七DNA和蛋白質(zhì)序列同源分析ppt課件

1、七、DNA與蛋白質(zhì)序列同源分析進(jìn)化樹構(gòu)建 個(gè)體與數(shù)據(jù)庫(kù)比較。個(gè)體與數(shù)據(jù)庫(kù)比較。 兩個(gè)或兩個(gè)以上個(gè)體比較。兩個(gè)或兩個(gè)以上個(gè)體比較。不同情況：不同情況： internet網(wǎng)絡(luò)。如，NCBI的BLAST; ExPASy的Alignment. 軟件。如，Vecotr NTI分析方法：分析方法：Vector NTI Suit AlignX 同源比較主窗口Vector NTI Suit 同源比較進(jìn)化樹八、蛋白質(zhì)一級(jí)構(gòu)造分析 氨基酸組成。氨基酸組成。 PI PI MWMW 亞細(xì)胞定位亞細(xì)胞定位包括：包括： internet網(wǎng)絡(luò)。 如，ExPASy的primary structure analysis top

2、ology prediction. 軟件。如，Vecotr NTI, Antheprot分析方法：分析方法：Omiga 2.0 ORF Map三、限制性酶切位點(diǎn)分析 一種能識(shí)別特殊，短核苷酸序列，并在DNA的某些位點(diǎn)上切割的蛋白質(zhì)。細(xì)菌包含了400種這樣的酶，能識(shí)別和切割100種以上不同的DNA序列。 如：EcoRI 識(shí)別序列定義：定義：GAATTCGTTAAC三、限制性酶切位點(diǎn)分析 找到待分析的核酸序列。 利用Vector NTI軟件分析。 利用webcutter 2.0在線分析。firstmarket/cutter分析步驟：分析步驟：四、DNA模擬電泳 找到待分析的核酸序列。 利用Vect

3、or NTI或其他軟件分析。分析步驟：分析步驟：DNADNA模擬電泳具有一定實(shí)驗(yàn)預(yù)示功能。模擬電泳具有一定實(shí)驗(yàn)預(yù)示功能。模擬電泳不能作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果或根據(jù)。模擬電泳不能作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果或根據(jù)。注注 意：意：Vector NTI Suit 5.5 模擬電模擬電泳泳Gene Construction Kit 2.0 模擬模擬電泳電泳五、PCR 引物設(shè)計(jì)雜交探針設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)的原那么引物要跟模板嚴(yán)密結(jié)合；引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾構(gòu)造存在；引物不能在別的非目的位點(diǎn)引起高效DNA聚合反響(即錯(cuò)配)。如：引物長(zhǎng)度primer length，產(chǎn)物長(zhǎng)度product length，序列Tm值 (melti

4、ng temperature)，G值(internal stability)，引物二聚體及發(fā)夾構(gòu)造duplex formation and hairpin，錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)false priming site，引物及產(chǎn)物GC含量composition，有時(shí)還要對(duì)引物進(jìn)展修飾，如添加限制酶切點(diǎn)，引進(jìn)突變等。引物設(shè)計(jì)需求思索的要素引物設(shè)計(jì)需求思索的要素引物設(shè)計(jì)要點(diǎn) 普通引物的長(zhǎng)度為16-23bp，常用的長(zhǎng)度為18-21bp，過長(zhǎng)或過短都不適宜。 引物3端的堿基普通不用A，由于A在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高，而其它三種堿基的錯(cuò)誤引發(fā)效率相對(duì)小一些。 引物的GC含量普通為45-55%，過高或過低都不

5、利于引發(fā)反響。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物所對(duì)應(yīng)模板序列的Tm值最好在72左右，當(dāng)然由于模板序列本身的組成決議其Tm值能夠偏低或偏高，可根據(jù)詳細(xì)情況靈敏運(yùn)用。 引物設(shè)計(jì)要點(diǎn) G值反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度，也是一個(gè)重要的引物評(píng)價(jià)目的。 普通情況下，在Oligo 5.0軟件的G值窗口中，引物的G值最好呈正弦曲線外形，即5端和中間部分G值較高，而3端G值相對(duì)較低，且不要超越9G值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值，如此那么有利于正確引發(fā)反響而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。 其原理，引物與模板應(yīng)具有較高的結(jié)合能量，這樣有利于引物與模板序列的整合，因此5端與中間段的G值應(yīng)較高，而3端G值影響DNA聚合酶對(duì)模板DNA的解鏈，過高那么不利于這一步驟。引物設(shè)計(jì)要點(diǎn) 能夠的錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)決議于引物序列組成與模板序列組成的類似性，類似性高那么錯(cuò)誤引發(fā)率高，錯(cuò)誤引發(fā)的引發(fā)率普通不要高過100，最好沒有錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)，如此可以保證不出非目的產(chǎn)物的假帶。 引物二聚體及發(fā)夾構(gòu)造的能量普通不要超越4.5，否那么容易產(chǎn)生引物二聚體帶，且會(huì)降低引物