靶向PCRCTC檢測技術幫助臨床醫(yī)生更全面地評估肺癌

1、靶向靶向PCRCTC檢測技術幫助臨床醫(yī)生更全檢測技術幫助臨床醫(yī)生更全面地評估肺癌面地評估肺癌Lung Cancer in Solid Tumor in China=？液態(tài)活檢液態(tài)活檢通過外周血中的腫瘤細胞或者腫瘤基因組信息來評估腫瘤病理活檢病理活檢通過原發(fā)灶腫瘤組織來評估腫瘤 CTC ctDNA mircoRNA LNC RNAOthers 傳統(tǒng)的組織細胞學檢測液態(tài)活檢在肺癌中的應用液態(tài)活檢在肺癌中的應用治療策略事件肺癌待查輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復發(fā)監(jiān)測治療方案選擇療效評估耐藥機理新藥研發(fā)治療策略事件疑似肺癌輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復發(fā)監(jiān)測治療方案選擇耐藥機理新藥研發(fā)CTC的

2、臨床應用價值療效評估CTC(數(shù)量）(負向富集+靶向PCR）ctDNA(基因變異）1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015什么是循環(huán)腫瘤細胞（什么是循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor CellCirculating Tumor Cell，CTCCTC）？）？腫瘤釋放如外周血中腫瘤釋放如外周血中CTCsCTCs數(shù)量的多少，數(shù)量的多少，可間接反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)可間接反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)CTCCTC：在腫瘤發(fā)生過程中，具有干細胞特征的腫瘤細

3、胞和不具有干細胞特征的腫瘤細胞，均由原發(fā)腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統(tǒng)稱循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell）CTC1CTCCTC有轉移有轉移：侵入第二器官CTCs，稱之為DTC（disseminated Tumor Cell），只有由具有干細胞特征干細胞特征的DTC所形成的微形成的微轉移灶轉移灶，逃避免疫識別逃避免疫識別才可能發(fā)展成為腫瘤遠處轉移2第9周的乳腺管組織切片：乳腺管周圍非典型性增生第30周的腫瘤組織切片：新生的腫瘤上皮細胞形成牙槽并侵襲周圍基質CK+ cellsHER-2+ cells什么時候可以檢測到CTC？早期腫瘤外周血中即可檢出CTCW He, et a

4、l. Proc Natl Acad Sci, 2007早期腫瘤外周血中即可檢出CTCl表達中等量FR的M109鼠肺癌細胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側面l移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個CTC細胞l移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測7個和18個CTC，隨著腫瘤逐漸增大數(shù)量呈指數(shù)上升l在腫瘤移植的前4周內，沒有在任何組織切片中發(fā)現(xiàn)到存在轉移性癌癥的跡象CTC富集技術密度與大小免疫磁珠（負向富集 or 陽性富集)微流體CTC檢測方法CTC檢測技術靶向PCR免疫熒光普通PCR=+“方法”“收獲”“垃圾”蟹餌沒水了，我們躲不了了放水負向富集負向富集優(yōu)勢

5、：回收率100%劣勢：純度略低正向富集正向富集優(yōu)勢：純度高劣勢：回收率低（漏掉CTC）幸好沒貪嘴，我們逃了“方法”“收獲”“垃圾”沒水了，我們躲不了了放水負向富集負向富集優(yōu)勢：回收率100%劣勢：純度略低大小富集（大小富集（ISETISET）優(yōu)勢：簡單劣勢：漏掉小的CTC細胞幸好沒吃胖，我們逃了網篩CytoploRare （FR靶向PCR CTC檢測技術）檢測原理負向富集負向富集靶向靶向PCRPCRFRFR陽性靶標陽性靶標肺癌細胞FR(葉酸受體）高度表達CTC：FR=1:50萬EMT轉化不影響FR豐度其他血細胞不表達FRCTC回收率接近100%磁珠富集易操作和自動化靈敏度超高靈敏度超高，負向富

