏈霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中感受到環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)限制或者其它壓力時(shí)，伴隨著由基質(zhì)菌絲形成氣生菌絲，菌體周?chē)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，鏈霉菌開(kāi)始降解自身的基質(zhì)菌絲為形成繁殖型的氣生菌絲提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)各種次級(jí)代謝產(chǎn)物（抗生素）開(kāi)始產(chǎn)生，而次級(jí)代謝產(chǎn)物可以幫助鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫，從而創(chuàng)造利于自身生活的環(huán)境。這對(duì)于鏈霉菌專(zhuān)一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物可能具有重要的意義。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在極低的濃度下，可以在生

12、化水平調(diào)控微生物的生長(zhǎng)過(guò)程對(duì)菌體的生長(zhǎng)也具有重要的生物學(xué)意義?？股剡€具有抑制它種微生物生長(zhǎng)活動(dòng)、甚至殺滅它種微生物的能力，這就為鏈霉菌的生活創(chuàng)造了相對(duì)較好的條件。5、 調(diào)控基因在抗生素生物合成中有何主要功能？ 抗生素生物合成基因簇一般由調(diào)控基因、結(jié)構(gòu)基因和相關(guān)抗性基因組成，而且這些基因總是成簇排列。在抗生素生物合成中調(diào)控基因起到了一個(gè)開(kāi)關(guān)的作用, 它可決定一種抗生素能否被合成、什么時(shí)候合成和什么時(shí)候被終止的精細(xì)調(diào)控作用。1. 抗生素生物合成的途徑特異性調(diào)控：鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇通常成簇排列，包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)控基因，一般只負(fù)責(zé)調(diào)控所在基因簇基因表達(dá)的調(diào)控稱(chēng)之為途徑特異性調(diào)控。途徑

13、特異性調(diào)控蛋白如SARP蛋白，SARP蛋白都含有OmpR類(lèi)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，通過(guò)招募RNA聚合酶到靶基因的啟動(dòng)子上游激活基因的轉(zhuǎn)錄。大多數(shù)SARP蛋白都是途徑特異性調(diào)控子，一般只調(diào)控與其相鄰的基因。2. 全局性調(diào)控：相對(duì)于鏈霉菌次級(jí)代謝中的其他調(diào)控模式而言，全局調(diào)控是一種更為多樣、普遍、復(fù)雜的調(diào)控模式。全局調(diào)控基因可以調(diào)控多條次級(jí)代謝途徑。全局性調(diào)控蛋白對(duì)抗生素生物合成的調(diào)控通常是通過(guò)直接或間接地調(diào)控途徑特異性調(diào)控蛋白實(shí)施的。而除了調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成外，很多全局調(diào)控蛋白還控制著鏈霉菌的形態(tài)分化，還有一些能夠調(diào)控初級(jí)代謝，并成為初級(jí)代謝向次級(jí)代謝轉(zhuǎn)換的媒介。Eg. 雙組

14、份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、AdpA3. 抗生素生物合成的自調(diào)控-反饋調(diào)控和前饋調(diào)饋：（抗生素介導(dǎo)的自調(diào)控）反饋調(diào)控: 指一種微生物代謝反應(yīng)的終產(chǎn)物在代謝合成過(guò)程中對(duì)合成基因簇中調(diào)控基因或生化反應(yīng)關(guān)鍵酶基因的調(diào)控 (如抗生素)。前饋調(diào)控：指一種微生物代謝反應(yīng)的底物或中間物在代謝合成過(guò)程中對(duì)合成基因簇中調(diào)控基因或生化反應(yīng)關(guān)鍵酶基因的調(diào)控。l 抗生素作為終產(chǎn)物介導(dǎo)的自調(diào)控系統(tǒng)可取代雙組分系統(tǒng)中通過(guò)磷酸化作用的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制，并證明這種新調(diào)控機(jī)制在微生物次級(jí)代謝生物合成中是廣泛存在的。6、 鏈霉菌信號(hào)分子有哪幾種類(lèi)型, GBL類(lèi)型的信號(hào)分子在抗生素生物合成中如何發(fā)揮其功能? 菌群群體反應(yīng)感應(yīng)信號(hào)分子-當(dāng)信號(hào)分子達(dá)

15、到閾值-啟動(dòng)特定基因表達(dá)-改變和協(xié)調(diào)細(xì)胞間行為使群體呈現(xiàn)某種生理特征。鏈霉菌信號(hào)分子的類(lèi)型：高絲氨酸內(nèi)酯(HSL)、自誘導(dǎo)肽(AIP)、AI-2、-丁酸內(nèi)酯(GBL)、DSF、PQS、法尼醇等。目前研究得最多的群體感應(yīng)系統(tǒng)有以下四種：革蘭氏陰性菌中的?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)、革蘭氏陽(yáng)性菌中的自誘導(dǎo)肽(AIP)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)、呋喃硼酸二酯結(jié)構(gòu)的AI-2介導(dǎo)的種間群體感應(yīng)系統(tǒng)和-丁酸內(nèi)酯(GBL)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)。GBL類(lèi)型的信號(hào)分子在抗生素生物合成中發(fā)揮功能：鏈霉菌廣泛使用-丁酸內(nèi)酯（GBL）類(lèi)化合物作為自調(diào)控因子。GBL在胞內(nèi)合成并分泌到胞外，當(dāng)達(dá)到一定閾值濃度時(shí)，能

16、夠被胞內(nèi)的受體蛋白所感知，從而引起群體反應(yīng)(抗生素合成或產(chǎn)孢)。信號(hào)分子（A因子GBL）的受體蛋白ArpA與多效調(diào)空基因adpA的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合, 阻遏了adpA的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)A因子（GBL）積累到閾值時(shí)，它與ArpA結(jié)合，使ArpA從adpA上解離，導(dǎo)致adpA有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。翻譯后的AdpA控制鏈霉素生物合成基因簇中調(diào)控基因strR的轉(zhuǎn)錄, StrR激活strB1開(kāi)始的這個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的基因轉(zhuǎn)錄, 從而調(diào)控鏈霉素的生物合成。7、 有哪些方法或策略可以得到新型抗生素?1. 更多鏈霉菌基因組的測(cè)序及挖掘：隨著更多鏈霉菌基因組的不斷完成和信息積累, 為抗生素生物合成基因簇的研究，發(fā)現(xiàn)新型抗生素提供了重要的

