海藻糖生物轉化生產新技術

1、海藻糖生物轉化生產新技術1研究背景1.1海藻糖的分子結構及理化性質海藻糖（Trehalose）是由兩個葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵連結而成，分子內不存在游離的半縮羥基，是一種穩(wěn)定的非還原性二糖。海藻糖有3種光學異構體，其中型和型在自然界中很少存在，而型是最常見的海藻糖。圖a.海藻糖的分子結構（型）海藻糖無色無嗅，具很強的熱穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，對蛋白質、核酸、細胞膜等活體成分有很強的穩(wěn)定作用，在活體受到外界壓力（如干燥、凍結、滲透壓等）時有保護作用。1.2海藻糖的來源海藻糖廣泛存在于植物（藻類）、細菌、真菌、酵母和無脊椎動物體內（昆蟲）。1.3海藻糖的工業(yè)應用由于海藻糖具備穩(wěn)定的細胞膜和

2、蛋白質結構，海藻糖具有抗冷凍性、保濕性、耐高溫性、干燥抗性、非還原性等良好的加工特性，加之外源性的海藻糖具有良好的非特異性保護作用，因此廣泛應用于食品、醫(yī)藥、精細化工和化妝品等領域。海藻糖可作為冷凍食品的保護劑。使用淀粉的食品，易因淀粉的老化而變硬，出現(xiàn)松散、白濁等現(xiàn)象，工業(yè)上主要通過添加糖類抑制淀粉老化，而其中海藻糖防止淀粉老化的作用明顯優(yōu)于其他糖類。在有效的保護蛋白質分子的天然結構的同時，也保持了食品的質地和風味。目前已成功利用海藻糖干燥的食品有牛奶、咖啡、果汁、脫水蔬菜等。海藻糖甜度低，滲透壓與蔗糖相當，具有抗齲齒功能，可在食品中代替蔗糖使用。作為保護牙齒食品的甜味劑廣泛應用于各種糖果、

3、口香糖、糕點、飲料、冰淇淋、巧克力等。海藻糖具有保護生物分子的獨特功能，是生物分子的特效保護劑和組織細胞的穩(wěn)定劑，為醫(yī)用生物制品，如血液制品、酶、疫苗、病毒、激素、單克隆抗體、重組人體蛋白等的干燥保存、運輸和使用帶來極大的方便。英國劍橋Quadsant公司和WHO進行合作，利用海藻糖干燥脊髓灰質炎疫苗，解決從生產地到第三世界一些國家的長途運輸中的冷凍問題，統(tǒng)計僅此一項即可節(jié)省數(shù)百萬美元的冷凍系統(tǒng)費用。海藻糖也可應用于保健品產業(yè)?；罹苿┦钱斀癖＝∑返拈_發(fā)熱點，但活菌在人體腸道內的存活率難以保證。如果能將海藻糖作為干燥保護劑，制成具有較高活力的菌粉，再用只能在腸道溶解的材料包裝，生產出口服腸溶膠

4、囊，將會大大提高活菌制劑的生物效價。糖脂是最重要的一類生物表面活性劑，海藻糖酯酶具有良好的表面活性性能，可用于石油的三次開采、日化、紡織等工業(yè)。另外海藻糖基本上不被牙齒所帶的微生物發(fā)酵，可作為保護性增香劑，其結晶形式可與粘結劑如羥乙基淀粉等一起用作糖衣材料。海藻糖具有保濕、防曬、防紫外線功效，所以可作為保濕劑、保護劑、紫外吸收劑等用于皮膚化妝品、洗面奶。還可作為甜味劑、改良劑用于唇膏、口腔清涼劑、口腔芳香劑等。1.4海藻糖的生產途徑 海藻糖生產方法主要有合成法、發(fā)酵法、提取法、酶轉化法以及基因工程法。海藻糖的化學合成法是在2,3,4,6-四乙?；咸烟呛?,4,6-三乙酰-1,2-脫水-D-葡

