生物化學實驗總摘

1、生物化學實驗總摘實驗一 蛋白質(zhì)的沉淀反應2實驗二 考馬斯亮藍G-250比色法測蛋白質(zhì)含量4實驗三 3,5-二硝基水楊酸比色法測糖含量6實驗四 淀粉酶活力測定及專一性實驗8實驗五 RNA提取與顏色反應10實驗六 脂肪碘價的測定13實驗七 脂肪酸價的測定15實驗八 碘量法測維生素C含量16實驗九 醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)18實驗十 紙層析研究植物轉(zhuǎn)氨基作用221 / 26實驗一 蛋白質(zhì)的沉淀反應一、目的和要求通過實驗加深對蛋白質(zhì)溶液的溶膠特性及其穩(wěn)定因素的認識。了解各種沉淀試劑使蛋白質(zhì)沉淀的實質(zhì)和區(qū)分可逆的鹽析沉淀及不可逆的沉淀作用。二、原理在水溶液中，蛋白質(zhì)分子表面結合大量的水分子，形

2、成水化膜，同時蛋白質(zhì)分子本身帶有電荷，與溶液的反離子作用，形成雙電層，因而每個蛋白質(zhì)分子可形成一個穩(wěn)定的膠粒。整個蛋白質(zhì)溶液就形成穩(wěn)定的親水溶膠體系。與其它溶膠相同，這種穩(wěn)定性是有條件的，相對的。當某些物理化學因素導致蛋白質(zhì)分子失去水化膜或失去電荷，甚至變性時，它就喪失了穩(wěn)定因素，以固態(tài)形式從溶液中析出，這就是蛋白質(zhì)的沉淀作用。根據(jù)沉淀作用的結果，可將蛋白質(zhì)的沉淀作用分為兩類：1.可逆沉淀作用：在發(fā)生沉淀作用時，雖然蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀析出，然而其分子內(nèi)部結構并沒發(fā)生明顯的改變，仍保持原有的結構和性質(zhì)。如除去沉淀因素，蛋白質(zhì)可重新溶解在原來的溶劑中。因此，這種沉淀作用稱為可逆沉淀作用。屬于此類的有鹽

3、析作用，低溫下丙酮、乙醇使蛋白質(zhì)沉淀的作用，以及利用等電點的沉淀。（1）鹽析作用：用大量中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出的過程。在高濃度的中性鹽影響下，蛋白質(zhì)水分子的水化膜被剝奪。同時蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和，因而破壞了蛋白質(zhì)溶膠的穩(wěn)定因素，使蛋白質(zhì)沉淀析出，但中性鹽并不破壞蛋白質(zhì)的分子結構和性質(zhì)，因此，若除去中性鹽或減低鹽的濃度，蛋白質(zhì)就重新溶解。（2）有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)：在低溫下，在蛋白質(zhì)溶液中加入適量丙酮或乙醇，蛋白質(zhì)分子的水化膜被破壞而沉淀。若及時將蛋白質(zhì)沉淀與丙酮或乙醇分離，蛋白質(zhì)沉淀則可重新溶解于水中。2.不可逆沉淀作用：一些物理化學因素往往會導致蛋白質(zhì)分子結構，尤其是空間結構破壞，因

4、而失去其原來的性質(zhì)，這種蛋白質(zhì)沉淀不能再溶解于原來的溶劑中。重金屬鹽，生物堿試劑、過酸、過堿、震蕩、超聲波和有機溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀。重金屬鹽類Cu、Ag、Pb和Hg等均能與蛋白質(zhì)分子中的巰基等基團結合，生成不溶物而沉淀。生物堿試劑與蛋白質(zhì)結合形成不溶物，使蛋白質(zhì)沉淀。植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物稱為生物堿 (或植物堿)。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應的物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。生物堿試劑與蛋白質(zhì)的堿性基團反應。過酸、過堿、加熱、震蕩和超聲波等均能使蛋白質(zhì)的空間結構破壞，改變其原有性質(zhì)。從而形成沉淀。三、試劑和器材1.試劑（1）卵清蛋白液：將雞(鴨)

5、蛋清用蒸餾水稀釋2040倍、8層紗布過濾，冷藏備用。（2）飽和硫酸銨溶液（3）1%醋酸鉛溶液（4）硫酸銨粉末（5）1%硫酸銅溶液（6）10%三氯乙酸溶液（7）0.5%磺基水楊酸溶液（8）1%醋酸溶液（9）5%鞣酸溶液（10）飽和苦味酸溶液（11）晶體氯化鈉（12）95%乙醇2.器材（1）試管及試管架（2）量筒（3）牛角勺（4）刻度吸管（5）濾紙（6）漏斗四、操作步驟1.蛋白質(zhì)的鹽析作用（1）取蛋白質(zhì)溶液5mL，加入等量的飽和硫酸銨溶液，微微搖動試管，使溶液混合后靜置數(shù)分鐘，球蛋白即析出(如無沉淀可再加少許飽和硫酸銨)。（2）將上述混合液過濾(或離心)、取濾液(或離心上清液)加硫酸銨粉末，至不再

