艾滋病抗體檢測技術(shù)

1、HIVHIV抗體篩查方抗體篩查方法法HIV的感染機制簡述 HIV在病毒分類中屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的人類免疫缺陷病毒組。迄今為止，根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和病毒核酸序列測定，全球流行的HIV可分為2型：HIV -1型和HIV -2型。在HIV-1型內(nèi)，根據(jù)編碼包膜蛋白的env基因和編碼殼蛋白的gag基因序列的同源性又進(jìn)一步分為3個組：組（主要組）、組（外圍組）和組（新組或非M非O組），組內(nèi)又可分為-10個亞型。在HIV -1型和HIV- 2型之間,其核苷酸序列有45-50%的同源性，并且存在免疫交叉反應(yīng)。應(yīng)用免疫印跡法(West blot)可以將二者明確地區(qū)別開來。HIV的感染機制簡述 HIV-1和H

2、IV-2型雖然都起源于非洲，但HIV不同型，不同組甚至不同亞型在全球流行是不均一的。HIV-1的O組，N組和HIV-2型只局限在非洲某些局部地區(qū)流行。而HIV-1的M組病毒呈全球性流行。 到目前為止，全球流行的絕大多數(shù)毒株是HIV-1M組中的A、C亞型毒株，接著是B亞型毒株，然后是A/E和A/G亞型重組毒株。進(jìn)一步的分子流行病調(diào)查表明，在非洲幾乎流行了HIV的所有亞型，但以A和C 亞型為主，同時，也正由于眾多亞型的共流行，那里也是發(fā)生病毒重組最多的地方。在北美、歐洲和澳大利亞，B亞型仍然是最常見的亞型，雖然M組的其它幾個亞型、甚至O組病毒已經(jīng)在美國和歐洲幾個國家有報道，但進(jìn)一步的現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)

3、查證實，這些人中的大多數(shù)是來自非洲的移民。在南美，B亞型占有優(yōu)勢，但C、F亞型也有流行。在阿根廷和巴西有B/F重組毒株的報道。 在亞洲，好幾種不同的HIV-1亞型流行于不同區(qū)域，在印度C亞型占主導(dǎo)，同時有A、B 亞型共流行和A/C亞型重組毒株的報道。在泰國則有二種獨立的亞型流行，B亞型和E亞型（即A/E亞型重組毒株）。在我國主要以B、C和E亞型流行，但同時也A、F和HIV-2型的報道。HIV的感染機制簡述 HIV病毒侵入人體后，其表面糖蛋白gp120與細(xì)胞表面受體蛋白CD4以高親和力結(jié)合，吸附到宿主細(xì)胞上；gp120再與宿主細(xì)胞表面輔助受體相互作用，使病毒與宿主細(xì)胞膜更接近；gp41產(chǎn)生一系列

4、構(gòu)象變化，其N端的融合肽片段插入宿主細(xì)胞膜，導(dǎo)致病毒包膜與細(xì)胞膜的最終融合，病毒RNA進(jìn)入細(xì)胞。 在HIV感染后，最先能夠監(jiān)測到病毒RNA、然后是p24抗原，最后是抗體。HIV的感染機制簡述 在感染后的1014 d內(nèi)，病毒RNA水平是呈指數(shù)上升，隨后下降并保持在持續(xù)穩(wěn)定的水平上，進(jìn)入HIV無癥狀期 p24抗原水平隨著病毒RNA水平的發(fā)展而發(fā)展，在急性感染期就可以出現(xiàn)，被認(rèn)為是病毒復(fù)制的間接標(biāo)志，但由于檢測方法的靈敏度不夠而使得其檢出時間要比RNA晚。HIV的感染機制簡述 窗口期概念：從HIV感染到能夠檢測出HIV抗體這一時期,被稱作“窗口期”。在窗口期，只有通過病毒RNA、p24抗原和CD4淋