6、集可滿足檢測要求信號二次放大，1個CTC信號放大1012倍無需人工經驗判讀，結果客觀準確可實現(xiàn)CTC的定量CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測靶向PCR，信號放大，保證高度敏感性1個CTC信號放大1012倍優(yōu)勢一：陰性富集不丟失循環(huán)腫瘤細胞優(yōu)勢二：靶向探針特異性高優(yōu)勢三：PCR擴增信號，確保高敏感性優(yōu)勢四：PCR儀判斷CTC技術，避免人為誤差CytoploRarel 敏感性l 特異性l 可重復性l 臨床應用便捷性CytoploRarel 敏感性l 特異性l 可重復性l 臨床應用便捷性3mL血1mL/3mL血3mL血1個CTC/3mL血50萬FR/1個CTC1個CTC/1slide

7、100萬信號/1個FR1個信號/1個CTCFR靶向PCR 1個CTC細胞信號方法細胞免疫熒光 1個CTC細胞信號幾乎沒有放大CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測敏感性試驗：1ctc in 1,200,000白細胞Jiatao Lou, et al. Plos One 2013l 將不同數(shù)量的FR陽性腫瘤細胞分別摻入3ml全血(1.2-3.0X107）l FR靶向PCR CTC檢測技術的回收率接近100%，且呈線性分布l檢測靈敏度約為5.09/（1.23*107）=1/240萬600萬摻入細胞數(shù)量摻入細胞數(shù)量( (個個) )檢出細胞數(shù)量檢出細胞數(shù)量(CU)(CU)復管復管1 1復管

8、復管2 2復管復管3 3檢測均值檢測均值檢出細胞數(shù)檢出細胞數(shù)( (個個) )回收率回收率(%)(%)平均回收率平均回收率(%)(%)R R600571.52 565.13 586.37 574.34 584.12 97.35 98.75 0.9998400372.13 372.99 379.75 374.96 379.59 94.90 200198.93 192.81 185.90 192.55 192.46 96.23 10093.66 96.73 90.08 93.49 90.84 90.84 5056.56 52.07 50.80 53.14 49.44 98.89 2020.43 24

9、.58 23.87 22.96 18.48 92.40 1017.48 17.16 14.56 16.40 11.75 117.51 59.90 9.26 10.58 9.91 5.09 101.87 05.00 5.44 4.40 4.95 0.00 /l 將不同數(shù)量的FR陽性腫瘤細胞分別摻入3ml全血(1.2-3.0X107）l 檢測靈敏度約為5.09/（1.23*107）=1/240萬600萬CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測敏感性試驗：1ctc in 6,000,000白細胞CytoploRarel 敏感性l 特異性l 可重復性l 臨床應用便捷性CytoploRare

10、FR靶向PCR CTC檢測技術FR（葉酸受體，高度特異性的靶向探針）l 特異性高：特異性高：加入FR靶向探針前，加入高濃度葉酸封閉細胞表面的葉酸受體，檢測結果為陰性l 背景表達：背景表達：去除FR靶向探針，僅保留特異性DNA片段，與保留FR靶向探針相比，檢測結果一致，提示背景可能為特異性DNA片段所致的固定值Jiatao Lou, et al. Plos One 2013Cell Search:正向富集+免疫熒光技術進行捕獲和鑒定22EpCAM 上皮細胞粘附分子 APC 異藻藍蛋白熒光染料 CK 細胞角蛋白 PE 藻紅蛋白熒光染料 DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA熒光染料） 上皮

11、細胞白細胞抗抗 EpCAM 磁流體磁流體EpCAM 抗原抗原CD45 抗原抗原CK 抗原抗原抗 CD45-APC 染料抗 CK-PE 染料熒光染料熒光染料EpCAM陰性細胞中，存在大量CTC Cell Research系統(tǒng)主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做為探針 研究證實，EpCAM陰性的細胞中也存在CTCJiatao Lou, et al. Plos One 20132004Cell Search: 乳腺癌中檢測出，但肺癌敏感性低2011Cell Research: 采用的抗體采用的抗體(EpCAM)對對EMT細胞特異性差細胞特異性差，而肺癌細胞轉移入血需要EMT的過程l 有報道，部分激活

12、的巨噬細胞存在FR的高表達1l 臨床前研究證實，這部分巨噬細胞很少在正常人的外周血中出現(xiàn)2l 使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬細胞后，CTC的檢測結果無明顯改變31、He W, et al. Int J Cancer 2008; 2、He W, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007; 3、Jiatao Lou, et al. Plos One 2013CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術巨噬細胞（可能存在FR表達）不影響檢測結果CytoploRarel 敏感性l 特異性l 可重復性l 臨床應用便捷性CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術