6、溶解，析出的即為清蛋白。再加水稀釋，觀察沉淀是否溶解。2.酒精沉淀蛋白質(zhì)取蛋白質(zhì)溶液1mL，加晶體NaCl少許(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL混勻。觀察有無沉淀析出。3.有機酸沉淀蛋白質(zhì)取2支試管，各加入蛋白質(zhì)溶液約0.5mL，然后分別滴加10%三氯乙酸和0.5%磺基水楊酸數(shù)滴，觀察蛋白質(zhì)沉淀。4.生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)取2支試管各加入2mL蛋白質(zhì)溶液及1%醋酸45滴。其中一管加5%鞣酸溶液數(shù)滴，另一管中加入飽和的苦味酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的形成。5.重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)取試管兩支各加蛋白質(zhì)溶液2mL，一管內(nèi)滴加1%醋酸鉛溶液，另一管內(nèi)滴加1%硫酸銅溶液，至有沉淀生成。五、思考

7、題1.為什么雞蛋清可用作鉛、汞中毒的解毒劑?2.蛋白質(zhì)分子中的哪些基團可以與（1）重金屬離子作用，而使蛋白質(zhì)沉淀?（2）有機酸、無機酸作用，而使蛋白質(zhì)沉淀?（3）生物堿試劑作用，而使蛋白質(zhì)沉淀?實驗二 考馬斯亮藍G-250比色法測蛋白質(zhì)含量一、目的學習和掌握考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。二、原理考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量屬于一種染料結合法?？捡R斯亮藍G-250是一種蛋白染料，其結構如下圖。它在游離狀態(tài)下最大吸收波長為464nm。由于它所含的疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)具有親和力，通過疏水作用與蛋白質(zhì)相結合。當它與蛋白質(zhì)結合后形成藍色的蛋白質(zhì)-染料復合物，其最大吸收波

8、長變?yōu)?95nm。這種結合在2分鐘左右達到平衡，生成的復合物在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復合物在595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，所以可用于蛋白質(zhì)含量的測定。該方法非常靈敏，蛋白質(zhì)最低檢測量為5mg，而且此法操作簡便、快速，干擾物質(zhì)少，是實驗室常用的蛋白質(zhì)定量方法。但染料易吸附在比色杯上而造成誤差，每次更換檢測樣液時，應及時用乙醇洗滌比色皿，再用蒸餾水沖洗殘留的乙醇。三、實驗材料及設備1.材料：包心菜2.儀器：分光光度計，離心機，電子天平3.器材：刻度試管：25mL9刻度試管：10mL1移液管：1mL3、20mL1燒杯：250mL2、50mL1離心管：10m

9、L1滴管：2洗耳球：2坐標紙、研缽、洗瓶、試管架、移液管架、玻棒：各1四、試劑的配制1.牛血清白蛋白(BSA)標準液（100mg/mL）精確稱取10mg牛血清白蛋白，用蒸餾水溶解后定容至100mL。2.考馬斯亮藍G-250染色液取0.10g考馬斯亮藍G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL 85%的正磷酸，再用蒸餾水定容到1000mL。過濾待用。該試劑于常溫下可保存1個月。五、操作步驟1.樣品液的制備（1）取材：稱包心菜葉片1.0g左右，準確記錄其質(zhì)量。（2）研磨：將樣品置于研缽中，研磨成勻漿后，準確加20mL蒸餾水。（3）提?。簩⑸鲜鰟驖{液在研缽內(nèi)浸提10分鐘，不斷攪拌，使蛋

10、白質(zhì)充分溶解在水中（注意，已定容，所以在沒攪勻之前不能損失樣液）。（4）離心：將部分浸提液轉(zhuǎn)移到10mL離心管里，以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。（5）分離：將上清液倒入至干凈的小試管里，備用。（對于含水量比較多的樣品，在計算定容體積時，還應考慮到樣品本身的水份。因此，另取1g左右的包心菜葉片，準確稱重，在微波爐里高溫失水，冷卻后準確稱重，計算包心菜葉片的含水量，然后再計算出所稱樣品中含有多少毫升水，加上20mL水的體積，就是本實驗樣品的準確定容體積。）2.標準曲線制作及樣品測定取9支試管，按下表所示順序操作。六、結果處理1.由05號管的數(shù)據(jù)，以蛋白質(zhì)含量(mg)為橫坐標，A595為縱坐標，