5、巴細(xì)胞水平來確定HIV感染。 CD4淋巴細(xì)胞水平隨著感染的發(fā)展而逐漸下降,當(dāng)其在血液中細(xì)胞下降到200個/mm3時，就會發(fā)生嚴(yán)重的免疫缺陷，患者就被確診為艾滋病。 病毒RNA、p24抗原、HIV抗體和CD4淋巴細(xì)胞水平可以用來確定HIV感染、檢測病情發(fā)展。HIV感染的主要檢測方法 目前檢測HIV的方法有100多種，總體來說可以分為抗體檢測和病毒檢測兩大類。 早期對HIV的診斷主要是通過血清學(xué)試驗檢測抗HIV的抗體,間接地診斷HIV感染。 病毒檢測包括p24抗原檢測、細(xì)胞培養(yǎng)(病毒分離)和病毒核酸檢測。 抗原能夠在個體感染后先于血清轉(zhuǎn)化218 d被檢測到。因此，在血清轉(zhuǎn)化期通過檢測p24抗原有著

6、很大的優(yōu)勢，可以作為早期輔助診斷HIV感染的一種方法。 HIV感染的主要檢測方法 病毒培養(yǎng)是檢測HIV感染最精確的方法。一般采取培養(yǎng)外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的方法進(jìn)行HIV的診斷。在窗口期可以檢測到病毒相關(guān)抗原或分離病毒。 病毒核酸檢測通常是通過檢測HIV RNA水平來反映病毒載量，具有很高的靈敏度，使用適時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，能夠在HIV感染的前2周檢測到病毒核酸。病毒核酸檢測方法可用于HIV的早期診斷，如窗口期輔助診斷、病程監(jiān)控、指導(dǎo)治療方案及療效測定、預(yù)測疾病進(jìn)程等。目前常用的測定方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗(RT PCR)、核酸序列擴增實驗(NASBA)、分支DNA雜交實驗(

7、bDNA)等。 近幾年，分子生物學(xué)方法不斷被應(yīng)用到HIV的檢測中，HIV的實驗室診斷方法取得了很大的進(jìn)展，核酸檢測已經(jīng)成為了HIV實驗室診斷的發(fā)展方向。HIV感染的主要檢測方法 抗體通常是在感染后38周能夠被檢測出來，在窗口期，病毒抗體不能被檢出?？贵w檢測由初篩和確認(rèn)試驗組成，目前，大多應(yīng)用雙抗原夾心法進(jìn)行抗體篩查，這種方法具有很好的靈敏性和特異性。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法有一定的靈敏度，且操作簡單、快速，適合對大量樣品的檢測，是目前臨床通用的初篩檢測方法，初篩試驗呈陽性的必須進(jìn)行確認(rèn)試驗。確證試驗國際上有3種確認(rèn)試驗方法，包括免疫印跡試驗、條帶免疫試驗及免疫熒光試驗,目前以免疫印跡

8、試驗最為常用。目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法 HIV抗體一般在人感染后數(shù)周逐漸出現(xiàn),可延續(xù)至終生，95%在三個月可以檢測出抗體。 血清學(xué)試驗分為初篩和確認(rèn)試驗。常規(guī)實驗方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫印跡試驗(WestBlot)、間接免疫熒光法(IFA)。快速檢測方法：明膠顆粒凝集試驗、斑點免疫結(jié)合試驗、24抗原的檢測。 最常用的初篩試驗和確認(rèn)試驗分別是酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡試驗(WB)。目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法 常用HIV病原學(xué)檢測方法:病毒分離抗原檢測-24抗原的檢測核酸檢測（ cDNA測定-PCR、 RNA測定-病毒載量）其他方法：逆轉(zhuǎn)錄酶測定、原位雜交p常用HIV抗體檢測

9、方法:ELISA 快速HIV檢測（RT）免疫印記法 （ Western Blot）其他方法：免疫熒光法（IFA）、放射免疫沉淀目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ：ELISA法的基本原理是免疫反應(yīng)物通過化學(xué)或免疫學(xué)的方法形成酶結(jié)合物，酶結(jié)合物能與待檢樣品中相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合成為免疫復(fù)合物,然后加入酶底物,經(jīng)酶的催化或水解作用,無色底物產(chǎn)生顏色,用肉眼、分光光度計觀察結(jié)果。 分類：雙抗原夾心法測抗體、雙抗體夾心法測抗原 、間接法測抗體、競爭法、捕獲包被法等 由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法 ELI

