分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能(6-1)(1)

1、分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作、設(shè)計(jì)與技能操作、設(shè)計(jì)與技能轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化技術(shù)( (二二) ) 李剛 副教授 PEG 法3農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法1電擊法4基因槍法2花粉管通道法7顯微注射法5碳化硅纖維法8脂質(zhì)體法6超聲波法9激光微束法10農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化機(jī)理農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,用于基因操作的主要有兩類：根癌農(nóng)桿菌（A. tumefaeiens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（A. rihizogenes）。他們分別含有Ti質(zhì)粒和致根Ri質(zhì)粒，目前對(duì)Ti質(zhì)粒的研究較詳細(xì)而且應(yīng)用廣泛。Ti質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌在感染植物時(shí)，能將其環(huán)狀Ti質(zhì)粒上的一段DNA插入到被感染植物基因組中，并能穩(wěn)定遺傳給

2、后代，導(dǎo)納細(xì)菌本身不進(jìn)入被感染的植物細(xì)胞，由此發(fā)展出農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒為載體的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。這是自然界存在的一個(gè)天然的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。這是自然界存在的一個(gè)天然的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的主要過(guò)程為（1 1）細(xì)菌在植物敏感細(xì)胞上吸附；（）細(xì)菌在植物敏感細(xì)胞上吸附；（2 2）農(nóng)桿菌中的）農(nóng)桿菌中的TiTi質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的VirVir區(qū)基因被激活；區(qū)基因被激活；（3）T TDNADNA切割和切割和T TDNADNA復(fù)合物形成；（復(fù)合物形成；（4 4）T TDNADNA復(fù)合物由農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞；（復(fù)合物由農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞；（5 5）T TDNADNA整合到植物染色體上并且進(jìn)整合到植物染色體上并且進(jìn)行

3、表達(dá)。行表達(dá)。自然狀況下，普通農(nóng)桿菌能夠感染雙子葉植物自然狀況下，普通農(nóng)桿菌能夠感染雙子葉植物、裸子植物和少數(shù)幾種單子葉植物。近年來(lái)，農(nóng)桿菌在真菌、裸子植物和單子葉植物轉(zhuǎn)化方面取得了可喜的進(jìn)展，其中以單子葉植物，尤其是禾谷類作物的成功轉(zhuǎn)化最引人注目。其中以單子葉植物，尤其是禾谷類作物的成功轉(zhuǎn)化最引人注目。實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌對(duì)單子葉植物成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌對(duì)單子葉植物成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素包括（1）選擇活躍分裂的功能細(xì)胞；（2 2）添加酚類化合物，促進(jìn)）添加酚類化合物，促進(jìn)VirVir基因的活化基因的活化；（3）合適的農(nóng)桿菌菌株（載體），如LBA4404，EHA101及C58等；（4）選擇合適的基因

4、型、培養(yǎng)基、適宜的菌液濃度、細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)等均是轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵所在。基因槍法 又稱微彈轟擊法。其基本原理是：將外源將外源DNADNA包被在微小的包被在微小的金粒子或鎢粒子表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入金粒子或鎢粒子表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細(xì)胞或組織。微粒上的外源受體細(xì)胞或組織。微粒上的外源DNADNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上，得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。物染色體上，得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。 現(xiàn)在基因槍法已成為繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之后第二大植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，因?yàn)槠渚哂幸韵聝?yōu)點(diǎn)： 受體類型廣泛；無(wú)物種限制，操作簡(jiǎn)便快速；可控度高，轉(zhuǎn)受體類型

5、廣泛；無(wú)物種限制，操作簡(jiǎn)便快速；可控度高，轉(zhuǎn)入組織的深度可用轟擊壓力和空間距離來(lái)控制；可同時(shí)用幾入組織的深度可用轟擊壓力和空間距離來(lái)控制；可同時(shí)用幾個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。 缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化頻率低、價(jià)格昂貴、整合過(guò)程中易發(fā)生重排和高整合過(guò)程中易發(fā)生重排和高拷貝插入現(xiàn)象及后代遺傳不穩(wěn)定等缺點(diǎn)拷貝插入現(xiàn)象及后代遺傳不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。PEG法 PEGPEG即聚乙二醇，是一種多聚化合物，能夠促能夠促進(jìn)植物原生質(zhì)體直接吸收外源質(zhì)粒進(jìn)植物原生質(zhì)體直接吸收外源質(zhì)粒DNADNA。PEG通過(guò)電荷之間的相互作用與DNA形成緊密復(fù)合物，原生質(zhì)體通過(guò)內(nèi)吞作用吸收外源復(fù)合物原生質(zhì)體通過(guò)內(nèi)吞作用吸收外源復(fù)合物到細(xì)胞內(nèi)到