11、在坐標紙上繪制標準曲線；2.求樣品管A595的平均值A595；3.由平均值A595從標準曲線中求樣品管中蛋白質(zhì)的含量(mg)；4.計算你所取生物材料中蛋白質(zhì)的含量（單位用mg/g鮮重）。七、思考題1.用本實驗方法所得的測定值與樣品的實際值之間若有誤差，主要是由什么原因引起的？2.常見的測定蛋白質(zhì)的方法還有哪些？比較幾種測定蛋白質(zhì)常用方法的優(yōu)缺點？實驗三 3,5-二硝基水楊酸比色法測糖含量一、 目的了解3,5-二硝基水楊酸比色法測定糖的原理掌握總糖定量測定的操作方法二、原理還原糖是指含自由醛基或酮基的單糖（如葡萄糖）和某些具有還原性的雙糖（如麥芽糖）。它們在堿性條件下，可變成非?；顫姷南┒?。遇

12、氧化劑時，具有還原能力，烯二醇本身則被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。黃色的3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，反應液里棕紅色的深淺與還原糖的含量成正比，在波長為540nm處測定溶液的吸光度，查對標準曲線并計算，便可求得樣品中還原糖的含量。對于非還原性的雙糖（如蔗糖）以及還原性很小的多糖（如淀粉），應先用酸水解法將它們徹底水解成單糖。再借助于測定還原糖的方法，可推算出總糖的含量。由于多糖水解時，在每個單糖殘基上加了一分子水，因而在計算時，須扣除加入的水量，當樣品里多糖含量遠大于單糖含量時，則比色測定所得總糖含量應乘以折

13、算系數(shù)（1-18/180 =0.9），即得比較接近實際的樣品中總糖含量。三、實驗材料及設備1.材料：面粉2.儀器：分光光度計、電子天平、沸水浴3.器材：刻度試管：25mL8容量瓶：100mL2錐形瓶：100mL1移液管：1mL2、2mL2、10mL2燒杯：250mL1、50mL1滴管：2洗耳球：2濾紙：11cm坐標紙、漏斗、洗瓶、白瓷板、試管架、移液管架、試管夾、玻棒：各1四、試劑的配制1.葡萄糖標準液（1mg/mL）預先將分析純葡萄糖置80烘箱內(nèi)約12小時。準確稱取500mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4保存期約一星期）。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮

14、狀物現(xiàn)象，則應棄之，重新配制。2.3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）將5.0g3,5-二硝基水楊酸溶于200mL2NNaOH溶液中（不適宜用高溫促溶），接著加入500mL含130g酒石酸鉀鈉的溶液，混勻。再加入5g結晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解后，定容至1000mL。暗處保存?zhèn)溆谩?.碘液稱取5g碘和10g碘化鉀，溶于100mL水中。4.酚酞指示劑稱取0.1g酚酞，溶于250mL70%（V/V）的乙醇中。5.HCl溶液（6N）取500mL 12N HCl，用水稀釋至1000mL。6.NaOH溶液（6N）取240g NaOH，加水溶解，定容至1000mL。五、操作步驟1.樣品中總糖的提?。?

15、）取材：稱取0.7g面粉，準確記錄實際質(zhì)量（W），放入100mL錐形瓶中。（2）溶解：先用幾滴蒸餾水調(diào)成糊狀；加入15mL蒸餾水；再加入10mL6NHCl，攪勻。（3）水解：置于沸水浴中水解30分鐘。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，加1滴碘液，檢查淀粉水解程度。如顯藍色，表明未水解完全，應繼續(xù)水解。如已水解完全，則不顯藍色，可以取出沸水浴中的錐形瓶，冷卻。（4）中和：加1滴酚酞指示劑，加入10mL6NNaOH中和至微紅色。（5）定容：將溶液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶（B1）中，定容。（6）過濾：用濾紙過濾。（注意，濾紙不能用蒸餾水濕潤。）（7）稀釋：精確吸取濾液10mL，移入另一個100mL容量瓶

16、（B2）中，定容。（B2）液作為總糖待測液備用。2.標準曲線制作及樣品測定取8支25mL刻度試管，按下表所示順序操作。六、結果處理1.由05號管的數(shù)據(jù)，以葡萄糖含量(mg)為橫坐標，A540為縱坐標，在坐標紙上繪制標準曲線；2.求兩個樣品管A540的平均值540；3.由540從標準曲線中求樣品管中葡萄糖的含量(mg)；4.計算你所取的生物材料中總糖的百分含量。實驗四 淀粉酶活力測定及專一性實驗一、目的了解淀粉酶對不同底物的專一性掌握測定淀粉酶活力的原理和基本方法二、原理酶與一般催化劑最主要的區(qū)別之一是它具有高度的專一性。所謂專一性指的是一種酶只能對一種化合物或一類化合物（通常在這些化合物的結構