10、SAELISA的結(jié)果判斷： 實驗是否成立判斷：陰性對照（NC）和陽性對照（PC1， PC2 ）的要求條件 Cut off值的確定 灰區(qū)概念 ：把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下的一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復(fù)實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則報告陽性， 灰區(qū)概念對血站系統(tǒng)的獻(xiàn)血員篩查尤為重要。 高值鉤鐮效應(yīng)（HD-HOOK） ：在二位點夾心ELISA中，其劑量反應(yīng)曲線的高劑量（HIGH DOSE，HD）區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀。產(chǎn)生該現(xiàn)象的分子機理有分子變構(gòu)說和濃度效應(yīng)等推論。 一步法和二步法均存在， 只是前者出現(xiàn)的更早些，

11、大多數(shù)是高值低吸光度，很少陰性結(jié)果。 報告：對HIV抗體篩查試驗，呈陰性反應(yīng)者可出具“HIV抗體陰性”報告,對初篩試驗呈陽性反應(yīng)者不能出陽性報告，可出具“HIV抗體待復(fù)查”報告.ELISA實驗的影響因素 試劑的質(zhì)量-選擇質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。選擇靈敏度高，特異性好的試劑。 不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別， 影響靈敏度因素：試劑平衡30分鐘：試劑沒有平衡或平衡時間太短會造成試劑混勻不夠，樣品孵育時間相對縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分，靈敏度明顯偏低。冬季室溫低，可將試劑盒置37溫箱20分鐘。 試劑存放：試劑在室溫放置

12、24小時后靈敏度開始下降，放置時間越長、室溫溫度越高靈敏度下降越明顯；實驗過程中任何一步縮短時間靈敏度都明顯下降，如果同時縮短每一步反應(yīng)時間靈敏度下降更顯著超過有效期的試劑靈敏度明顯下降，超過時間越長下降越明顯。ELISA實驗的影響因素 標(biāo)本質(zhì)量：最好將血液先自然存放1-2小時后，再用3000rmp離心15分鐘；標(biāo)本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管，采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次，放置一段時間后，3000rpm離心15分鐘；若在幾天內(nèi)檢測，可放在2-8冰箱中，若要貯存，則置于-20的低溫冰箱內(nèi)。干擾物質(zhì)的影響，大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)

13、果；常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等。如RF因子可與標(biāo)記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽性，高濃度的AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會導(dǎo)致本底過深影響檢測結(jié)果。溶血標(biāo)本及混有紅細(xì)胞的血清采用ELISA法檢測易產(chǎn)生假陽性 可能是溶血血清中含有過氧化酶物質(zhì)（紅細(xì)胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，會釋放出原生態(tài)氧(O)，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì)，即顯藍(lán)色，產(chǎn)生假陽性 。ELISA實驗的影響因素 標(biāo)本質(zhì)量：因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。在冰箱

14、中保存過久的標(biāo)本，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深、造成假陽性；為克服上述干擾，ELISA測定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5 d內(nèi)測定的血清標(biāo)本可存放于4，1周后測定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測定，但混勻時應(yīng)輕柔，不可強烈振蕩。塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性 最好使用真空采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會增加OD值，EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維

15、蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；因此血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。ELISA實驗的影響因素 加樣：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以，有時候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。手工操作中，加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長(特別是室內(nèi)溫度較高時)；全自動酶標(biāo)儀也存在同樣的問題，孵浴時間差距較大。標(biāo)本較多時，請分批操作

16、。 吸量不準(zhǔn)確，直接影響檢測結(jié)果。因此加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)。加完標(biāo)本再加酶試劑時酶濺出孔外。加樣的順序ELISA實驗的影響因素 孵?。簻赜荅LISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個因素?？乖贵w結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入和水分蒸發(fā)。孵育時未貼封片或加蓋，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底；孵育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。ELISA實驗的影響因素 洗板：是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)

17、，手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，全自動洗板機使用不當(dāng)也會影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機針小孔處于阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，抽吸不完全；洗板不暢，導(dǎo)致洗板效果差。導(dǎo)致“花板”造成假陽性或假陰性；洗液量不足，保證洗液注滿各孔 。采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。采用半自動洗板機洗板時，洗液量不足，導(dǎo)致洗板不徹底；反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。及時更換吸水紙，尤其是拍過酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗結(jié)果。 ELISA實驗的影響因素 顯色：一般來說，顯色時間過短，結(jié)果偏低；顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。 顯色劑配制后放置時間

18、過長或使用過期顯色劑；尤其是國產(chǎn)試劑。盡量臨用時配置。堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用；加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。p終止：加終止液時產(chǎn)生較多氣泡，導(dǎo)致假陽性增加。ELISA實驗的影響因素 讀板：單波長或雙波長比色選擇的問題。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進(jìn)行比色測定；而雙波長雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零