17、條件。大量的鏈霉菌尚未測(cè)序，這極大地影響了新型抗生素的發(fā)現(xiàn)。每個(gè)基因組平均含有20-30個(gè)左右次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，大多數(shù)是未知的，這將是發(fā)現(xiàn)新型抗生素的龐大資源。2. 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：微生物只能在適合的條件下生長(zhǎng)和繁殖。不同的營(yíng)養(yǎng)（如不同的碳源和氮源等）條件導(dǎo)致不同的生理代謝。次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成是與前體的提供和相關(guān)因子的誘導(dǎo)密切相關(guān)的。同時(shí)，相關(guān)菌株的共同培養(yǎng)可以提供互補(bǔ)的重要物質(zhì)和信息交流，這為隱性次級(jí)代謝基因簇的激活提供了可能的條件。3. 調(diào)控子的遺傳操作：隱性次級(jí)代謝基因簇在受阻遏和缺乏激活因子的情況下不能得到表達(dá)，去除負(fù)調(diào)控基因的阻遏和構(gòu)建正調(diào)控基因的有效表達(dá)是激活隱性次級(jí)

18、代謝基因簇表達(dá)的策略之一。此外，對(duì)轉(zhuǎn)錄單元中啟動(dòng)子的替換和定向改造也是隱性次級(jí)代謝基因簇激活的有效方法。4. 基因簇的異源表達(dá)：為了消除菌株本身的一些限制因素，進(jìn)行隱性次級(jí)代謝基因簇的異源表達(dá)也是值得嘗試的方法。5. 信號(hào)分子介導(dǎo)的激活：-丁酸內(nèi)酯（GBL）作為放線菌的信號(hào)分子，通過(guò)與相應(yīng)的受體蛋白相互作用，進(jìn)而激活多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。除GBL外, 在抗生素生物合成中信號(hào)分子具有多樣性和多效性, 如抗生素本身可作為信號(hào)分子, ATP和肌醇等可作為信號(hào)分子參與抗生素的生物合成和形態(tài)分化的分子調(diào)控。發(fā)現(xiàn)新信號(hào)分子，研究其在抗生素產(chǎn)生和種間交流中的作用機(jī)制；同時(shí)可用于激活隱性基因簇；探索抗生

19、素作為信號(hào)分子在自然生境中的生物學(xué)功能。6. 核糖體工程：在鏈霉菌中，核糖體蛋白S12的突變同樣可以影響抗生素的產(chǎn)量。7. 其他新方法和策略未來(lái)可能的突破：以鏈霉菌為模式，進(jìn)一步闡明抗生素生物合成與調(diào)控機(jī)制，為提高重要抗生素的產(chǎn)量乃至激活隱基因簇，挖掘新型活性次級(jí)代謝產(chǎn)物方面做出創(chuàng)新性的研究成果 ；深入開(kāi)展抗生素的組合生物合成和合成生物學(xué)的研究，突破天然產(chǎn)物合成過(guò)程中的瓶頸，獲得在結(jié)構(gòu)和功能上具有突出特點(diǎn)的新型活性化合物。第四章 大腸桿菌 芽孢桿菌 棒桿菌 乳酸菌8、 結(jié)合大腸桿菌（致病和非致?。┑募?xì)胞結(jié)構(gòu)特征及其生物大分子的生物合成規(guī)律，簡(jiǎn)述若干種藥物研發(fā)的策略。1、藥物研發(fā)策略：生產(chǎn)某種物

20、質(zhì)，綜合策略： 拓展底物利用能力和范圍（“進(jìn)”） 加快產(chǎn)物轉(zhuǎn)到胞外（“出”） 加強(qiáng)目標(biāo)合成酶活性（“加”） 減少分支合成途徑（“減”） 引入新的合成途徑，或延伸已有途徑（“增”） 改善細(xì)胞的耐受性定向遺傳修飾利用大腸桿菌合成相關(guān)藥物：A、 大腸桿菌產(chǎn)生蛋白類(lèi)藥物 ：優(yōu)先選用的蛋白藥物表達(dá)宿主，即利用上述的策略來(lái)進(jìn)行定向遺傳改造而合成蛋白類(lèi)藥物。首先，利用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源質(zhì)粒，構(gòu)建包含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒載體，也可以將其導(dǎo)入到大腸桿菌中通過(guò)同源重組過(guò)程整合到其染色體上進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。我們可以改進(jìn)大腸桿菌的分泌系統(tǒng)，從而加速其產(chǎn)生的生物大分子蛋白質(zhì)排除體外的效率。從而合成生物大分子蛋白質(zhì)類(lèi)藥

21、物。B、 大腸桿菌細(xì)胞高產(chǎn)抗癌藥物前體-紫杉醇(taxol)前體taxadiene。Taxol是萜類(lèi)化合物（三環(huán)二萜），含異戊二烯類(lèi)單元。天然的大腸桿菌的MEP途徑可合成其中2個(gè)前體異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。因此，上游模塊：增加整個(gè)MEP途徑的拷貝數(shù)；在染色體中引入T7 RNA 聚合酶，并在限速酶前引入T7啟動(dòng)子；通過(guò)不同質(zhì)粒的引入和改變啟動(dòng)子強(qiáng)度來(lái)協(xié)調(diào)不同基因的拷貝數(shù)以及表達(dá)量；將合成酶基因整合到染色體上，減小代謝負(fù)擔(dān)。下游模塊：改變GGPS和TS兩個(gè)合成基因的順序；通過(guò)啟動(dòng)子更換以及改造，協(xié)調(diào)基因的表達(dá)量；去除代謝抑制子indole。多位點(diǎn)協(xié)調(diào)上下游兩個(gè)模塊

22、，使前體生物大分子taxadiene的產(chǎn)量提高了約15000倍，達(dá)到1.0 g/L 。C、輔因子工程：降低細(xì)胞內(nèi)的能量水平能顯著提高酵解速度。ATP, NADH/NAD+, NADPH/NADP+等輔因子參與很多重要胞內(nèi)代謝過(guò)程，其水平及比例可導(dǎo)致微生物代謝及生理發(fā)生全局變化。與生物大分子的合成相關(guān)， NADPH/NADP+增加有利于生物大分子的合成。厭氧高產(chǎn)正丁醇 還原力驅(qū)動(dòng)：產(chǎn)生1*丁醇需要4*還原力改造方法：敲除3個(gè)消耗NADH的途徑，使NADH的含量為4； 敲除產(chǎn)生乙酸的途徑，節(jié)約了1分子前體乙酰輔酶A。綜合改造后生物大分子的產(chǎn)量提高了100多倍。作用于致病大腸桿菌的藥物的研發(fā)：D、外

