實時電化學–熒光光譜法研究抗癌藥物與生物分子的作用

1、實時電化學熒光光譜法研究抗癌藥物與生物分子的作用1、項目研究意義自80年代初唐有祺院士等提出研究“生命過程中的化學問題”，并組織“攀登計劃”以來，人們從分子的基礎研究和了解生物大分子之間、化學小分子與生物大分子之間的相互作用，以及這些作用對生命體系的調(diào)節(jié)、控制，為生命科學的研究創(chuàng)造了新的技術和理論。新興的化學生物學開始成為21世紀一個重要的化學研究領域，是當前學科發(fā)展的前沿。研究生物分子尤其是核酸和蛋白質(zhì)分子與小分子之間的相互作用，在醫(yī)學、藥學及生物學等領域都具有重要的意義13。核酸是生物體的重要組成物質(zhì)，遺傳信息的攜帶者和基因表達的物質(zhì)基礎，它在生物的生長、發(fā)育和繁殖等活動中具有十分重要的作

2、用。例如，大多數(shù)抗癌藥物進入體內(nèi)后都以DNA作為靶分子，因此，研究小分子與DNA的作用方式在藥物尤其是抗癌、抗艾滋病新藥的設計和研制工作中具有舉足輕重的地位，可以為藥物的定向合成提供理論依據(jù)，從而使生產(chǎn)按預定方式作用于DNA中特定位置的毒副作用小的抗癌藥物成為可能4,5。同樣，蛋白質(zhì)也是生物體內(nèi)具有重要生理功能的大分子，血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，可以同許多內(nèi)源性和外源性的化合物結(jié)合起到存儲與轉(zhuǎn)運作用，通過研究白蛋白與藥物分子的相互作用可以了解藥物在體內(nèi)的運輸過程以及作用機制69。俞英等10用分光光度法研究發(fā)現(xiàn)酸性品紅與牛血清白蛋白的作用符合Plavento的相分配模型。Ghabi等11

3、用紫外分光光度法研究發(fā)現(xiàn)咖啡因-水-多肽體系之間的相互作用類型取決于多肽的性質(zhì)。Andrade等12采用熒光法研究發(fā)現(xiàn)血卟啉和兩種藥物載體蛋白的作用與溶液的pH有關。張曉威等13采用熒光法研究發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星與牛血清白蛋白的作用為單一的動態(tài)猝滅過程。計亮年等14利用CD光譜研究-和-Ru(bpy)2(HPIP)2+兩種異構體與小牛胸腺DNA作用的鍵合速率及方式，并提出由動力學控制的-和-兩種異構體對DNA的分子識別機理。陳亞紅等15研究了煙酸胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)抑制血紅蛋白催化H2O2氧化L-酪氨酸屬于競爭性抑制，提出了熒光測定NADH的新方法。程圭芳等16用電化學技術研究發(fā)現(xiàn)阿克拉霉素-

4、A的代謝過程為一步二電子還原。王素芬等17用循環(huán)伏安等方法研究了雙苯并咪哇衍生物與DNA的相互作用，發(fā)現(xiàn)結(jié)合方式主要為包含4個堿基對的緊密小溝結(jié)合。總之，光譜方法在蛋白質(zhì)、DNA等生物分子與小分子的相互作用研究中應用極為廣泛。通過熒光分析可以了解生物分子與小分子作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及作用方式等信息68；小分子與生物大分子結(jié)合前后，兩者之一的吸收光譜有了一定差別，則可以采用紫外可見分光光度法進行研究，且具有簡便準確的特點，但紫外可見光譜所反映的信息量有限；圓二色譜對手性分子的結(jié)構十分敏感，可反映出含手性非對稱分子內(nèi)部結(jié)構的一些信息，是測定生物大分子構象及其變化較為有效的方法，因而該方法已成

5、為研究分子構型及分子間相互作用的重要光譜手段之一；紅外光譜可以提供關于蛋白質(zhì)二級結(jié)構的譜學信息，而二級結(jié)構直接受蛋白質(zhì)與小分子作用的影響，因此適合于相互作用分析。但由于水的強烈吸收而限制了紅外光譜法對生物組織水溶物質(zhì)的研究；拉曼光譜受水溶劑的影響較小且對分子振動具有指紋式的分辨率，是研究溶液中生物大分子構象的一種較為有效的技術，能夠提供分子骨架構象及堿基對相關情況的大量信息18；以上尚未提及的-射線衍射方法，同樣可以得到準確可靠的晶體學數(shù)據(jù)，也是研究生物分子與小分子作用的一種譜學方法，但該法因難以培養(yǎng)小分子-生物分子復合物晶體而使它的應用受到了限制。本項目采用熒光光譜法與電化學方法研究幾種新型