19、，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點。由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。 ELISA實驗中常見的問題 顯色淡，靈敏度偏低：試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高試劑盒未充分平衡培養(yǎng)箱溫度不足37保溫時間不足洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數(shù)增加移液器吸

20、液量不足，吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔漏加試劑或底物作用時間不足 ELISA實驗中常見的問題 背景深，全部呈有色：洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留 樣品污染培養(yǎng)箱溫度超過37或反應(yīng)時間過長吸嘴重復(fù)使用，未洗凈或消毒不徹底酶等試劑混用一次實驗的標(biāo)本量過多，加樣時間太長，導(dǎo)致實際反應(yīng)時間延長 ELISA實驗中常見的問題 出現(xiàn)白板，陽性對照不顯色 顯色液變質(zhì) 洗滌液配制有誤-按說明書所示稀釋倍數(shù)配制 未加酶結(jié)合物 終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂媚壳俺Ｓ玫腍IV抗體、抗原檢測方法 初篩用的HIV ELISA試劑目前已經(jīng)發(fā)展到第四代檢測試劑。第一代試劑主要以病毒裂解物或部分純

21、化的病毒抗原包被反應(yīng)板,以檢測血清中的抗體。由于包被的抗原不很純,假陽性率較高。第二代試劑使用基因工程方法得到的重組抗原和合成肽包被反應(yīng)板，由于純化抗原的使用,特異性有了很大提高。第三代試劑使用雙抗原夾心法檢測抗體,進(jìn)一步提高了敏感性。第四代試劑則在第三代的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加了P24抗原的檢測,把HIV抗原和抗P24的抗體同時包被反應(yīng)板,可同時檢測血清中的HIV抗體和P24抗原。 目前國內(nèi)主要使用第三代目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法 HIV抗體篩查試驗基本要求：篩查試劑必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn)、批檢合格、臨床評估質(zhì)量優(yōu)良、在有效期內(nèi)的試劑。 建議采用國家參比室試劑考評質(zhì)量優(yōu)良的

22、試劑。-中國疾病預(yù)防控制中心性艾中心網(wǎng)站目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法 免疫印跡試驗 ：免疫印跡試驗主要用于確認(rèn)試驗，基本原理是HIV全病毒抗原經(jīng)過SDS PAGE電泳,將分子量大小不等的蛋白帶分離開來,然后再把這些已經(jīng)分離的不同蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀,每一條硝酸纖維素膜上均含有經(jīng)電泳分離過的HIV病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1/100,再把它直接加到硝酸纖維素膜上,恒溫震蕩,使其充分接觸反應(yīng),血清中若含有抗HIV抗體,就會與膜條上的抗原帶相結(jié)合。加入抗人IgG酶結(jié)合物和底物后,即可使有反應(yīng)的抗原 抗體結(jié)合帶呈現(xiàn)紫褐色,根據(jù)出現(xiàn)條帶情況判定結(jié)果 有報告說，

23、免疫印跡試驗的特異性不是很好, 有大約2的假陽性率，但免疫印跡試驗依然是目前最常用的HIV確認(rèn)試驗。目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法 嬰幼兒HIV抗體陽性不能用于診斷感染HIV，嬰幼兒體內(nèi)從母親得到的HIV抗體持續(xù)存在時間最長不超過18個月。 在18月齡以前可以用多種不同的非抗體依賴性的檢驗方法對新生兒HIV感染進(jìn)行輔助診斷，包括：HIV P24抗原檢測、病毒分離培養(yǎng)、RNA或DNA測定。 18月齡以前嬰幼兒感染HIV診斷要結(jié)合臨床表現(xiàn)和實驗室綜合診斷。目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法 免疫熒光試驗(IFA) ：基本原理為采用熒光染料Calcien AM標(biāo)記 9或HUT 78培養(yǎng)細(xì)胞作為載