23、排泵的抑制子作為潛在的藥物靶標(biāo)：TetR類(lèi)抑制子控制本底水平的外排泵AcrA和AcrB的表達(dá)； AraC類(lèi)的激活子能解除TetR的抑制，使外排泵大量表達(dá)； MarR類(lèi)的抑制子能夠抑制AraC的轉(zhuǎn)錄，間接影響外排泵表達(dá)。抗生素或小分子與抑制子結(jié)合，減弱其與靶標(biāo)DNA的結(jié)合，從而解除其對(duì)激活子抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)下游外排泵的高表達(dá)。從以上的外排泵的調(diào)控方式可以知道，抑制子能夠減弱外排泵的表達(dá)，從而降低菌株對(duì)藥物的耐受性，使其容易被殺死。例如，篩選能夠結(jié)合抑制子RamR的小分子（藥物），使其對(duì)激活子RamA的抑制作用加強(qiáng)，從而降低外排泵的表達(dá)而降低細(xì)菌的抗性。由RamR和小分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵殘基P

24、he155，從而有助于篩選與其結(jié)合的潛在藥物。D、轉(zhuǎn)肽酶：這些酶大多是藥物的潛在作用靶點(diǎn)，對(duì)其結(jié)構(gòu)-功能的研究是熱點(diǎn)。例如，青霉素可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合轉(zhuǎn)肽酶，導(dǎo)致肽橋不能形成而抑制 細(xì)胞生長(zhǎng)。從而可以篩選其他可以與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合的藥物來(lái)開(kāi)發(fā)新藥物。E、抗生素作用的靶標(biāo)或抗性菌株突變的位點(diǎn)：例如，萬(wàn)古霉素作用位點(diǎn)為雙丙氨酰，抑制細(xì)胞壁的合成 而其對(duì)應(yīng)的耐藥菌株末尾的丙氨酸突變?yōu)槿樗帷?2、細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征：細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有成形的細(xì)胞核；含有質(zhì)粒；基因組或質(zhì)粒上含有“致病島” 它是一段特殊的DNA片段，包含毒素分泌系統(tǒng)，粘附素等，能夠在菌株和相近種之間轉(zhuǎn)移。大腸桿菌大部分是無(wú)害的，與宿主互利共生。部分通過(guò)獲得毒素因子適

25、應(yīng)新環(huán)境或?qū)е录膊　：杏呻木厶墙M成的細(xì)胞壁；只含有核糖體簡(jiǎn)單的細(xì)胞器；革蘭氏陰性(G-)短桿菌, 兩端鈍圓；大小1.0 1.5 m × 2.0 6.0 m；周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，有菌毛。毒性因子：菌毛：大多由質(zhì)粒編碼，成束狀，起粘附宿主作用。腸毒素：外毒素，分為耐熱和不耐熱。 耐熱型：免疫原性弱，100, 20 min不破壞； 不耐熱型：免疫原性強(qiáng)， 65, 30 min破壞； 類(lèi)脂A：內(nèi)毒素，熱穩(wěn)定（ 100, 1 h不破壞）。莢膜多糖：抗吞噬作用3、大腸桿菌生物大分子的生物合成規(guī)律：l 生物大分子主要是指蛋白質(zhì)、核酸以及高相對(duì)分子量的碳?xì)浠衔铩Ｅc低相對(duì)分子量的生物有機(jī)化合物相比，

26、生物大分子具有更高級(jí)的物質(zhì)群。它們是由低相對(duì)分子量的有機(jī)化合物經(jīng)過(guò)聚合而成的多分子體系。從化學(xué)結(jié)構(gòu)而言，蛋白質(zhì)是由-L-氨基酸脫水縮合而成的；核酸是由嘌呤和嘧啶堿基與糖D-核糖或2-脫氧-D-核糖、磷酸脫水縮合而成；多糖是由單糖脫水縮合而成。由此可知,由低相對(duì)分子量的生物有機(jī)化合物變?yōu)樯锎蠓肿拥幕瘜W(xué)反應(yīng)都是脫水縮合反應(yīng)。l 生物大分子合成前相應(yīng)基本結(jié)構(gòu)單元需要活化，活化后的分子具有高能量，便于后續(xù)合成反應(yīng)。Eg. 以葡萄糖為原料合成糖原時(shí)需要經(jīng)UTP活化為UDPG，以乙酰-CoA為原料合成脂肪酸需要ACP活化為丙二酰-CoA，以氨基酸為原料合成蛋白質(zhì)時(shí)需tRNA活化為氨酰-tRNA，以核苷酸

27、或脫氧核糖核氨酸（NMP,dNMP）為原料合成核酸時(shí)活化為核苷三磷酸(NTP,dNTP)。l 生物大分子的合成都需要酶，都需要溫和的反應(yīng)條件。9、 Bacillus cereus group的概念，包括哪些種？簡(jiǎn)述種內(nèi)間的聯(lián)系與區(qū)別。Bacillus cereus group均為能夠形成孢子的菌株，基因及基因組序列數(shù)據(jù)顯示其種間密切相關(guān)，即染色體具有很高的的相似性和共線性，甚至被認(rèn)為屬于相同的種，其包含6個(gè)不同的種：1) B. cereus sensu stricto: 狹義的蠟狀芽孢桿菌，廣泛存在于土壤中，能引起食品污染，導(dǎo)致人類(lèi)嘔吐和腹瀉，并且有些菌株能引起軟組織感染的機(jī)會(huì)致病菌。2) B