6、抗癌藥物（埃坡霉素、柔毛霉素、表阿霉素和柔紅霉素等）與生物分子（蛋白質(zhì)、DNA和生物小分子）之間的作用機制；用電化學技術模擬藥物在體內(nèi)氧化還原代謝，熒光光譜實時監(jiān)測抗癌藥物在代謝模型中的代謝過程，研究藥物與生物分子作用的動態(tài)過程以及生物小分子（維生素B1、B2、B6、C、葉酸和煙酸等）對代謝過程和產(chǎn)物的影響，探討抗癌藥物對機體的作用機制和毒理作用。這方面的研究較少報道，具有一定的創(chuàng)新性。拓展該領域的研究對本省化學生物學、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)等的發(fā)展具有一定的意義。2、項目研究目標及與申請者研究工作長期目標的關系； 目標：利用熒光光譜與電化學技術研究幾種新型抗癌藥物（埃坡霉素、柔毛霉素、表阿霉素和柔紅霉素等

7、）與生物分子（蛋白質(zhì)、DNA和生物小分子）之間的作用機制；用電化學技術模擬藥物在體內(nèi)氧化還原代謝，熒光光譜實時監(jiān)測抗癌藥物在代謝模型中的代謝過程，研究藥物與生物分子作用的動態(tài)過程以及生物小分子（維生素B1、B2、B6、C、葉酸和煙酸等）對代謝過程和產(chǎn)物的影響，探討抗癌藥物對機體的作用機制和毒理作用。為進一步研究抗癌藥物對機體的作用機制和毒理作用奠定基礎。本項目是申請者研究工作長期目標的有機構成，申請者一直關注生命過程中生物大分子與化學小分子之間的相互作用、反應，及其對生命運動的影響，從事分子的基礎研究和了解生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸和糖類物質(zhì)等）與小分子探針（試劑、染料和藥物等）的超分子作用及其

8、在生物大分子測定方面的應用基礎研究。3、項目研究內(nèi)容，研究方案和進度安排研究內(nèi)容：1）熒光光譜技術研究抗癌藥物（埃坡霉素、柔毛霉素、表阿霉素和柔紅霉素等）與生物分子（蛋白質(zhì)、DNA和生物小分子）之間的作用：利用抗癌藥物或生物分子的熒光特性，研究其相互作用過程與性質(zhì)，測定有關參數(shù)，探討反應類型與機理。2）電化學技術研究抗癌藥物與生物分子（蛋白質(zhì)、DNA和生物小分子）之間的作用：利用抗癌藥物或生物分子的電化學特性，研究其相互作用過程與性質(zhì)，測定有關參數(shù)，探討反應類型與機理。3）實時電化學-熒光光譜技術研究抗癌藥物與生物分子（蛋白質(zhì)、DNA和生物小分子）之間的作用：根據(jù)以上研究結(jié)果，用電化學技術模擬

9、藥物在體內(nèi)氧化還原代謝，熒光光譜實時監(jiān)測抗癌藥物在代謝模型中的代謝過程，研究藥物與生物分子作用的動態(tài)過程以及生物小分子（維生素B1、B2、B6、C、葉酸和煙酸等）對代謝過程和產(chǎn)物的影響。探討抗癌藥物對機體的作用機制和毒理作用。研究方案：為全面檢測反應過程信息，采用流動注射進樣-停流檢測聯(lián)用技術，400 L流動熒光池，自制實時電化學-熒光檢測池，計算機自動記錄激發(fā)光譜、熒光光譜及相關信號。1）熒光光譜技術研究抗癌藥物與生物分子之間的作用：主要研究人血清白蛋白（BSA）、小牛胸腺DNA與抗癌藥物（埃坡霉素、柔毛霉素、表阿霉素和柔紅霉素等）的作用。以BSA與抗癌藥物的作用為例：實驗在維持生理條件的離

10、子強度0.9%NaCl水溶液、Tris-HCl緩沖液體系中，掃描不同濃度的BSA、抗癌藥物及不同濃度比混合反應體系的激發(fā)和熒光光譜；根據(jù)熒光光譜的特性及其變化，研究相互作用過程與性質(zhì)，探討反應類型與機理；確定或作圖或計算熒光猝滅機理（動態(tài)或靜態(tài)猝滅）、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、結(jié)合位置、供體-受體間結(jié)合距離r等參數(shù)；考察溫度、生物小分子及金屬離子的影響。2）電化學技術研究抗癌藥物與生物分子之間的作用：主要研究BSA、小牛胸腺DNA與抗癌藥物的作用。以小牛胸腺DNA與抗癌藥物的作用為例：實驗在維持生理條件的離子強度0.9%NaCl水溶液、Tris-HCl緩沖液體系中，用循環(huán)伏安等方法掃描有氧和無氧條