13、同一患者重復檢測，可重復性高CytoploRarel 敏感性l 特異性l 可重復性l 臨床應用便捷性3mL血6個小時得到報告檢測流程檢測流程肺癌領域，CTC檢測技術對比CytoploRare（格諾）CellSearchCyttelTM（北京萊爾）CanpatrolTM（益善）CTC-Biopsy（武漢友之友)核心技術免疫磁珠負向富集靶向配體PCR技術 流式正向富集技術熒光標記免疫磁珠負向富集、Fish技術ISET（濾膜）原位雜交RNA分析ISET（濾膜)熒光標記特異性88%80%83%75%70%靈敏度80%30%腺癌：46%30%30%自動化半自動全自動半自動半自動全自動血樣體積3mL7.5

14、mL4mL5mL10mL適應癥早、中和晚期早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌腫晚期癌腫早期（I期）敏感性67%0%20%(2/10)未報道未報道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%報告時間6h/12樣本樣本6h/8樣本48h/1樣本48h/1樣本3天可視化否否是是是是唯一獲得CFDA批準的肺癌CTC檢測試劑盒CTCsCTCs：可反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)：可反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)Cancer Control, 2015肺癌輔助診斷降低胸部降低胸部CTCT假陽性率，減少肺癌漏診假陽性率，減少肺癌漏診肺癌化療療效評估評估腫瘤

15、功能活性狀態(tài)，彌補評估腫瘤功能活性狀態(tài)，彌補RECISTRECIST標準不足標準不足CTCsCTCs：可反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)：可反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)Cancer Control, 2015肺癌輔助診斷降低胸部降低胸部CTCT假陽性率，減少肺癌漏診假陽性率，減少肺癌漏診肺癌化療療效評估評估腫瘤功能活性狀態(tài)，彌補評估腫瘤功能活性狀態(tài)，彌補RECISTRECIST標準不足標準不足1210例受試者肺癌560例肺部良性疾病350例其他腫瘤 (150例) 肝癌 30例結直腸癌 30例 乳腺癌 30例 胃癌 30例 食管癌 30例331例A A100例B B 50例C C（21例DD) 79例D

16、 DA: 基線CTC檢測B：術前術后CTC監(jiān)測C：一線含鉑雙藥化療中CTC監(jiān)測D：基線CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE檢測 300例A A 50例D D健康人150例100例A A 50例D D150例A A非動態(tài)研究非動態(tài)研究 肺癌 560例A A肺部良性疾病 350例A A 健康人 150例A A 動態(tài)監(jiān)測研究動態(tài)監(jiān)測研究 非小細胞肺癌 100例B B 50例C C對比研究對比研究 肺癌 100例D D 肺部良性疾病 50例D D 健康人 50例D D腫瘤特異性研究腫瘤特異性研究 其他腫瘤 150例A A CytoploRare（FR靶向PCR CTC檢測）臨床試驗設計（

17、1210例, 最大樣本量）Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015特特征征例數(shù)例數(shù)(%)(%)肺癌（肺癌（n=560n=560）年齡（平均值，范圍）59.3歲(21-79歲)性別（男性/女性）349/211TNMTNM分期分期期期150(26.8%)150(26.8%)期48(8.6%)期157(28.0%)期205(36.6%)病理亞型病理亞型非小細胞肺癌465(83.0%)肺腺癌320(68.8%)肺鱗癌107(23.0%)大細胞肺癌5(

18、1.1%)肺腺鱗癌1(0.2%)其他非小細胞肺癌32(6.9%)小細胞肺癌81(14.5%)其他肺癌14(2.5%)肺部良性疾?。ǚ尾苛夹约膊。╪=350n=350）年齡（平均值，范圍）50.1歲(18-80歲)性別（男性/女性）310/140健康人健康人（n n=150=150）年齡（平均值，范圍）34.7歲(22-60歲)性別（男性/女性）69/81患者特征Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015不同CTC計數(shù)對于肺癌診斷的特異性與敏感性