6、細(xì)胞內(nèi)。PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法由Davey等于1980年首創(chuàng)，PEG法對(duì)禾本科作物有重要作用，應(yīng)用PEG法已成功轉(zhuǎn)化了小麥、水稻、玉米、高梁等多種單子葉禾谷類作物的原生質(zhì)體。由于原生質(zhì)體不易形成再生植株由于原生質(zhì)體不易形成再生植株，且PEG法轉(zhuǎn)化率低，因此PEG法至今尚未普遍應(yīng)用。電擊法（Electroporation） 電擊法是利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電擊穿孔”，形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的攝取。李寶健等于李寶健等于19851985年首次將其應(yīng)用于植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化年首次將其應(yīng)用于植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于單子葉、雙子葉植物中，特特別對(duì)禾谷類作物更有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

7、別對(duì)禾谷類作物更有發(fā)展?jié)摿Αｏ@微注射法 是利用顯微注射儀顯微注射儀將外源DNA直接注入受體細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。受體細(xì)胞的固定是顯微注受體細(xì)胞的固定是顯微注射中的一個(gè)重要問(wèn)題。射中的一個(gè)重要問(wèn)題。顯微注射用的微針極細(xì)，針尖直徑以0.5m左右為宜，一次注入細(xì)胞質(zhì)中的DNA量約為105ml.該方法轉(zhuǎn)化效率高，適用于各種材料。在多種植物的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率高達(dá)60以上，如煙草、油菜、苜蓿等。脂質(zhì)體法 是根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)特性，利用脂類化學(xué)物脂類化學(xué)物質(zhì)人工合成細(xì)胞膜質(zhì)人工合成細(xì)胞膜，然后用其將外源基因包然后用其將外源基因包裹形成球體，通過(guò)植物原生質(zhì)體的吞噬或融裹形成球體，通過(guò)植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用，將外

8、源合作用，將外源DNADNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。朱禎等（1990）首次利用這一技術(shù)將人的-干擾素cDNA導(dǎo)入水稻原生質(zhì)體獲得轉(zhuǎn)基因植株?；ǚ酃芡ǖ婪?此法是由我國(guó)的周光宇等（1983）建立并發(fā)展起來(lái)的。主要原理是授粉后使外源授粉后使外源DNADNA能沿著花粉管滲能沿著花粉管滲入，經(jīng)過(guò)珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)入，經(jīng)過(guò)珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞，可用于任何開(kāi)花胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞，可用于任何開(kāi)花植物。植物。1983年周光宇等利用此法將外源DNA成功導(dǎo)入棉花.目前該技術(shù)已在小麥、棉花、蔬菜作物中有報(bào)道?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ且环N直接簡(jiǎn)便的轉(zhuǎn)化

9、方法，不需要組織培養(yǎng)的繼代，從而排除了植株再生的障礙，是一種應(yīng)用廣泛的外源DNA直接導(dǎo)入技術(shù)。碳化硅纖維法 應(yīng)用直徑為0.6m、長(zhǎng)度為10-80 m的碳化纖維，使附著于纖維或細(xì)胞壁上的質(zhì)粒DNA借助于在渦旋引起的相互碰撞過(guò)程中纖維對(duì)細(xì)胞纖維對(duì)細(xì)胞的穿刺作用而導(dǎo)入細(xì)胞的穿刺作用而導(dǎo)入細(xì)胞。該方法簡(jiǎn)單、快速、成本低，且受體類型廣泛。超聲波法 是一種新的外源DNA導(dǎo)入方法，其基本原理是利用低聲強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用，擊穿細(xì)利用低聲強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用，擊穿細(xì)胞膜造成通道，使外源胞膜造成通道，使外源DNADNA進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞。賈士榮等于1991年發(fā)展了這一新的轉(zhuǎn)化方法。該方法操作簡(jiǎn)便，設(shè)備便宜，