17、中具有相同的化學鍵）起一定的催化作用，而不能對別的物質(zhì)發(fā)生催化反應。例如，淀粉酶只作用于淀粉中的-1,4葡萄糖苷鍵，而不能作用于蔗糖分子中-D-吡喃葡萄糖的C1和-D -呋喃果糖的C2之間的糖苷鍵。蔗糖無還原性，淀粉的還原性也極小，它們對3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）呈陰性反應，而唾液淀粉酶（主要含a-淀粉酶）水解淀粉后的產(chǎn)物則為還原性糖，與DNS試劑共熱呈陽性反應，產(chǎn)生紅棕色。據(jù)此可以檢驗蔗糖和淀粉有無被唾液淀粉酶水解，從而了解酶作用的專一性。酶活力也稱酶活性，是以酶在最適溫度、最適pH等條件下，催化一定的化學反應的初速度來表示。本實驗是以一定量的唾液淀粉酶液，于37C、pH6.8的

18、條件下，在一定的初始作用時間里將淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖，然后通過與DNS試劑作用，比色測定，求得還原糖的生成量，從而計算出酶反應的初速度，即酶的活力。這里規(guī)定，一個淀粉酶活力單位定義為在37C、pH6.8的條件下，每分鐘水解淀粉生成1mg還原糖所需的酶量。三、實驗材料及設備1.材料：唾液2.儀器：分光光度計、恒溫水浴、沸水浴3.器材：刻度試管：25mL10容量瓶：100mL1移液管：1mL42mL2燒杯：250mL1滴管：2洗耳球：2洗瓶、試管架、移液管架、玻棒：各1四、試劑的配制1.淀粉溶液（0.5%）稱取5g可溶性淀粉，溶于1000mL熱水中。（臨用前配制）2.蔗糖溶液（1%）3.3,5-二硝基

19、水楊酸試劑（DNS試劑）將5.0g3,5-二硝基水楊酸溶于200mL2NNaOH溶液中（不適宜用高溫促溶），接著加入500mL含130g酒石酸鉀鈉的溶液，混勻。再加入5g結晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解后，定容至1000mL。暗處保存?zhèn)溆谩?.磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH6.8）5.NaOH溶液（6mol/L）6.NaCl溶液（0.3%）五、操作步驟1.唾液淀粉酶的制備（1）提?。簩嶒炚呦扔盟谇鍧嵖谇?，然后含一小口（約5mL）蒸餾水于口中輕嗽一、二分鐘。（2）過濾：將口腔中的酶提取液用一層脫脂棉過濾。（3）稀釋：取濾液1mL，用水定容至100mL。作為淀粉酶的樣品液。（由于不同人或同一

20、人不同時間收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀釋倍數(shù)可以是50300倍，甚至超過此范圍）2.唾液淀粉酶的專一性實驗取4支試管，按表一編號并操作，記錄所觀察到的顏色。3.唾液淀粉酶活力的測定取25mL刻度試管5支，按表二編號并操作，記錄實驗結果。表二六、結果處理1.解釋表一的實驗結果。2.根據(jù)表二的實驗結果，并利用實驗三“3,5-二硝基水楊酸比色法測定糖的含量”中制作的標準曲線，計算每毫升新鮮唾液含有淀粉酶的活力單位。實驗五 RNA提取與顏色反應一、目的學習用濃鹽法從酵母中提取RNA掌握用等電點法沉淀RNA觀察核酸的顏色反應，了解核酸定性與定量測定的原理熟練掌握普通離心機的使用方法二、原理酵母繁

21、殖快，生長周期短；其細胞質(zhì)中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液與菌體分離比較容易。因此，酵母是提取RNA的好材料。將RNA從細胞中釋放出來在工業(yè)上主要有三種方法稀堿法、濃鹽法和自溶法。本實驗采用濃鹽法，即利用高濃度的鹽（10%NaCl）在90100C條件下改變了細胞膜通透性，并將核蛋白體解離成RNA和蛋白質(zhì)而使RNA釋放到鹽溶液中。同時，90100C的高溫可破壞磷酸單酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。注意，在3070C時這兩種酯酶的作用活躍，提取時應避免在此溫度范圍內(nèi)停留時間過長。由于核膜內(nèi)的DNA分子量較大，穿越膜孔較困難，一般不易釋放到菌體外面，所以采用離心技術，可使

22、RNA溶液與菌體殘渣以及DNA分離。根據(jù)核酸在等電點溶解度最小的性質(zhì)，將溶液在低溫下調(diào)pH至2.02.5，RNA以白色絮狀沉淀形式從鹽溶液中析出。再次離心，固液分離，便可獲得RNA粗產(chǎn)品。最后用乙醇洗滌沉淀，溶解和去除脂溶性雜質(zhì)和色素以及鹽分雜質(zhì)。由于RNA不溶于乙醇，所以用乙醇洗滌還可以使RNA沉淀物脫水，變得疏松，便于干燥，提高了RNA產(chǎn)品的純度。DNA和RNA的鑒別，較常用的方法是利用兩類核酸中不同的戊糖各自具備的不同的顏色反應，而得以定性鑒別。其中鑒定DNA的方法稱為二苯胺法，鑒定RNA的方法稱為地衣酚（苔黑酚，3,5-二羥甲苯）法。具體反應式如下：三、實驗材料及設備1.材料：干酵母2