24、體,用HIV感染細(xì)胞,該細(xì)胞內(nèi)就會含有HIV抗原,將HIV感染的淋巴細(xì)胞涂于玻片上,固定，制備為抗原片 加入待檢血清，待檢血清中的抗 HIV抗體與抗原結(jié)合后,再與熒光素標(biāo)記的抗人Ig結(jié)合,在熒光顯微鏡下可見到細(xì)胞內(nèi)有黃綠色熒光。目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法 明膠顆粒凝集試驗(PA) ：PA的基本過程是先將樣品稀釋,然后分別加入經(jīng)抗原致敏的和未致敏的明膠顆粒,混勻后保溫(一般為室溫)。當(dāng)血清中有HIV抗體存在時,經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng),根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結(jié)果。PA操作簡便,無需特殊儀器設(shè)備,適合對少量標(biāo)本的檢測。（PA）檢測結(jié)果的判定目前常用的HIV抗體、

25、抗原檢測方法 斑點EIA或稱斑點ELISA（dot-EIA）：以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應(yīng)時間在10 min以內(nèi)，使用抗原量少。目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法p膠體金（或膠體硒）快速試驗 金標(biāo)紙條采用雙抗原夾心法免疫測定原理，選擇經(jīng)純化的基因工程制備的gp36、gp41、p24抗原作為包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作為膠體金結(jié)合抗原。 當(dāng)待檢標(biāo)本中含有HIV抗體時，先和金標(biāo)記抗原結(jié)合，由于層析作用反應(yīng)復(fù)合物沿硝酸纖維膜向前移動，當(dāng)遇到包被抗原時，形成Ag

26、-Ab-Ag-Au復(fù)合物而富集在包被線上，形成紅色沉淀線。同時在包被膜上還有一條質(zhì)控線對照，故當(dāng)有兩條紅線時判為陽性，只有一條紅線時，判為陰性。目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法p膠體金（或膠體硒）快速試驗 試劑穩(wěn)定，可室溫長期保存。試驗時不需任何設(shè)備，迅速、簡便、特異性較好，敏感性約相當(dāng)于中度敏感的ELISA，適用于應(yīng)急檢測、門診急診個體檢測，尤其是基層單位。 目前已有在國內(nèi)被SFDA批準(zhǔn)注冊的國外進(jìn)口試劑和國內(nèi)產(chǎn)品。一般可在1030min內(nèi)判讀結(jié)果。反應(yīng)反應(yīng)金標(biāo)法（膠體硒法）結(jié)果判定目前常用的HIV抗體、抗原檢測方法p艾滋病唾液檢測卡：在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋

27、白抗原，可同時檢測含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗體，原理為酶免疫間接法。主要檢測唾液中的HIV IgA與IgG抗體，敏感性特異性與ELISA相近，可避免靜脈穿刺。但樣品預(yù)處理時間長且售價較高。p以唾液為樣品測定HIV抗體的ELISA、免疫印跡法（WB）試劑已經(jīng)美國FDA批準(zhǔn) 。快速HIV檢測與ELISA-HIV檢測比較快速*平均45分鐘（10分鐘2.5小時）常規(guī)平均3.5小時（94分鐘16小時）* 一般不要特殊設(shè)備，試劑可不用冰箱存放快速試劑的局限性 一般不用于血液篩查 有一定的假陽性反應(yīng)，如作為臨床診斷，要復(fù)檢和確認(rèn) 有一定的假陰性反應(yīng)（尤其暴露時間3個月）目前HIV檢測技術(shù)的優(yōu)缺點和

28、進(jìn)展 細(xì)胞培養(yǎng)的方法檢測HIV專一性強，不會出現(xiàn)假陽性，對于確認(rèn)那些抗原/抗體檢測不確定的個體和陽性母親新生兒是否感染HIV有著重要的意義。但是須要有一定數(shù)量的感染細(xì)胞存在才能培養(yǎng)和分離出病毒來，因而敏感性差、操作時間長、操作復(fù)雜，必須在特定的P3實驗室中才能進(jìn)行，且費用較高(每次培養(yǎng)需要約200500美元)，不適用于臨床。目前HIV檢測技術(shù)的優(yōu)缺點和進(jìn)展 p24抗原檢測能夠在病毒開始復(fù)制后檢測到血液中的可溶性p24抗原，檢測p24抗原縮短窗口期 （可提前1-2周），最早可達(dá)9天。 HIV-P24抗原陽性僅作為HIV感染窗口期的輔助診斷依據(jù)，檢測早期感染，不能據(jù)此確診。 易出現(xiàn)假陽性。陽性結(jié)果