28、. anthracis: 可引起炭疽熱，被用于生物武器； 3) B. thuringiensis: 能產(chǎn)生殺蟲(chóng)晶體蛋白，被用作重要的微生物殺蟲(chóng)劑； 4) B. mycoides: 腐生細(xì)菌，能夠形成根狀菌落； 5) B. pseudomycoides與B. weihenstephanensis: 放射狀的菌落形態(tài)，脂肪酸的組成與群中其他菌不同； 6) B. cytotoxicus: 最新從蠟狀芽孢桿菌中分離出來(lái)，主要與食物中毒有關(guān)，在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上與蠟狀芽孢桿菌群里其他成員較遠(yuǎn)。Bacillus cereus group種間聯(lián)系與區(qū)分： 雖然Bacillus cereus group種間染色體

29、具有很高的相似性和共線性，但是其包含幾百個(gè)菌株，也顯示了很高的基因異質(zhì)性及菌株特異的基因組適應(yīng)性，比如有些蠟狀芽胞桿菌具有跟炭疽芽胞桿菌類(lèi)似的特征，包括其致病性，但是并不含有與后者完全一樣的質(zhì)粒。 蠟狀芽孢桿菌群種間的區(qū)分依據(jù)： 一般蠟狀芽胞桿菌群不同種之間的主要區(qū)分標(biāo)志是其表型，特別是對(duì)于B. cereus sensu stricto，B. anthracis，B. thuringiensis，這些表型的差異往往由位于質(zhì)粒上的遺傳物質(zhì)所決定： a. 炭疽芽孢桿菌引起炭疽熱的毒力因子基因主要位于兩個(gè)大質(zhì)粒上，pXO1和pXO2，這兩個(gè)質(zhì)粒對(duì)于炭疽芽胞桿菌的致病至關(guān)重要,也是其區(qū)別于其他成員的主

30、要特征。a. 蘇云金芽胞桿菌主要特征是在芽胞形成的同時(shí)產(chǎn)生伴胞晶體即-內(nèi)毒素,而編碼這些晶體蛋白的基因主要位于質(zhì)粒上。b. 蠟狀芽胞桿菌合成嘔吐毒素的基因位于一個(gè)大質(zhì)粒上。 c. B. cereus group中的質(zhì)粒：1) 是非常重要的形態(tài)因子，如B. thuringiensis的晶體毒蛋白基因與B. anthracis的炭疽毒素基因均位于質(zhì)粒元件上。2) B. cereus group中，質(zhì)粒普遍存在，單個(gè)菌種可能含有6個(gè)不同的質(zhì)粒。3) 質(zhì)粒大小變化也很大，從2kb到大于600kb，且不同菌株的質(zhì)粒譜型并不總與其系統(tǒng)發(fā)育相匹配。4) 在B. cereus群的進(jìn)化過(guò)程中，質(zhì)粒是染色體的延伸

31、，質(zhì)粒和染色體之間基因交換頻繁，有利于菌株得以生存于不同的多變的環(huán)境之中。10、 在芽孢桿菌生物膜形成過(guò)程中，最主要的抑制子是什么？簡(jiǎn)述其是如何被解除并促進(jìn)生物膜的形成的。形成生物膜是芽孢桿菌在自然環(huán)境中形成有利條件維持生存的一種群體性行。生物膜形成過(guò)程中的最主要抑制子：SinR，它是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，可以抑制基質(zhì)形成基因的表達(dá)，也可以促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，因此形成生物膜需抑制SinR蛋白的表達(dá)。破解并促進(jìn)生物膜形成的過(guò)程：抗阻遏蛋白SinI可拮抗SinR活性。通過(guò)對(duì)環(huán)境的感知，芽孢桿菌種控制孢子形成的雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中磷酸化的應(yīng)答調(diào)控蛋白（RR）轉(zhuǎn)錄調(diào)控子Spo0A可以激活SinI基因

32、表達(dá)，從而產(chǎn)生抗阻遏蛋白SinI，通過(guò)與SinR的結(jié)合來(lái)降低SinR濃度，從而使細(xì)胞喪失運(yùn)動(dòng)性而形成細(xì)胞鏈并產(chǎn)生基質(zhì)，刺激感受態(tài)形成，最終促進(jìn)生物膜的形成。11、 簡(jiǎn)述芽孢桿菌感受態(tài)形成過(guò)程中關(guān)鍵調(diào)控子ComK的作用（降解及釋放的過(guò)程）。 感受態(tài)的形成主要包括三個(gè)過(guò)程：群感效應(yīng)系統(tǒng)，主要調(diào)控子ComK的激活，ComK激活下游感受態(tài)相關(guān)基因。在B. subtilis感受態(tài)形成過(guò)程中DNA結(jié)合、攝取及重組相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄都是受到感受態(tài)調(diào)控子ComK的調(diào)控，ComK直接或間接調(diào)控的基因多達(dá)100個(gè)。1 ComK的自激活循環(huán)ComK的自激活循環(huán)是形成感受態(tài)的關(guān)鍵步驟，ComK以二聚體組成的四聚物形式結(jié)合

33、于各啟動(dòng)子上，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，包括自身基因。2 ComK的抑制： ComK在自激活循環(huán)后，轉(zhuǎn)錄被激活并翻譯ComK，但是合成的ComK與MecA結(jié)合， MecA募集ComK結(jié)合到蛋白酶ClpCP，使ComK被降解，從而無(wú)法調(diào)控感受態(tài)的形成。3 ComK的釋放： 群感效應(yīng)信號(hào)分子ComX及CSF可以促使ComAP的水平升高， ComAP能夠促進(jìn)表面活性素surfactin基因簇的轉(zhuǎn)錄，而位于此基因簇上的comS同時(shí)被轉(zhuǎn)錄。ComS是46個(gè)氨基酸的小肽，可以與MecA結(jié)合使ComK從ComK / MecA /ClpC復(fù)合物上釋放，而ComS及MecA被ClpCP降解。 4 ComK激活下游基因：

34、當(dāng)ComK濃度足夠高，ComK可激活DNA攝取基因（comC,-E,-G,-F)、DNA整合基因（recA，addAB）及自身基因comk的表達(dá)。綜上所述，ComK在感受態(tài)的形成過(guò)程中起到了承上啟下的作用。12、 簡(jiǎn)述納豆激酶產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路。納豆激酶(NK)是芽孢桿菌分泌酶: 可溶解血纖維蛋白，有顯著的溶栓的作用，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。通過(guò)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)，利用(NH4)2SO4沉淀、Sephadex G100柱層析對(duì)該酶發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，已經(jīng)分離純化出了枯草芽孢桿菌溶栓酶。 納豆激酶產(chǎn)品開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路：納豆激酶的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)是以納豆為原料，接種納豆芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，分離純化而得到