23、.儀器：離心機、電子天平、沸水浴、烘箱、抽濾裝置、冰浴3.器材：普通試管：20mL4（干燥）錐形瓶：100mL1量筒：50mL1移液管：1mL2燒杯：250mL1100mL150mL1離心管：100mL1溫度計：501表面皿：9cm滴管：2洗耳球：2加樣器pH試紙：pH0.55.0濾紙：7cm洗瓶、試管架、移液管架、試管夾、玻棒：各1四、試劑的配制1.NaCl溶液（C.P.）（10%）2.HCl溶液（6N）取500mL濃鹽酸，用水稀釋至1000mL。3.乙醇（C.P.）（95%）4.苔黑酚試劑（又稱地衣酚試劑）將200mg苔黑酚溶于100mL濃鹽酸中，再加入100mgFeCl36H2O。（低溫

24、貯藏一周）5.二苯胺試劑將1g二苯胺溶于98mL冰醋酸中，再加入2mL濃硫酸（比重1.84）。（臨用時配制，用前可加幾滴乙醛。）五、操作步驟1.取材在天平上準確稱取干酵母3.00g，轉(zhuǎn)移至100mL錐形瓶中。2.濃鹽浸提取27mL10%NaCl溶液，加入到含干酵母的錐形瓶中，攪拌均勻；置于90100C水浴中，浸提3060分鐘；冷卻。3.離心將錐形瓶中提取液和沉淀全部轉(zhuǎn)移至100mL離心管中，取10mLH2O洗滌錐形瓶，并入離心管中；平衡后以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘；將上清液（即RNA提取液）傾入50mL燒杯中，棄去沉淀（菌體殘渣）。4.沉淀RNA（1）冷卻：將50mL燒杯置于放有冰塊的25

25、0mL燒杯中冷卻；將溫度計插入50mL燒杯中，待溶液冷至10C以下時，取出溫度計。（2）調(diào)pI：緩慢滴加6N HCl于50mL燒杯中，用玻棒一邊輕輕攪拌溶液，一邊測量pH值，調(diào)節(jié)溶液pH至2.02.5范圍，溶液中白色沉淀逐漸增多，到等電點時沉淀量最多；繼續(xù)在冰浴中靜止15分鐘，使沉淀充分。（注意：嚴格控制pH；若攪拌過快核酸難以凝聚沉淀。）5.離心將小燒杯中溶液和沉淀移至離心管中，再次平衡、離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘）；棄去上清液，保留RNA沉淀。6.洗滌與抽濾（1）洗滌：取10mL95%乙醇加到含RNA沉淀的離心管中，懸浮沉淀，浸泡5分鐘。（2）抽濾：取大小合適的濾紙，先在數(shù)字顯示天平

26、上稱重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇濕潤濾紙，開啟真空泵，使濾紙貼緊漏斗，將沉淀及溶液全部轉(zhuǎn)移至布氏漏斗內(nèi)；再用15mL95%的乙醇洗滌離心管，淋洗濾渣。7.干燥用小鑷子取出布氏漏斗中的沉淀物和濾紙，轉(zhuǎn)移至表面皿上，置于80C烘箱內(nèi)干燥。8.稱重取出樣品，在室溫下冷卻數(shù)分鐘后，將沉淀物及濾紙置于數(shù)字顯示天平上稱重。9.顏色反應（1）溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同時加2滴NaOH助溶。（2）顏色反應：取4支潔凈、干燥的試管，按下表所示順序操作六. 結果處理1. 寫出核酸產(chǎn)品的顏色和外形。2. 計算RNA的粗產(chǎn)品的得率。3. 由顏色反應的結果，說明產(chǎn)品中含有核酸的情況。實驗六 脂肪碘價的測

27、定一、目的掌握碘價的測定原理和方法。二、原理在適當條件下，不飽和脂肪酸的不飽和鍵能與碘、溴或氯仿起加成反應。脂肪分子如含有不飽和脂?；?，即能吸收碘。100g脂肪所能吸收碘的克數(shù)稱為碘價。碘價的高低表示脂肪不飽和度的大小。由于碘與脂肪的加成作用很漫，故于Hanus試劑中加入適量溴，使產(chǎn)生溴化碘，再與脂肪作用。將一定量的溴化鉀與脂肪作用后，測定溴化鉀剩余量，即可求得脂肪之碘價，本法的反應如下：三、實驗儀器及試劑1.實驗器材：蓖麻油或其它油、碘瓶、量筒、稱量瓶、錐形瓶、吸管、滴定管、鐵支架、電子分析天平2.實驗試劑：Hanus試劑、15%碘化鉀溶液、標準硫代硫酸鈉溶液、1%淀粉液。四、實驗內(nèi)容及步驟