29、必須經(jīng)中和試驗確認(rèn)，該結(jié)果才可作為HIV感染的輔助診斷依據(jù)。 HIV 1 p24抗原檢測陰性，只表示在本試驗中無反應(yīng)，不能排除HIV感染。目前HIV檢測技術(shù)的優(yōu)缺點和進(jìn)展 病毒核酸檢測方法具有很高的靈敏度，對疾病進(jìn)展的監(jiān)測、抗病毒療效觀察和耐藥性監(jiān)測非常重要。但是，由于HIV基因的多樣性，沒有一套引物可以覆蓋所有的HIV序列，使檢測的敏感性又受到限制； 現(xiàn)有的病毒核酸檢測方法或是檢測儀器、檢測試劑昂貴，檢測1次病毒載量需要上千元(約1 500元)，或是操作復(fù)雜，對操作人員要求高，既難以在一般實驗室推廣，又不適用于對大量患者的快速檢測，同樣不適合廣泛的臨床應(yīng)用。目前HIV檢測技術(shù)的優(yōu)缺點和進(jìn)展

30、基困芯片應(yīng)用于HIV檢測得到迅速發(fā)展，基因芯片技術(shù)廣泛用于HIV病毒的測序、分型及多態(tài)性分析 用基因芯片技術(shù)對HIV等傳染病病毒進(jìn)行檢測時，1毫升的血液中只要含有100個病毒顆粒即可得出結(jié)論，而此前的檢測方法要等到血液中病毒顆粒達(dá)到1萬甚至10萬才能奏效。 該技術(shù)較為復(fù)雜，且成本高，目前對其應(yīng)用仍大多停留在實驗階段，離臨床檢驗及疾病診斷的普及性還有一段距離。目前HIV檢測技術(shù)的優(yōu)缺點和進(jìn)展 綜上所述各種實驗方法可以根據(jù)HIV感染的不同時期與狀態(tài)選擇不同的檢測手段。HIV原發(fā)感染2周內(nèi)，任何方法均無法檢測到病毒，2周后出現(xiàn)病毒血癥時，可檢測病毒抗原，感染6周8周后可以選擇檢測抗體的方法。運用PC

31、R技術(shù)可用來追蹤HIV的自然感染史；可用來監(jiān)測長期潛伏期患者；以及在抗病毒治療期間的病毒載量水平；也可用于HIV血清陽性母親的嬰兒的HIV檢測。在嬰兒出生后最初6個月9個月期間。他們的血清中存在母體的抗體，因此用PCR可判定嬰兒是否真正被HIV感染。 目前HIV檢測技術(shù)的優(yōu)缺點和進(jìn)展 就目前而言，標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法是血清學(xué)HIV抗體檢測，它是診斷艾滋病感染者和艾滋病的主要指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)檢測項目，分子生物芯片等更新檢測技術(shù)可能會廣泛應(yīng)用于HIV檢測我們應(yīng)密切注視檢測技術(shù)的發(fā)展，以更準(zhǔn)確、快速的方法對HIV感染作出診斷。 因此，既要提高檢測的敏感性、特異性，縮短窗口期，又要簡便、快速和降低成本已成為HIV

32、檢測技術(shù)發(fā)展的要求和方向，很多的研究正致力于尋找病毒檢測的替代技術(shù)。目前HIV檢測技術(shù)的優(yōu)缺點和進(jìn)展 近年來，HIV檢測技術(shù)取得了很大進(jìn)展。如發(fā)展了ICD p24抗原測定法(immune complex disassociate，免疫復(fù)合物解離，ICD)，將免疫復(fù)合物熱解離后通過TSA信號放大系統(tǒng)使用ELISA進(jìn)行檢測，使p24抗原檢測的最小檢出值由原來的10pg/ml降低到0.5 pg/ml，在HIV-1抗體陽性母親所生嬰兒早期的診斷中與RNA檢測相當(dāng)，與HIV核酸檢測具有可比性，具有重要的實用價值。 第四代HIV檢測試劑、超敏感EIA、線性免疫酶測定(lineal immunoenzyma