5、萄糖之間產生環(huán)氧乙烷加成生成。發(fā)酵法主要步驟是通過采用誘變、細胞融合或基因重組等方法培育出高產海藻糖的菌株，采用優(yōu)化培養(yǎng)基和適宜的條件發(fā)酵，再采用有效分離提取技術對發(fā)酵產物進行精制。目前可利用的微生物主要包括酵母、革蘭氏陽性菌，特別是微球菌屬。提取法主要是指微生物提取法，也可從植物中提取，但該方法成本太高，產率太低未見工業(yè)化應用。微生物提取法是以酵母、乳酸菌、霉菌及其它含海藻糖的微生物為提取源通過發(fā)酵優(yōu)化等提取出海藻糖，以酵母為主。早期商品化的海藻糖是從酵母中提取的，該方法主要是培養(yǎng)酵母菌株到對數(shù)生長期，然后通過對培養(yǎng)條件的控制，使酵母細胞處于脅迫環(huán)境中(如營養(yǎng)饑餓、高溫、高滲透壓、干燥和冷凍

6、等)，造成酵母菌體內海藻糖的含量顯著增加，可達細胞十重的20，然后利用乙醇等有機溶劑從酵母菌中抽提純化海藻糖。2000年，南寧中諾生物工程有限責任公司利用此酶系成功開發(fā)出酶法轉化木薯淀粉生產海藻糖的工藝，使我國成為世界上第2個酶法工業(yè)化生產海藻糖的國家。短鏈糊精該工藝利用短鏈糊精，經MTSase和MTHase作用轉化生產海藻糖。2002年，我國結晶海藻糖產量達到200 t，價格為79元kg，海藻糖在我國也開始應用于食品加工行業(yè)。各種方法特點比較見表。表1.海藻糖生產方法的比較方法應用實例特點合成法至今未實用化產率低、分離困難微生物發(fā)酵提取法日本味之素株式會社利用氨基酸生產菌已實現(xiàn)海藻糖工業(yè)化生

7、產提取效率低，成本過高酶轉化法磷酸化酶法1998年日本有過商業(yè)化報道需消耗高能物質且磷酸化酶不穩(wěn)定雙酶法1994年日本林原生化研究所（轉化率可達80%）以直鏈淀粉為底物轉化率高合成酶法1995年發(fā)明，是目前研究熱點之一底物為麥芽糖反應時間過長，反應溫度低基因工程法轉基因植物法把合成海藻糖的基因引入果蔬植物中，使海藻糖在作物中自行積累含量低成本高基因工程菌將酶基因轉入微生物宿主中高效表達并合成海藻糖，或構建基因工程菌高效表達海藻糖合成相關的酶，在體外將底物轉化為海藻糖成本低高效合成法和提取法產率過低，且成本較高，無法進行工業(yè)化應用；而磷酸化酶法需消耗高能物質，加之磷酸化酶本身不穩(wěn)定也不適用于工業(yè)

8、生產。目前應用較多的是海藻糖合成酶一步反應法和雙酶法。海藻糖合成酶法以麥芽糖為直接底物，工藝簡單，轉化率高，但反應時間過長，反應溫度低（一般為20-30）。而雙酶法以直鏈淀粉為底物，通過兩種酶的反復反應最終形成海藻糖。工業(yè)上常用脫支酶進行淀粉初步水解為雙酶法提供底物。現(xiàn)代工業(yè)生產中也常常使用基因工程法（特別是構建基因工程菌）與酶轉化法結合。綜合以上方法的特點，本實驗選用基因工程菌與雙酶法結合的方法2研究內容構建基因工程菌高效表達海藻糖合成相關的兩種酶麥芽寡糖基海藻糖合成酶(Mahooligosyl trehalose synthase，MTSage，EC549915)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(

9、Malt001igosyl trehalose trehalohyrolase，MTHase，EC321141)，其中MTSase作用于底物還原性末端產生,1，4糖苷鍵到-1，1糖苷鍵的分子內轉糖基作用，形成中間產物麥芽寡糖基海藻糖；MTHase則專一地內切該中間產物中麥芽寡糖基與海藻糖相連的-1，4糖苷鍵，使之分解產生海藻糖和減少2個葡萄糖單位的新麥芽寡糖如此反復交替進行2種酶反應就可以將麥芽寡糖或直鏈淀粉轉化成主要為海藻糖，以及少量葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖的產物。而配合脫支酶基因工程菌，三種酶共同作用可將可溶性淀粉最終轉化為海藻糖。實驗選取pHY300-PLK穿梭質粒為載體，先進行誘導型啟動子的克隆，然后進行報告基因的克?。╔1，Y1，Z1），三種基因功能見下表；轉入表達宿主中進行發(fā)酵試驗，最終得到所需的海藻糖。表2.三種報告基因表達產物基因表達產物X1GlgXY1MTSaseZ1MTHase3實驗進展3.1誘導型啟動子的克隆3.