28、1.準確稱取一定量的脂肪，置于碘瓶中，加10ml氯仿作溶劑，待脂肪溶解后，加入Hanus試劑20ml，塞好碘瓶，輕輕搖動，搖動時應避免溶液濺至瓶頸部及塞上，置暗處30min，于另一碘量瓶中置同量試劑，但不加脂肪，做空白試驗。2. 30min后，先注少量15%碘化鉀于碘碘瓶口邊上，將玻塞稍稍打開，使碘化鉀溶液流入瓶內(nèi)，并繼續(xù)由瓶口邊緣加入碘化鉀溶液，共加20ml，再加水100ml，混勻，隨即用標準硫代硫酸鈉溶液進行滴定。開始加硫代硫酸鈉溶液時可較快。等瓶內(nèi)液體呈淡黃色時，加1%淀粉液數(shù)滴，繼續(xù)滴定，滴定將近終點時，可加塞振蕩，使于溶于氯仿中之碘完全作用，繼續(xù)滴定至藍色恰恰消失為止，記錄所用硫代硫

29、酸鈉溶液的量，用同法測定空白管。按下式計算碘價：碘價=c（B-S）126.9/（m1000）100式中 B：滴定空白樣時所消耗硫代硫酸鈉溶液的體積（ml）；S：滴定樣品所消耗硫代硫酸鈉溶液的體積（ml）；126.9：碘的相對原子質(zhì)量（g）；1000：毫克數(shù)轉(zhuǎn)化為克數(shù)；100：碘價是100克脂肪所吸收的碘的克數(shù)；m；脂肪質(zhì)量（g） ；c：硫代硫酸鈉溶液物質(zhì)的量濃度（mol/l）。 五、數(shù)據(jù)記錄和處理平行測定三次，取其算術平均值。序號B（ml）S（ml）碘價123平均值六、實驗注意事項1.應使滴定所用的體積數(shù)在10ml以上，從而減小讀數(shù)誤差。2.滴定時，一邊滴要一邊不停的搖動三角燒瓶。實驗七 脂肪

30、酸價的測定一、目的掌握酸價的測定原理和方法。二、原理天然油脂長期暴露在空氣中會產(chǎn)生臭味，這中現(xiàn)象稱為酸敗。酸敗是由于油脂水解釋放出游離的脂肪酸，在空氣中被氧化成醛或酮，從而有一定的臭味。酸敗的程度用酸價來表示。酸價是中和1g油脂的游離脂肪酸所需的KOH的毫克數(shù)。油脂中的游離脂肪酸與KOH發(fā)生中和反應，從KOH標準容易外消耗量可計算出游離脂肪酸的量。反應式如下：RCOOH+KOH RCOOK+H2O三、實驗儀器及試劑1.實驗器材：油脂、電子分析天平、堿式滴定管、三角燒評瓶、量筒、水浴鍋。2.實驗試劑：0.100mol/L KOH標準溶液，1%酚酞指示劑、中性醇醚混合液。四、實驗內(nèi)容及步驟1.稱取

31、油脂12.00g于100mL三角燒瓶中，加入醇醚混合液50mL，振搖溶解或水浴中熔化至透明，溶液由紅色變?yōu)闊o色，繼續(xù)用0.100mol/L KOH溶液滴定至淡紅色，1min不褪色為終點，記錄KOH的用量V（mL）。2.計算脂肪的酸價=cV56.1/m式中 c：標準KOH物質(zhì)的量濃度（mol/L）；V：樣品消耗KOH的體積（mL）；56.1：每摩爾KOH的質(zhì)量（g/mol）；m：樣品質(zhì)量（g）。五、數(shù)據(jù)記錄和處理平行測定三次，取其算術平均值。序號V（ml）m（ml）酸價123平均值實驗八 碘量法測維生素C含量一、目的掌握直接碘量法測定維生素C的原理和方法。了解間接碘量法的原理。二、原理維生素C又

32、稱抗壞血酸Vc，分子式C6H8O6。Vc具有還原性，可被I2定量氧化，因而可用I2標準溶液直接測定。其滴定反應式：C6H8O6I2= C6H6O62HI用直接碘量法可測定藥片，注射液，飲料，蔬菜，水果等的Vc含量。I2微溶于水而易溶于KI溶液，但在稀的KI溶液中溶解得很慢，所以配制I2溶液時不能過早加水稀釋，應先將I2和KI混合，用少量水充分研磨，溶解完全后再加水稀釋。I與KI間存在如下平衡：I2I =I3游離的I2容易揮發(fā)損失，這是影響碘溶液穩(wěn)定性的原因之一。因此溶液中應維持適當過量的I離子，以減少I2的揮發(fā)?？諝饽苎趸疘離子，引起I2濃度增加：4IO24H =2I22H2O此氧化作用緩慢，