33、tic assay)等，使檢測出HIV感染的時間大大提前。 目前HIV檢測技術(shù)的優(yōu)缺點和進(jìn)展 窗口期問題：窗口期是從被感染到身體產(chǎn)生足夠多的特定抗體的這段時間，“足夠多”是指能被我們當(dāng)前的測試手段檢測出來。人被感染后身體會制造抗體來對抗病毒，當(dāng)身體產(chǎn)生足夠多的抗體后，抗體測試將呈陽性。不同的人對病毒感染的反應(yīng)有一點差別，以至于不同的人“窗口期”的長度也有微小的變化。關(guān)于窗口期到底有多長的問題，目前醫(yī)學(xué)界存在很多爭論，有說68周的，也有說3個月的，最保守的說法是6個月！國內(nèi)比較認(rèn)同的說法是3個月， HIV抗體窗口期的存在只能縮小但無法避免。 目前HIV檢測技術(shù)的優(yōu)缺點和進(jìn)展 提高檢測試劑的靈敏度

34、：新試劑研發(fā) 病毒相關(guān)抗原或病毒分離：第四代試劑應(yīng)用，核酸檢測在發(fā)達(dá)國家進(jìn)行血液篩查被普遍應(yīng)用。德國的NAT使HIV的殘余危險度由1：277萬降低到1：554萬，法國由1：307萬下降到：315萬（對多份標(biāo)本進(jìn)行混合集合，RT-PCR方法檢測，對陽性的集合進(jìn)行拆分） 窗口檢疫期（血漿制品90天） HIV抗體檢測試劑的發(fā)展 從1985年第1代HIV抗體檢測試劑問世到現(xiàn)在，HIV血清學(xué)檢測試劑已經(jīng)發(fā)展到了第4代。第4代ELISA試劑的優(yōu)點在于能同時檢測抗原和抗體，降低血源篩查的殘余危險度。與第3代抗HIV 1/2試劑相比，檢出時間提前了45 d，窗口期縮短了1周多，在對艾滋病早期診斷的效果上明顯優(yōu)

35、于第3代。HIV抗體檢測試劑的發(fā)展 但使用第4代試劑對艾滋病毒進(jìn)行檢測，仍然有23周的窗口。此外，由于把抗原和抗體同時包被在反應(yīng)板上，存在著相互干擾的可能，影響了免疫反應(yīng)的特異性。 一般來講，使用第4代試劑檢測p24抗原，其靈敏度(20100 pg/mL)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單獨檢測抗原抗體分析法(3.510 pg/mL)。從方法學(xué)上來講，這種基于ELISA的分析方法，靈敏度終歸是有限的。相對化學(xué)發(fā)光和時間分辨熒光免疫分析技術(shù)等更先進(jìn)的分析方法，它的靈敏度比較低。 由此可見，提高敏感性、特異性、縮短窗口期和簡便快速是HIV檢測試劑未來發(fā)展的主要趨勢。p24抗原檢測方法研究進(jìn)展 隨著檢測靈敏度不斷提高， p

36、24抗原的檢測逐漸從主要用于在窗口期輔助早期診斷和進(jìn)一步縮短窗口期，發(fā)展到用于病毒載量測定。 目前，p24抗原在以下幾方面都有重要應(yīng)用：HIV 1抗體不確定或窗口期的輔助診斷；HIV 1抗體陽性母親所生嬰兒早期的輔助鑒別診斷；第4代HIV 1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性反應(yīng)，但HIV 1抗體確認(rèn)陰性者的輔助診斷；監(jiān)測病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。但現(xiàn)有監(jiān)測病程進(jìn)展和抗病毒治療效果均采用昂貴、操作復(fù)雜的病毒RNA測定方法。 我國HIV/AIDS患者絕大部分是在基層，很難在基層普及，對疾病的治療和控制很不利。高靈敏度p24 抗原檢測方法的建立成為在發(fā)展中國家使用的病毒載量測定方法的一種選擇。p2

37、4抗原檢測方法研究進(jìn)展 2004年，來自HIV病毒的發(fā)現(xiàn)者之一美國馬里蘭大學(xué)Dr.Robert C.Gallo所領(lǐng)導(dǎo)的實驗室的一篇高靈敏度檢測p24抗原的研究論文引起了廣泛的關(guān)注，p24抗原的檢測成為比病毒核酸檢測更靈敏的方法。2005年來自美國馬里蘭大學(xué)的一篇長篇綜述也開始關(guān)注p24抗原的檢測，認(rèn)為這可以作為低成本、適合在發(fā)展中國家使用的替代現(xiàn)有昂貴的RNA測定方法的一種選擇。p24抗原檢測方法研究進(jìn)展 目前，商品化的p24 抗原的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法主要是依據(jù)夾心ELISA原理。該方法是用抗p24抗原的抗體包被固相的雙抗體夾心法，是檢測抗原最為常用的方法，國內(nèi)尚未見商品化的HIV p24抗原檢測試