35、的。納豆激酶的分離純化粗提方法即是將發(fā)酵液或納豆浸提液離心取上清，用硫酸銨或乙醇沉淀，再經(jīng)離心除去上清液中的粘性物質(zhì)，離心后取沉淀，溶于緩沖液中即為粗酶液。隨后將粗酶液進(jìn)行精提，將粗酶液進(jìn)行脫鹽，離子交換，柱層析，透析，最后冷凍干燥制得酶干粉?？梢岳梅肿由飳W(xué)技術(shù)在L.lactis中表達(dá)納豆激酶：這種方式大大加快了納豆激酶的生產(chǎn)效率。在乳酸菌中表達(dá) nisK/R（納豆激酶基因）, 目的基因用nisA 啟動(dòng)子控制，在nisin作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)時(shí)目的基因表達(dá)。這個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)稱(chēng)為NICE系統(tǒng)。此系統(tǒng)可嚴(yán)謹(jǐn)控制、高效表達(dá)，是很成熟的乳酸菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)。Nisin是食品級(jí)的安全誘導(dǎo)物，可直接應(yīng)用的

36、食品中；少量nisin即可誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。 首先，構(gòu)建含有納豆激酶基因的質(zhì)粒載體，將質(zhì)粒載體導(dǎo)入到L.lactis中，在培養(yǎng)液中加入淡豆豉，誘導(dǎo)納豆激酶的表達(dá)。最后優(yōu)化培養(yǎng)條件，最終得到商品化的納豆激酶產(chǎn)品。最終，納豆激酶的分離純化過(guò)程比較繁瑣，但目前并沒(méi)有特別簡(jiǎn)易的方法，有研究者研究過(guò)以下方法：鹽析法分離提純納豆激酶，超濾法分離提純納豆激酶等，但我覺(jué)得這些方法就目前的研究水平還不適合大規(guī)模生產(chǎn)的應(yīng)用。13、 B. subtilis分泌蛋白有哪4種不同途徑，簡(jiǎn)述每種途徑分泌蛋白過(guò)程及所分泌蛋白特點(diǎn)。B. subtilis分泌蛋白有四種不同途徑蛋白特點(diǎn)及分泌過(guò)程： l Sec-SRP coo

37、peration pathway: 絕大多數(shù)蛋白通過(guò)Sec-SRP 途徑運(yùn)輸；轉(zhuǎn)運(yùn)未折疊的蛋白質(zhì)。 B. subtilis中最主要的蛋白質(zhì)分泌途徑，可以分為3個(gè)功能階段：蛋白定位：分泌蛋白首先由核糖體合成前體，前體蛋白在N-端含有信號(hào)肽；細(xì)胞質(zhì)分子伴侶可以幫助前體蛋白保持能夠被遷移的狀態(tài)； SRP與信號(hào)肽相互識(shí)別，將前體定位于膜上的Sec易位酶復(fù)合物。蛋白易位：信號(hào)肽帶正電荷的N-domain與膜上負(fù)電荷的磷脂相互作用，導(dǎo)致H-domain彎曲地插入膜上，當(dāng)H-domain變直之后，前體蛋白的第一部分被拉至胞外。蛋白的折疊及釋放：在易位過(guò)程中或易位之后的瞬間，信號(hào)肽被type I Spases

38、切除，使成熟肽從Sec易位酶復(fù)合物上釋放；最后，胞外分子伴侶參與分泌蛋白的折疊及質(zhì)量控制。l twin-arginine translocation (Tat)pathway: 相較于Sec-SRP 途徑，Tat 途徑可以從B.subtilis的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)緊密折疊的蛋白甚至多聚酶復(fù)合物到培養(yǎng)基中。分泌蛋白至培養(yǎng)基、細(xì)胞壁及插入蛋白至細(xì)胞質(zhì)膜。Tat 途徑的信號(hào)肽：轉(zhuǎn)運(yùn)已折疊好的蛋白。Tat 途徑的蛋白分泌過(guò)程：Ø具有RR/KR類(lèi)型信號(hào)肽的前體蛋白在易位之前可以在輔因子的幫助下在細(xì)胞質(zhì)中折疊； Ø前體蛋白可以通過(guò)Tat蛋白復(fù)合物(Tat易位酶)組成的通道而穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜； &#

39、216;在轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中，經(jīng)過(guò)信號(hào)肽酶和細(xì)胞壁通道的加工，折疊的成熟蛋白分泌至培養(yǎng)基中。l ATP-binding cassette (ABC) transporters: 在真核、原核生物中發(fā)現(xiàn)，既可輸出也可輸入各種分子，如離子、氨基酸、肽、抗生素、多糖及蛋白質(zhì)等。1) 與核糖體合成的羊毛硫細(xì)菌素(lantibiotics)和信息素(pheromone)合成有關(guān)2) lantibiotics or pheromones的信號(hào)肽叫做前導(dǎo)肽，lantibiotics的前導(dǎo)肽大概有23-30個(gè)氨基酸殘基，與lantibiotics的翻譯后修飾有關(guān)。l pseudopilin export pathw

40、ay: 感受態(tài)形成相關(guān)。假菌毛蛋白通過(guò)Com系統(tǒng)運(yùn)輸。14、 Bt菌株在孢子形成期及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期分別形成哪些不同的殺蟲(chóng)毒素，簡(jiǎn)述Cry蛋白殺蟲(chóng)機(jī)制。Bt 在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可產(chǎn)生多種對(duì)昆蟲(chóng)有致病性的殺蟲(chóng)毒素： l 在孢子形成開(kāi)始和穩(wěn)定生長(zhǎng)期：Bt菌株合成 Cry和 Cyt 毒素，即-內(nèi)毒素或伴孢晶體毒素； l 在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期：Bt 菌株也可以合成其他的殺蟲(chóng)蛋白，這些蛋白會(huì)被分泌至培養(yǎng)基中，并被定義為Vip和Sip。Vip與Sip毒素都顯示了對(duì)一些鞘翅目昆蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性。Cry（伴孢晶體）蛋白殺蟲(chóng)機(jī)制：孔洞形成模型Step1：在堿性的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸，可溶的非活性復(fù)合物Cry1A被蛋白酶消化，形成活性的蛋白