33、但能為光、熱及酸的作用而加速，因此I2溶液應處于棕色瓶中置冷暗處保存。I2能緩慢腐蝕橡膠和其他有機物，所以I應避免與這類物質(zhì)接觸。I2溶液的標定用Na2S2O3標定。而Na2S2O3一般含有少量雜質(zhì)，在pH在910間穩(wěn)定，所以在Na2S2O3溶液中加入少量的Na2S2O3，Na2S2O3見光易分解可用棕色瓶儲于暗處，經(jīng)814天，用K2C2O7做基準物間接碘量法標定Na2S2O3溶液的濃度。其過程為：K2C2O7與KI先反應析出I2：析出的I2再用標準的Na2S2O3溶液滴定：從而求得Na2S2O3的濃度。這個標定Na2S2O3的方法為間接碘量法。碘量法的基本反應式：2S2O32I2=S4O62

34、2I標定Na2S2O3溶液時有：6ICr2O7214H=2Cr33I27H2O2S2O32I2=S4O622INa2S2O3標定時有:n(K2C2O7): 6n(Na2S2O3)=1:6由于Vc的還原性很強，較容易被溶液和空氣中的氧氧化，在堿性介質(zhì)中這種氧化作用更強，因此滴定宜在酸性介質(zhì)中進行，以減少副反應的發(fā)生。考慮到I2在強酸性中也易被氧化，故一般選在pH為34的弱酸性溶液中進行滴定。三、試劑1. I2溶液（0.05mol/L）：3.3g I2和5g KI，置于研缽中加少量水，在通風櫥中研磨。待I2全部溶解后，將溶液轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶，加水稀釋至250mL，搖勻，放置暗處保存。2. Na2S2

35、O3標準溶液(0.01mol/L)3.淀粉溶液（5%）4. HAc(1+1)5.固體Vc樣品（維生素片劑）6.重鉻酸鉀(A.R)四、步驟1. I2的標定：用移液管移取25.00 ml Na2S2O3標準溶液于250ml錐形瓶中，加50ml蒸餾水，5ml 0.5%淀粉溶液，然后用I2溶液滴定至溶液呈淺藍色，30s內(nèi)不褪色即為終點。平行三次，計算I2溶液的濃度。2.維生素C的測定：準確稱取約0.2g研成粉末的維生素C藥片，置于250ml錐形瓶中，加入100ml新煮沸過并冷卻的蒸餾水，立即用I2標準溶液滴定至出現(xiàn)穩(wěn)定的淺藍色，30s 內(nèi)不褪色即為終點，記下I2溶液體積。平行三次，計算式樣中維生素C的

36、百分量。五、思考題1.溶樣時為什么要用新煮沸并冷卻的蒸餾水？2.加醋酸的目的是什么？實驗九 醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)一、目的學習醋酸纖維薄膜電泳的操作了解電泳技術的一般原理。二、原理醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法。帶電顆粒在電場力作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。由于各種蛋白質(zhì)都有特定的等電點，如將蛋白質(zhì)置于pH值低于其等電點的溶液中，則蛋白質(zhì)將帶正電荷而向負極移動。反之，則向正極移動。因為蛋白質(zhì)分子在電場中移動的速度與其帶電量、分子的形狀及大小有關，所以，可用電泳法將不同的蛋白質(zhì)分離開來。血清中含有多種蛋白質(zhì)，它們的等電點都在pH7.5以下。

37、將血清放于pH8.6的緩沖液電泳時，所有的血清蛋白都帶有負電荷，在電場中將向正極移動。由于各種血清蛋白在相同pH時所帶電荷數(shù)量不等，分子顆粒大小不一，因而泳動速度不同，經(jīng)電泳被分離開來。血清蛋白質(zhì)的等電點和分子量見下表。本實驗以醋酸纖維素薄膜（簡稱CAM）為支持物分離血清中的不同蛋白質(zhì)。它是一種良好的呈均一泡沫狀疏松薄膜，厚約120m具有一定的吸水性。三、實驗材料、儀器及試劑1.材料：健康人血清或雞血清2.儀器：電泳儀電泳槽3.試劑：（1）醋酸纖維素薄膜；（2）pH8.6巴比妥緩沖液（離子強度0.060.07）：取巴比妥0.83克，巴比妥鈉6.38克，加蒸餾水加熱溶解后，定容至500ml。（3

38、）染色液：取氨基黑10B0.5克，溶于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml，蒸餾水40ml混勻。（4）漂洗液：95%乙醇4.5ml，冰醋酸5ml，蒸餾水50ml混合。（5）透明液：95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合。四、實驗方法1.電泳槽與薄膜的制備（1）醋酸纖維素薄膜的濕潤與選擇用鈍頭鑷子取一片薄膜，在薄膜無光澤面上，距邊2cm處用鉛筆各劃一條直線此線為點樣標志區(qū)。小心地平放在盛有緩沖液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15s30s內(nèi)迅速濕潤，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳；若薄膜濕潤緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點，則表示薄膜厚薄不均勻應舍去，以免影響電泳結果，將選好的薄膜用竹夾