11、件下，不同濃度的小牛胸腺DNA、抗癌藥物及不同濃度比混合反應體系的電化學行為；根據(jù)電化學特性及其變化，研究相互作用過程與性質(zhì)，探討抗癌藥物電極反應過程機理、反應中間體和產(chǎn)物及毒性；考察溫度、生物小分子及金屬離子的影響。3）實時電化學-熒光光譜技術研究抗癌藥物與生物分子之間的作用：根據(jù)以上研究結(jié)果，用電化學技術模擬藥物在體內(nèi)氧化還原代謝，熒光光譜實時監(jiān)測抗癌藥物在代謝模型中的代謝過程。主要研究BSA、小牛胸腺DNA與抗癌藥物作用的動態(tài)過程。以BSA與抗癌藥物的作用為例：實驗在維持生理條件的離子強度0.9%NaCl水溶液、Tris-HCl緩沖液體系中，外加合適的電位進行電解的同時，掃描不同濃度的B

12、SA、抗癌藥物及不同濃度比混合反應體系的激發(fā)和熒光光譜；根據(jù)熒光光譜的特性及其變化，研究相互作用過程與性質(zhì)；考察溫度、生物小分子及金屬離子的影響；探討抗癌藥物對機體的作用機制和毒理作用。研究技術路線：0.9%NaCl水溶液Tris-HCl緩沖溶液不同濃度比的抗癌藥物 + BSA；抗癌藥物 + 小牛胸腺DNA不同濃度的抗癌藥物、BSA、小牛胸腺DNA溫度、生物小分子及金屬離子的影響抗癌藥物對機體的作用機制和毒理作用2）電化學技術研究抗癌藥物與生物分子之間的作用電化學行為及變化分子間作用過程、性質(zhì)及相關參數(shù)電極反應過程機理、反應中間體、產(chǎn)物及毒性1）熒光光譜技術研究抗癌藥物與生物分子之間的作用熒光

13、光譜特性及變化分子間作用過程、性質(zhì)及相關參數(shù)反應類型與機理3）實時電化學-熒光光譜技術研究抗癌藥物與生物分子之間的作用模擬藥物在體內(nèi)氧化還原代謝外加合適的電位進行電解的同時，實時監(jiān)測熒光光譜的特性及變化氧化還原代謝過程與機理研究技術關鍵：本項目技術關健是用電化學技術模擬藥物在體內(nèi)氧化還原代謝，熒光光譜實時監(jiān)測抗癌藥物在代謝模型中的代謝過程。自制實時電化學-熒光檢測池，本項目技術關健是用電化學技術模擬藥物在體內(nèi)氧化還原代謝，熒光光譜實時監(jiān)測抗癌藥物在代謝模型中的代謝過程。研究進度：2006年1月2006年12月： 1）熒光光譜技術研究抗癌藥物與生物分子（蛋白質(zhì)、DNA和生物小分子）之間的作用：利

14、用抗癌藥物或生物分子的熒光特性，研究其相互作用過程與性質(zhì)，測定有關參數(shù)，探討反應類型與機理。 2）電化學技術研究抗癌藥物與生物分子（蛋白質(zhì)、DNA和生物小分子）之間的作用：利用抗癌藥物或生物分子的電化學特性，研究其相互作用過程與性質(zhì)，測定有關參數(shù)，探討反應類型與機理。2007年1月2007年12月： 實時電化學-熒光光譜技術研究抗癌藥物與生物分子（蛋白質(zhì)、DNA和生物小分子）之間的作用：根據(jù)以上研究結(jié)果，用電化學技術模擬藥物在體內(nèi)氧化還原代謝，熒光光譜實時監(jiān)測抗癌藥物在代謝模型中的代謝過程，研究藥物與生物分子作用的動態(tài)過程以及生物小分子（維生素B1、B2、B6、C、葉酸和煙酸等）對代謝過程和產(chǎn)

15、物的影響。探討抗癌藥物對機體的作用機制和毒理作用。4、項目創(chuàng)新之處藥物分子與生物分子相互作用的研究是介于化學與生命科學之間的邊緣性課題。從化學生物學研究的角度來看，生物分子與藥物結(jié)合反應的研究主要包括結(jié)合位置、結(jié)合位點數(shù)與結(jié)合常數(shù)、作用力類型、共存物質(zhì)的影響以及藥物在血液中的分配等。如前（1、項目研究意義）所述，目前研究分子間作用的方法很多，但均有一定的局限性。用熒光光譜法研究藥物分子與生物分子的結(jié)合反應可以綜合利用生物分子和藥物的熒光猝滅、熒光敏化、能量轉(zhuǎn)移和實驗條件的影響等方面的信息。將兩種研究方法結(jié)合起來，采用實時電化學-熒光光譜法研究抗癌藥物與生物分子（蛋白質(zhì)、DNA和生物小分子）之間