38、劑的生產(chǎn)。 綜上所述，用高靈敏的分析方法診斷艾滋病將有助于實現(xiàn)早期診斷，避免漏檢，有助于對治療艾滋病藥物的療效評價、預(yù)測和監(jiān)測疾病進(jìn)程，提高檢測的靈敏性、縮短窗口期，是HIV診斷方法和診斷試劑持續(xù)發(fā)展的主要方向。相信隨著HIV實驗室檢測技術(shù)的不斷的改進(jìn)，尤其是核酸檢測技術(shù)的不斷應(yīng)用，HIV檢測的窗口期將會逐步縮短，經(jīng)輸血傳播HIV可能性也將會大大減小。無創(chuàng)篩查方法 血液檢測法具有高效準(zhǔn)確的優(yōu)勢，然而其缺陷也是顯而易見的：接受檢測者面臨被感染的危險。由于HIV陽性病毒攜帶者的血液具有感染性，接受檢測者有可能在采血過程中由于使用重復(fù)或不潔的器械而感染HIV病毒。醫(yī)護人員面臨被感染的風(fēng)險。在全球的3

39、500萬名醫(yī)護工作者中，每年約300位萬人在醫(yī)護過程中因為不潔針具，刀具和醫(yī)療器械的意外傷害而造成血源性感染。 被檢測者對這種檢測方式有顧慮。許多人由于對疼痛或感染懷有恐懼和擔(dān)憂不愿意接受HIV檢測。另外，在一些國家由于當(dāng)?shù)仫L(fēng)俗文化對采血的禁忌給當(dāng)?shù)豀IV血檢帶來了極大困難。無創(chuàng)篩查方法 口腔粘膜滲出液人類免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗體診斷：美國克利普特（Calypte）生物醫(yī)學(xué)公司研發(fā)出了Aware 口腔粘膜滲出液人類免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗體診斷試劑盒。這種試劑通過采集口腔粘膜滲出液作為檢測樣本，試驗的用途是作為一種“床邊檢測”的檢驗方法用于臨床診斷，操作簡易，用肉眼判讀，20分鐘

40、就可以得出定性的檢測結(jié)果，無任何痛苦，并能大幅度降低受試者和醫(yī)護人員感染的風(fēng)險,經(jīng)在中國市場的臨床研究結(jié)果，該試劑的靈敏度達(dá)99.3%,特異性達(dá)99.9+%。此試劑尤其適合在兒童，肥胖者，靜脈萎縮和其他一切不利于使用靜脈采血的人群中使用。另外。此試劑還適用于醫(yī)療條件有限，采血困難的邊緣山區(qū)，也適用于大規(guī)模人群的初篩。無創(chuàng)篩查方法 尿HIV抗體檢驗：美國約翰斯霍普金斯大學(xué)等報告，尿抗體檢驗是發(fā)現(xiàn)感染病人的簡單有效的方法，研究者在年內(nèi)篩查了多名居民。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)例（）陽性病人，其中，例（）病人以前從未做過檢查或檢查結(jié)果陰性。尿印跡和酶免疫測定均陽性的病人接受了血液化驗，結(jié)果（例）病人血液化驗也陽性，

41、與尿檢驗結(jié)果一致。這一方法有助于在感染高發(fā)地區(qū)改善感染的監(jiān)測，使感染病人能夠及時得到治療。尤其適合用于吸毒人群的HIV監(jiān)測和篩查。HIV感染的主要檢測方法 目前檢測HIV的方法有100多種，總體來說可以分為抗體檢測和病毒檢測兩大類。 早期對HIV的診斷主要是通過血清學(xué)試驗檢測抗HIV的抗體,間接地診斷HIV感染。 病毒檢測包括p24抗原檢測、細(xì)胞培養(yǎng)(病毒分離)和病毒核酸檢測。 抗原能夠在個體感染后先于血清轉(zhuǎn)化218 d被檢測到。因此，在血清轉(zhuǎn)化期通過檢測p24抗原有著很大的優(yōu)勢，可以作為早期輔助診斷HIV感染的一種方法。 ELISA實驗的影響因素 加樣：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以，有時候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加