19、CTCCTC計數(shù)計數(shù)診斷肺癌敏診斷肺癌敏感性感性診斷肺癌特診斷肺癌特異性異性2.099.5%2.3%4.096.1%21.3%6.089.5%44.8%8.778.0%83.6%10.068.1%90.3%12.054.1%95.2%95.2%14.040.1%97.6%97.6%16.027.6%98.1%98.1%18.020.5%98.6%98.6%20.016.2%99.5%99.5%CytoploRare（FR靶向PCR CTC檢測） 葉酸受體陽性CTC作為診斷標志物 最大樣本量最大樣本量CTCCTC檢測數(shù)據檢測數(shù)據 CutoffCutoff： 8.70 CTC Units/3mL敏

20、感性：敏感性：79.6%79.6%特異性：特異性：88.2%88.2%Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2013; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015AUC: 0.8797020406080100All NSCLCSStage Stage Stage and CTCCEANSE CA211 SCCASensitivity%CytoploRare（FR靶向PCR CTC檢測） 所有肺癌，敏感性提高3倍；I期肺癌提高10倍CTCCTCCEACEA NSENSE CA211CA211 S

21、CCASCCAAll80.9%80.9%33.8%25.4%25.4%49.7%29.5%Stage67.5%67.5%11.3%5.6%5.6%28.6%8.8%Stage61.9%30%6%55%24.7%Stage、83.2% 37.3%30%52%30.1%CTC對肺癌的診斷顯著優(yōu)于一般腫瘤標志物輔助診斷輔助診斷指標指標AUCAUC值值P P值值CTCCTC0.910.91P0.0001P0.0001CEA0.56NSE0.61CYFRA21-10.71SCCA0.49 CTC與一般腫瘤標志物對肺癌診斷的準確性（AUC值）單項CTC檢測的輔助診斷價值優(yōu)于多個一般腫瘤標志物聯(lián)合AUC=0

22、.91, P0.0001AUC=0.76不同病理類型中，CTC輔助診斷價值均優(yōu)于一般腫瘤標志物CTC對期肺癌的陽性檢出率高達67.2%其他最優(yōu)的腫瘤標志物的敏感度僅為32.3%1cm肺癌總體敏感性: 62.5%患者編號患者編號CTC Units/3mL病理診斷病理診斷TNM分期分期臨床分期臨床分期-整理整理nodule diameter（CT）1 10.53 肺腺癌T1aN0M00.32 0.04 肺腺癌T1N0M00.33 3.83 肺腺癌T1N0M00.54 8.78 肺腺癌tisTis0.55 8.77 肺腺癌T1aN0M00.66 3.93 肺腺癌T1N0M00.77 3.98 肺腺癌

23、T2aN0M00.88 4.84 肺腺癌T1N0M00.89 10.32 肺腺癌T1aN0M0110 13.55 肺鱗癌T1N0M0111 6.29 肺腺癌T1aN0M0112 12.65 肺腺癌T1N0M0113 14.999074肺腺癌T1aN0M00.314 2.5497534肺腺癌T1aN0M00.515 6.2322726肺腺癌T1aN0M00.516 11.312907肺腺癌T1aN0M00.617 14.444199肺腺癌T1aN0M00.618 7.1141741肺腺癌T1aN0M00.719 11.134588肺腺癌T1N0M00.720 11.56小細胞肺癌T2aNxM00

24、.721 13.461248肺腺癌T1aN0M00.722 10.009388肺腺癌T1aN0M00.823 17.296369肺腺癌T1aN0M00.824 10.44506其他肺癌T1aN0M00.925 11.8572肺腺癌T1aN0M00.926 8.7681014其他肺癌T1aN0M0127 10.092346肺腺癌T1N0M0128 11.787912肺腺癌T1aN0M0129 9.2499084肺腺癌T1aN0M0130 12.696456肺腺癌T1aN0M0131 13.279299肺腺癌T1aN0M0132 15.906467肺腺癌T1aN0M01腫瘤大小CT特異性（） CT

25、CTC特異性（）30 mm (n134）59.79420-30 mm (n44 )65.995.510-20mm (n69 )55.192.810mm (n21)61.995.2CTC聯(lián)合CT可以大大提高小結節(jié)診斷的特異性CTC輔助CT可以將小結節(jié)的判別假陽性率降低到16: 8/12（75%）患者）患者PR，DCR 100%l 8.7CTC16: PFS 448天天l 8.7CTC16: PFS 94天天Cut off為16cu/3ml, 高表達患者的PFS明顯優(yōu)于低表達者總結 靶向靶向PCR CTCPCR CTC檢測技術檢測技術敏感度最高，反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)，可做為新一代腫瘤標志物新