16、的作用，具有一定互補性。用電化學技術模擬藥物在體內(nèi)氧化還原代謝，熒光光譜實時監(jiān)測抗癌藥物在代謝模型中的代謝過程，研究藥物與生物分子作用的動態(tài)過程。這方面的研究較少報道，具有一定的創(chuàng)新性。有助于進一步了解抗癌藥物對機體的作用機制和毒理作用。5、工作基礎與工作條件課題組一直從事化學分析、生物分析領域的研究，特別是在光譜分析、色譜分析、生物傳感器等領域具有扎實的研究基礎，有生物、化學、材料和電子等跨學科的研究背景。先后承擔省自然科學基金項目3項。課題組一直關注生命過程中生物大分子與化學小分子物質(zhì)之間的相互作用、反應及其對生命運動的影響。從分子的基礎去研究和了解生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸和糖類物質(zhì)等）與

17、小分子探針（試劑、染料和藥物等）的超分子作用及其在生物分析方面的應用研究，部分工作已經(jīng)取得了可喜的成果，所完成的研究論文在國內(nèi)外學術刊物如Trends in Biotechnology, Analytical Letters, Electroanalysis, Analytica Chimica Acta, Analyst, Electroanalysis, Biotechnology Advances, Biosensors & Bioelectronics，化學學報，分析化學等雜志發(fā)表。課題組己基本具備開展該項研究的技術基礎、基本理論和研究背景，并開展了有效的前期研究工作。課題組所

18、在實驗室擁有Autolab PGSTAT30、CHI660、CHI1030等電化學分析儀和恒電位儀及其配套設備， evolution 500紫外-可見分光光度計、LS-55熒光/磷光/發(fā)光分光光度計、IFS-30流動注射儀、RM-1000激光喇曼光譜儀、NEXUS 670傅立葉變換紅外光譜儀、Waters 600液相色譜儀、掃描電鏡（SEM）、透射電鏡（TEM）、原子力顯微鏡（AFM）和掃描隧道顯微鏡（STM）等可用于開展本項研究的儀器設備。能夠基本滿足開展本項目研究工作的需要。6、預期研究結(jié)果及其利用研究結(jié)果的計劃和今后發(fā)展的思路利用熒光光譜與電化學技術研究幾種新型抗癌藥物與生物分子（蛋白質(zhì)

19、和DNA）的作用機制；用電化學技術模擬藥物在體內(nèi)氧化還原代謝，熒光光譜實時監(jiān)測抗癌藥物在代謝模型中的代謝過程，研究藥物與生物分子作用的動態(tài)過程以及生物小分子對代謝過程和產(chǎn)物的影響，探討抗癌藥物對機體的作用機制和毒理作用。研究結(jié)果將在國內(nèi)外重要學術期刊上發(fā)表論文 35 篇。研究成果成為課題組長期目標的基礎，進一步探討新型抗癌藥物對生物分子的作用，以及毒副作用，建立藥物篩選模型，為開發(fā)低毒或無毒副作用的抗癌藥物奠定基礎。爭取國家基金項目資助，與本省制藥集團合作研發(fā)，使研究工作繼續(xù)發(fā)展。7、參考文獻1. Kovalska V. B. et al. Luminescence spectroscopic

20、 studies of trimethinecyanines substituted in polymethine chain with nucleic acids and proteins. Spectrochimica Acta A, 2004, 60, 1291362. Zimmermann B. et al. Applications of bimolecular interaction analysis in drug development. Targets, 2002, 1(2), 66733. 劉錚等. 光譜法在分子之間相互作用研究中的應用. 激光雜志, 2001, 22(6)

21、, 9144. Rauf S. et al. Electrochemical approach of anticancer drugsDNA interaction. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 37, 2052175. Ohyama T. Study on interaction of a cationic porphyrin with DNA. Nucleic Acids Res Suppl, 2003, 4, 1891906. 馮玉英等. 熒光光譜研究肌紅蛋白活性中心與銅離子的相互作用. 光譜學與光譜分

22、析, 2003, 23(3), 5325347. Cui F-L. et al. Interactions between 1-benzoyl-4-p-chlorophenyl thiosemicarbazide and serum albumin: investigation by fluorescence spectroscopy. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2004, 12, 1511578. Jiang C-Q. et al. Study of the interaction between terazosin and serum al

23、bumin Synchronous fluorescence determination of terazosin. Analytica Chimica Acta, 2002, 45(2), 185189 9. Maksimov G. V. The mechanisms of the porphyrin conformation of normal blood hemoglobin and in pathology. Nauchye Doki Vyss Shkoly Biol Nauki, 1992, 3, 222610. 俞英, 程曉偉. 牛血清白蛋白與酸性品紅的結(jié)合反應. 分析化學, 2000, 28(5), 58358611. Ghabi H., Dhahbi M. Caffeinewaterpolypeptide i