41、酶抗性的三域結(jié)構(gòu)的單體； Step2: Cry1A低親和力、大量地結(jié)合被GPI錨定受體錨定在膜脂上的APN和ALP受體，這種結(jié)合方式促進(jìn)了活性toxins定位與富集；Step3-4：與鈣粘素受體的結(jié)合促進(jìn)了N-末端helix 1的蛋白切除； Step5：N-末端的切除誘導(dǎo)了前孔洞寡聚物的形成并且增強(qiáng)了寡聚物與GPI錨定在膜脂上的APN和ALP受體的親和力； Step6：寡聚物插入細(xì)胞膜，導(dǎo)致孔洞形成與細(xì)胞裂解。最終使害蟲(chóng)無(wú)法存活，達(dá)到殺蟲(chóng)的目的。15、 結(jié)合谷氨酸棒桿菌中谷氨酸生物合成途徑、代謝調(diào)控、基因組轉(zhuǎn)錄組信息及其對(duì)環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制，闡述提高谷氨酸產(chǎn)量的可能途徑或方法。谷氨酸生物合成途徑以

42、及代謝途徑：谷氨酸生物合成：三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生-酮戊二酸，當(dāng)-KGA（ -酮戊二酸）脫氫酶酶活性微弱或喪失時(shí)， -酮戊二酸會(huì)在NADPH和NH4+ 在谷氨酸脫氫酶作用下，合成谷氨酸，而不會(huì)生成琥珀酸，脫離三羧酸循環(huán)而生成谷氨酸，最后透過(guò)細(xì)胞膜分泌到胞外。內(nèi)在因素谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征 l 具有CO2 固定反應(yīng)的酶系：菌種能利用CO2產(chǎn)生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸大量積累。 l -KGA（ -酮戊二酸）脫氫酶酶活性微弱或喪失：這是菌體生成并積累-KGA的關(guān)鍵。-KGA是菌體進(jìn)行TCA循環(huán)的中間性產(chǎn)物，很快在-KGA脫氫酶的作用下氧化脫羧生成琥珀酸輔酶A，在正常的微生物體內(nèi)濃度很低，只有當(dāng)體內(nèi)-K

43、GA脫氫酶活性很低時(shí)，TCA循環(huán)才能夠減弱，-KGA才得以積累，為谷氨酸的生成奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。 l 谷氨酸產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH氧化能力欠缺或喪失：NADPH是-KGA還原氨基化生成谷氨酸的必須物質(zhì)，該還原氨基化所需要的NADPH與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián)。 由于NADPH的氧化能力欠缺或喪失，使得體內(nèi)的NADPH有一定積累，NADPH對(duì)于抑制-KGA的脫羧氧化有一定的意義。 l 菌體有強(qiáng)烈的L-谷氨酸脫氫酶活性： L-谷氨酸脫氫酶，谷氨酸產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的酶活性都很強(qiáng)， - 酮戊二酸易生成谷氨酸。 該反應(yīng)的關(guān)鍵是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián)l 產(chǎn)生菌體內(nèi)乙醛酸循環(huán)（DCA）的關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶：該酶是

44、一種調(diào)節(jié)酶，或稱(chēng)為別構(gòu)酶，其活性可以通過(guò)某種方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過(guò)該酶酶活性的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉，DCA 循環(huán)的封閉是實(shí)現(xiàn)谷氨酸發(fā)酵的首要條件。糖的代謝才能沿著- 酮戊二酸的方向進(jìn)行, 從而有利于谷氨酸的積累。 外在因素l 供氧濃度過(guò)量：NADPH的再氧化能力會(huì)加強(qiáng)，使-KGA的還原氨基化受到影響，不利于谷氨酸的生成。供氧不足：積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于谷氨酸的產(chǎn)生，同時(shí)，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。因此當(dāng)供氧量合適的時(shí)候，才有助于谷氨酸的合成，過(guò)多或多少都不利于谷氨酸的合成。l NH4+濃度： 影響到發(fā)酵液的pH值 與產(chǎn)物的形成有關(guān)：N

45、H4+過(guò)量，菌體增殖階段會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，產(chǎn)酸階段 Glu會(huì)受谷氨酰胺合成酶作用轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺（ Gln） NH4+不足，不利于 -KGA的還原氨基化， -酮戊二酸積累，引起反饋調(diào) 節(jié)。 l 磷酸鹽過(guò)量： 促進(jìn)EMP途徑，打破EMP與TCA之間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等； 產(chǎn)生并積累纈氨酸（ Val） 因此，在發(fā)酵過(guò)程中,要嚴(yán)格控制NH4+ 和磷酸鹽的含量 。l 發(fā)酵液的碳氮比 ：發(fā)酵液中糖含量與谷氨酸的發(fā)酵有密切的關(guān)系。在一定范圍內(nèi), 谷氨酸的產(chǎn)量隨糖含量的增加而增加, 但糖含量過(guò)高, 滲透壓過(guò)大, 對(duì)菌體生長(zhǎng)不利, 谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率低。l 生物素：當(dāng)生物素過(guò)量時(shí),菌體生長(zhǎng)繁殖快,谷氨酸

46、合成途徑受阻,發(fā)酵液中由菌種細(xì)胞排出的谷氨酸僅能占氨基酸總量的12%；生物素適量時(shí),菌體代謝失調(diào),細(xì)胞膜通透性增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸能及時(shí)排出,有利于谷氨酸的積累。 因此,要根據(jù)發(fā)酵時(shí)期來(lái)控制生物素的含量。l 發(fā)酵溫度 ：谷氨酸發(fā)酵前期應(yīng)采取菌體生長(zhǎng)最適溫度,即3032 。 溫度過(guò)低, 菌體生長(zhǎng)繁殖慢;若溫度過(guò)高,菌體易衰老, 生產(chǎn)中表現(xiàn)為O D值增長(zhǎng)慢, 耗糖慢, pH值高, 最終發(fā)酵周期長(zhǎng),產(chǎn)酸少。 發(fā)酵中、后期菌體生長(zhǎng)基本停止, 為積累大量谷氨酸, 應(yīng)適當(dāng)提高發(fā)酵溫度,但溫度過(guò)高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。 l pH值 ：pH值影響谷氨酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng) pH：前期pH（7.5-8.0），中后