10、不受宿主范圍限制，轉(zhuǎn)化效率高，不足之處在于易使外源不足之處在于易使外源DNADNA分子分子發(fā)生斷裂。發(fā)生斷裂。激光微束法 激光微束法是新興的轉(zhuǎn)化技術(shù)。其基本原理是將激光引入光學(xué)顯微鏡聚焦成微米級(jí)的微束照射培養(yǎng)細(xì)微米級(jí)的微束照射培養(yǎng)細(xì)胞后，在細(xì)胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使加胞后，在細(xì)胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使加入細(xì)胞培養(yǎng)基里的外源入細(xì)胞培養(yǎng)基里的外源DNADNA流入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的流入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移。Kuruta（1986）首先將此方法應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，用此法現(xiàn)已獲得油菜、水稻、小麥等轉(zhuǎn)化植株。該方法所需儀器設(shè)備昂貴，轉(zhuǎn)化率較低，設(shè)備昂貴，轉(zhuǎn)化率較低，穩(wěn)定性、安全性等方

11、面不及電擊法和基因槍法。穩(wěn)定性、安全性等方面不及電擊法和基因槍法。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法步驟1、農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備：取5 ml YEP 培養(yǎng)基于滅菌的50ml離心管中，加入Kan50mg/L,取單菌落于單菌落于25252929 C C、250r/min250r/min振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)30h30h。將以上菌液在2800r/min離心15min，去上清液，用冷藏的YEP液體培養(yǎng)基（加入AS 100M，Kan50mg/L,Rif25mg/L）20ml稀釋ODOD600600=0.8-1.0=0.8-1.0待用待用。2、共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化： 將繼代增殖47d的生長(zhǎng)健壯（結(jié)構(gòu)緊密、質(zhì)地均一）的水稻水稻盾片愈傷組織移入無(wú)菌培養(yǎng)皿

12、，倒入農(nóng)桿菌菌液，浸泡盾片愈傷組織移入無(wú)菌培養(yǎng)皿，倒入農(nóng)桿菌菌液，浸泡202030min30min。隨后將愈傷組織塊用無(wú)菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)移到NBco培養(yǎng)基上,于于25-28 25-28 C C暗培養(yǎng)暗培養(yǎng)2-3d2-3d。共培養(yǎng)結(jié)束后，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)洗滌多次無(wú)菌蒸餾水反復(fù)洗滌多次（10次以上），再用含Tou500mg/L和cb200mg/L的無(wú)菌水（或NBwa）充分洗滌（振蕩24h）。無(wú)菌濾紙吸干，在無(wú)菌濾紙上干燥數(shù)小時(shí)，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入NB2NB2預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)1 1 星期。星期。Kan：Kanamycin，卡那霉素；AS：acetosyringone，乙酰丁香酮；Rif:fifampicin,利福平

13、；Tou：頭孢霉素；cb:羧芐青霉素。YEP：950ml去離子水中加10g tryptone,10g 酵母提取物，NaCl 5g,pH7.0-7.2,定容至1L，高壓滅菌。NBco:NB2,乙酰丁香酮 100 M；NB2：NB成分，2，4D。NB培養(yǎng)基見(jiàn)植物基因工程操作手冊(cè)。Nbwa:NB成分，頭孢霉素500m g/L和羧芐青霉素200mg/L?；驑屴Z擊法轉(zhuǎn)化步驟 將增殖并經(jīng)甘露醇高滲處理將增殖并經(jīng)甘露醇高滲處理6h6h的愈傷組織放于培養(yǎng)皿的愈傷組織放于培養(yǎng)皿（d=9cmd=9cm）中心）中心，約每皿3030塊塊愈傷組織。采用Bio Rad PDS-1000/He 基因槍裝置。取金粉懸液金粉懸液（60mg 金粉用無(wú)水乙醇消毒，懸浮于1ml無(wú)菌水中）50 50 L L 、加入5 5 g g質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA、 2.5M CaCl2 50 l、0.1M 亞精胺溶液20 l，充分混勻充分混勻，離心，無(wú)水乙醇清洗