26、一代腫瘤標志物更全面幫助臨床診療 肺癌輔助診斷 CTC的診斷價值顯著優(yōu)于顯著優(yōu)于一般腫瘤標志物 靶向PCR CTC技術：所有肺癌敏感性提高3 3倍，I期肺癌提高1010倍 肺癌化療療效評估 反應腫瘤功能狀態(tài)，聯(lián)合胸部CT評估腫瘤更全面更全面 對化療療效為SDSD患者患者及RECISTRECIST評估緩慢進展評估緩慢進展患者的評估價值，尤其重要l 目前常規(guī)檢測肺癌轉移和評價治療效果的方法主要是胸部CTl 胸部胸部CTCT只能評價腫瘤的大小部位，無法評估腫瘤的動態(tài)功能只能評價腫瘤的大小部位，無法評估腫瘤的動態(tài)功能l CTC CTC檢測做為檢測做為新一代腫瘤標志物新一代腫瘤標志物，敏感度更高，可用于

27、評估腫瘤發(fā)生發(fā)展的功，敏感度更高，可用于評估腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)。能狀態(tài)。CTCCTC聯(lián)合胸部聯(lián)合胸部CTCT， 更全面的評估腫瘤更全面的評估腫瘤優(yōu)勢一：陰性富集不丟失循環(huán)腫瘤細胞優(yōu)勢二：靶向探針特異性高優(yōu)勢三：PCR擴增信號，確保高敏感性優(yōu)勢四：PCR儀判斷CTC技術，避免人為誤差3mL血1mL/3mL血3mL血1個CTC/3mL血50萬FR/1個CTC1個CTC/1slide100萬信號/1個FR1個信號/1個CTCFR靶向PCR 1個CTC細胞信號方法細胞免疫熒光 1個CTC細胞信號幾乎沒有放大3mL血1mL/3mL血3mL血1個CTC/3mL血50萬FR/1個CTC1個CTC/1sl

28、ide100萬信號/1個FR1個信號/1個CTCFR靶向PCR 1個CTC細胞信號方法細胞免疫熒光 1個CTC細胞信號幾乎沒有放大3mL血1mL/3mL血3mL血1個CTC/3mL血50萬FR/1個CTC1個CTC/1slide100萬信號/1個FR1個信號/1個CTCFR靶向PCR 1個CTC細胞信號方法細胞免疫熒光 1個CTC細胞信號幾乎沒有放大CTC對期肺癌的陽性檢出率高達67.2%其他最優(yōu)的腫瘤標志物的敏感度僅為32.3%1cm肺癌總體敏感性: 62.5%患者編號患者編號CTC Units/3mL病理診斷病理診斷TNM分期分期臨床分期臨床分期-整理整理nodule diameter（C

29、T）1 10.53 肺腺癌T1aN0M00.32 0.04 肺腺癌T1N0M00.33 3.83 肺腺癌T1N0M00.54 8.78 肺腺癌tisTis0.55 8.77 肺腺癌T1aN0M00.66 3.93 肺腺癌T1N0M00.77 3.98 肺腺癌T2aN0M00.88 4.84 肺腺癌T1N0M00.89 10.32 肺腺癌T1aN0M0110 13.55 肺鱗癌T1N0M0111 6.29 肺腺癌T1aN0M0112 12.65 肺腺癌T1N0M0113 14.999074肺腺癌T1aN0M00.314 2.5497534肺腺癌T1aN0M00.515 6.2322726肺腺癌T1aN0M00.516 11.312907肺腺癌T1aN0M00.617 14.444199肺腺癌T1aN0M00.618 7.1141741肺腺癌T1aN0M00.719 11.134588肺腺癌T1N0M00.720 11.56小細胞肺癌T2aNxM00.721 13.461248肺腺癌T1aN0M00.722 10.009388肺腺癌T1aN0M00.823 17.296369肺腺癌T1aN0M00.824 10.44506其他肺癌T