47、期pH7.0-7.6。通過(guò)采用流加尿素，氨水或液氨等辦法調(diào)節(jié)pH，補(bǔ)充氮源。 l 泡沫 ：谷氨酸發(fā)酵是好氣性發(fā)酵, 因通風(fēng)和攪拌產(chǎn)生泡沫是正常的, 但泡沫過(guò)多會(huì)帶來(lái)一系列問(wèn)題: (1) 泡沫形成泡蓋時(shí), 代謝產(chǎn)生的氣體不能及時(shí)排出,妨礙菌體呼吸作用,影響菌體的正常代謝; (2) 泡沫過(guò)多, 發(fā)酵液會(huì)外溢,造成浪費(fèi)和污染; (3) 泡沫過(guò)多,易沖上罐頂,造成染菌。因此,在谷氨酸的發(fā)酵過(guò)程中控制好過(guò)多的泡沫是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。 （也就是說(shuō)谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征 ：-酮戊二酸氧化能力微弱:；-酮戊二酸脫氫酶喪失或活性低；谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)；還原性輔酶(NADPH+H+)進(jìn)入呼吸鏈能力缺陷或微弱；異檸檬

48、酸裂解酶活力微弱；不利用谷氨酸；耐高糖耐高谷氨酸 ；CO2固定能力強(qiáng)； 解除谷氨酸反饋抑制；具有向胞外分泌谷氨酸的能力.） 基因組信息：谷氨酸棒桿菌的碳代謝及氨基酸合成系統(tǒng)構(gòu)建 ：l 糖吸收 ：PTS系統(tǒng)：葡萄糖、果糖、甘露糖以及蔗糖 果糖攝取的PTS系統(tǒng)相關(guān)基因： ptsI-cg2118-pfkB-ptsF-ptsH 葡萄糖、甘露糖、蔗糖相關(guān)基因：ptsG、ptsM、ptsSl 碳源的中心代謝系統(tǒng) ：l 基因成簇：如：gap-pgk-tpippc, aceA-aceB 或 sdhC-sdhA-sdhB l 含多種同工酶 l 含有功能未知酶：如：cg0441和cg0790（假設(shè)的硫鋅酰胺脫氫酶

49、，cg0949和cg0798（檸檬酸鹽合成酶） 生物合成及轉(zhuǎn)運(yùn)代謝系統(tǒng)的重建 對(duì)于利用天冬氨酸鹽或丙酮酸鹽過(guò)量生產(chǎn)L-氨基酸和維生素具有重要作用 。 （進(jìn)行基因組操作來(lái)提高谷氨酸的產(chǎn)量：a. 單基因敲除 ：失去ODHC（酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體）活性； 無(wú)需誘導(dǎo)劑便可產(chǎn)生L-谷氨酸 ；存在誘導(dǎo)劑時(shí)產(chǎn)量可增加10% ；通過(guò)改變代謝流來(lái)增加L-谷氨酸產(chǎn)量 。b. 雙基因敲除 ：dtsR1 和 pyc的敲除抑制菌體生長(zhǎng)，但可使菌體在無(wú)誘導(dǎo)劑的條件下產(chǎn)L-谷氨酸 ；加入生物素，雙突變菌株L-谷氨酸產(chǎn)量較野生型提高13.1% ；加入吐溫40，雙突變菌株L-谷氨酸產(chǎn)量較野生型提高9.8% -吐溫40可通過(guò)抑制

50、DstR活性使脂肪酸合成降低，進(jìn)而提高谷氨酸產(chǎn)量。dtsR1 或 pyc 敲除后PEPC活性提高 通過(guò)PEPC活性的提高來(lái)彌補(bǔ)dtsR1 或 pyc敲除對(duì)TCA的損傷。c. 引入外源基因 ：C. glutamicum ATCC14067 (pJCtacvgb)具有較高的氧吸收率，VHb蛋白提高了重組菌的呼吸效率。 發(fā)酵罐發(fā)酵： 產(chǎn)量提高22%；搖瓶培養(yǎng)： L-谷氨酸的產(chǎn)量提高23%，菌體量提高30% 。）轉(zhuǎn)錄組信息：l 調(diào)控蛋白（ regulators）：C. glutamicum：158個(gè)調(diào)控蛋白（ 128個(gè)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 13個(gè)TCS應(yīng)答蛋白，10個(gè)其它調(diào)控蛋白以及7個(gè)因子），占

51、蛋白編碼基因的5.3% 。 DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 ：大部分與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是HTH模體，依 據(jù)氨基酸序列相似性可分為29個(gè)蛋白家族，大部分都參與負(fù)調(diào)控，抑制可能 是C. glutamicum 主要調(diào)控方式。 雙組份調(diào)控中的應(yīng)答調(diào)控蛋白 ：這些雙組份系統(tǒng)在感受傳遞外界信號(hào)、調(diào)控 細(xì)胞生理活動(dòng)過(guò)程中具重要作用 其它調(diào)控基因 ：主要包括：DnaA, CspA, IHF , PhoU, WhiA, LytR以及PyrR 家族，這些蛋白高度保守，如 PyrR在多種細(xì)菌中通過(guò)與靶基因mRNA上特異 性序列的結(jié)合調(diào)控嘧啶核苷酸合成基因的表達(dá)。 因子 ：主要包括：其中SigH在熱和氧的壓力調(diào)控中具

52、有重要作用，它調(diào) 控SigB、WhcE、HspR、ClgR 等基因的表達(dá)以及伴侶蛋白的水解 l 轉(zhuǎn)錄調(diào)控實(shí)例：全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子GlxR GlxR: cAMP-感應(yīng)蛋白 ；Crp-Fnr 超家族 ；雙調(diào)節(jié)子 ；調(diào)控150個(gè)基因 ；所有棒桿菌中保守 。參與調(diào)控： 芳香化合物的降解 ；有氧及無(wú)氧呼吸 ；糖的吸收、酵解及再生 ；谷氨酸鹽的吸收及氮的同化 ；醋酸鹽、乳酸鹽、葡萄糖酸鹽、乙醇代謝 ；脂肪酸和脫氧核糖核酸的合成 ；細(xì)胞的壓力應(yīng)答及復(fù)蘇 。因此會(huì)影響谷氨酸的生物合成，可以改變適當(dāng)?shù)臈l件來(lái)提高谷氨酸的產(chǎn)量。谷氨酸棒桿菌對(duì)環(huán)境響應(yīng) ：l 谷氨酸棒桿菌的熱激調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極為復(fù)雜，它不僅上調(diào)dnaK、grp

53、E、dnaJ、groES、groEL等分子伴侶編碼基因和hsp的表達(dá)，還上調(diào)或下調(diào)300個(gè)基因的表達(dá)。 l 谷氨酸棒桿菌中還存在對(duì)滲透壓的信號(hào)感知系統(tǒng) MtrAB系統(tǒng)，來(lái)感應(yīng)滲透壓并傳遞信號(hào)，調(diào)控胞內(nèi)基因的表達(dá)。MtrAB系統(tǒng)作用：調(diào)控細(xì)胞壁的合成以及維持高滲環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。谷氨酸棒桿菌耐受高滲透壓機(jī)制：當(dāng)外界的滲透壓較高時(shí)，胞內(nèi)大量的水分流出，使胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度升高，這種升高的信號(hào)會(huì)被MtrB識(shí)別，并活化MtrA，啟動(dòng)betP的表達(dá)， BetP則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞相容性物質(zhì)甜菜堿的轉(zhuǎn)運(yùn)。 l ROS(reactive oxygen species)是微生物在有氧代謝中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，過(guò)量的R

54、OS會(huì)導(dǎo)致氧脅迫和細(xì)胞損傷。為了保護(hù)微生物免受ROS的損害，微生物在進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列的抗氧化系統(tǒng)。l 谷氨酸棒桿菌對(duì)冷的應(yīng)答 l 谷氨酸棒桿菌對(duì)酸的應(yīng)答 ：在中性或低pH時(shí)，谷氨酸棒桿菌會(huì)因氧化脅迫而受損，氧化脅迫的存在會(huì)干擾鐵離子的活性，調(diào)控谷氨酸棒桿菌的代謝。 在酸性條件下半胱氨酸的積累會(huì)抑制谷氨酸棒桿菌的生長(zhǎng) 。谷氨酸棒桿菌對(duì)pH的應(yīng)答是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，它與氧化脅迫、鐵離子平衡以及新陳代謝相聯(lián)系。 16、 什么是多位點(diǎn)序列分型技術(shù)，簡(jiǎn)述其在乳酸菌中的應(yīng)用。多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（MLST）： 是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法，通過(guò)PCR擴(kuò)增610個(gè)管家基因內(nèi)部400600bp核苷酸序

55、列，測(cè)定其序列，分析菌株的變異，從而進(jìn)行分型。與傳統(tǒng)分子生物學(xué)分型方法相比，MLST操作簡(jiǎn)單，具有更高的分辨力，能將同種細(xì)菌分為更多的亞型，并確定不同序列型之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及與疾病的聯(lián)系。隨著測(cè)序速度的加快和成本的降低，以及分析軟件的發(fā)展，MLST逐漸成為細(xì)菌的常規(guī)分型方法。多位點(diǎn)序列分型技術(shù)在乳酸菌中的應(yīng)用：通過(guò)比較ST可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性，即密切相關(guān)菌株具有相同的ST或僅有極個(gè)別基因位點(diǎn)不同的ST，而不相關(guān)菌株的ST至少有3個(gè)或3個(gè)以上基因位點(diǎn)不同。對(duì)于已有的成熟MLST方案的細(xì)菌，可直接從MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取分型方案。乳酸菌種間同源性較高，部分種或亞種的分類(lèi)學(xué)地位模糊不清，常規(guī)分類(lèi)技

56、術(shù)常常很難區(qū)分其近緣種或亞種，多位點(diǎn)序列分型技術(shù)在細(xì)菌分類(lèi)鑒定中存在明顯優(yōu)勢(shì)，近些年開(kāi)始應(yīng)用于乳酸菌分類(lèi)鑒定中。17、 簡(jiǎn)述乳酸菌基因組的特點(diǎn).乳酸菌基因組的特點(diǎn) ：l 基因數(shù)目差異大：不同乳酸菌種之間基因數(shù)目從1600到3000個(gè)不等，基因數(shù)差異大，表明乳酸菌處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的進(jìn)化過(guò)程之中，大量的基因發(fā)生丟失、重復(fù)或者獲得新的基因。原因可能是乳酸菌通常生活在豐富的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中,能夠直接攝取生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而促使基因組簡(jiǎn)化和退化，尤其是糖代謝、攝取和發(fā)酵相關(guān)的基因的衰退。l 基因組中都含有假基因 ：所有的乳酸菌都含有假基因且數(shù)目變化很大，如在腸膜明串珠菌中20個(gè)，嗜熱鏈球菌含有200個(gè)假基因

57、。假基因數(shù)目的差異表明乳酸菌基因組處于一個(gè)活躍的退化過(guò)程。 l 基因組中有很多插入序列 ：乳酸菌基因組中中含有轉(zhuǎn)座因子插入序列(IS)，大小一般在750-2500bp，數(shù)量由格氏乳桿菌基因組的0.2%到乳酸乳球菌乳脂亞種的5%，說(shuō)明這些菌有較高的遺傳可塑性。 18、 簡(jiǎn)述羊毛硫細(xì)菌素的生物合成基因簇的組成及生物合成過(guò)程。羊毛硫細(xì)菌素的生物合成基因簇的組成：參與羊毛硫細(xì)菌素合成的基因一般位于一個(gè)基因簇中，簇中基因一般包括羊毛硫細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因，修飾基因，轉(zhuǎn)運(yùn)加工蛋白基因、免疫蛋白基因及調(diào)控蛋白基因。 羊毛硫細(xì)菌素的生物合成過(guò)程：結(jié)構(gòu)基因(LanA)首先通過(guò)核糖體合成前體分子（包括N端的前導(dǎo)序列和C端的原肽區(qū)）；再經(jīng)過(guò)修飾基因產(chǎn)物(LanBC/LanM）翻譯后修飾；在前導(dǎo)肽以及加工轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（LanP/T）的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜以及對(duì)前導(dǎo)肽進(jìn)行切除；將最終形