39、子輕壓，使其完全浸泡于緩沖液中約30min后方可用于電泳。（2）電泳槽的準備根據(jù)電泳槽的寬度，剪裁尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內(nèi)。當濾紙條全部浸潤后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯(lián)系醋酸纖維素膜的橋梁，因而稱為濾紙橋。2.點樣仔細辯認薄膜的粗糙面與光滑面，在粗糙面距離薄膜一端1.5cm處，用鉛筆輕輕劃一條直線。用玻棒蘸上血清樣品，涂于蓋玻片邊緣處（邊緣長度應比膜條寬度窄），將此邊緣按壓在直線上。注意：樣品應點在薄膜

40、的粗糙面一側。待血清完全滲入薄膜后，將膜面翻轉(zhuǎn)，點樣面（粗糙面）朝下，置電泳槽中，薄膜點樣端放于負極一側。3.電泳用鈍頭鑷子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。如下圖所示，要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂，如一電泳槽同時安放幾張薄膜，則薄膜之間應隔幾毫米，蓋上電泳槽蓋使薄膜平衡10min。用導線將電泳槽的正、負極與電泳儀的正、負極分別連接，注意不要接錯。在室溫下電泳，打開電源開關，調(diào)旋鈕調(diào)到每厘米電流強度為0.3mA（8塊薄膜則為4.8mA）。通電10min15min后，將電流調(diào)節(jié)到每厘米膜寬電流強度為0.5mA（8片共8mA），電泳時間

41、約50min60min。電泳后調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，關閉電泳儀切斷電源或自然風干。4.染色與漂洗用鈍頭鑷子取出電泳后的薄膜，無光澤面向上，放在含有0.5氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中，浸染5min。取出后用自來水沖去多余染料，然后放到盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，每隔10min換漂洗液一次，連續(xù)數(shù)次，直至背景藍色脫盡。取出后放在濾紙上，用電吹風的冷風將薄膜吹干。5.透明將脫色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即緊貼于干凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡。約23min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次垂直放置待其自然干燥，或用吹風機冷風吹干且

42、無酸味。再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗，當薄膜完全潤濕后用單面刀片撬開薄膜的一角，用手輕輕將透明的薄膜取下，用濾紙吸干所有的水分，最后將薄膜置液體石蠟中浸泡3min，再用濾紙吸干液體石蠟，壓平。此薄膜透明，區(qū)帶著色清晰，可用于光吸收計掃描。長期保存不褪色。6.定量（1）浸泡：將膜片上的各蛋白質(zhì)分離區(qū)帶分段剪下，分別置于相應的標有編號的試管內(nèi)，然后各加入0.4mol/L的氫氧化鈉溶液進行浸泡。浸泡淡色帶所加入的0.4mol/L氫氧化鈉溶液的量為4ml，深色帶為8ml（此時的稀釋倍數(shù)是淡色帶的2倍）。室溫下的浸泡時間為30min60min。若在37水浴中浸泡，則為10min15min。浸泡期間振

43、蕩數(shù)次，使蛋白質(zhì)區(qū)帶浸出。另外再剪取與色帶膜條大小相同的無色帶膜條作為空白，以相同的方式浸泡在0.4mol/L氫氧化鈉溶液中。（2）比色：浸泡完畢，將浸出的有色溶液在分光光度計上進行比色測定。測定波長為620nm，光徑為1cm。若浸出液有混濁或沉淀，則以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心1020min除去，然后再取上清液進行比色測定。（3）計算：比色測定結束后，各組分的含量按下式計算：某蛋白質(zhì)組分百分含量某蛋白質(zhì)組分的光吸收值/樣品中各蛋白質(zhì)組分的光吸收值總和100上式中深色帶蛋白質(zhì)組分的光吸收值應乘以稀釋倍數(shù)2，例如血清白蛋白組分的分離區(qū)帶為深色帶，浸泡時所加入的0.4mol/L氫氧化鈉的量是其它

44、淡色帶的2倍，所以應乘以2。五、注意事項1.醋酸纖維素薄膜的預處理市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的重要關鍵之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，其目的是選擇膜片厚薄及均勻度，如漂浮15s30s時，膜片吸水不均勻，則有白斑點或條紋，這提示膜片厚薄不勻，應舍去不用，以免造成電泳后區(qū)帶扭曲，界線不清，背景脫色困難，結果難以重復。由于醋酸纖維薄膜親水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩沖液，并使其恢復到原來多孔的網(wǎng)狀結構。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕著走。點樣時，應將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引

45、起樣品擴散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi)，而造成電泳起始點參差不齊，影響分離效果。吸水量以不干不濕為宜。為防止指紋感染，取膜時，應戴指套或用鑷子。2.緩沖液的選擇醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥溶液，其濃度為0.05mol/L0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的薄厚有關。選擇時，先初步定下某一濃度，如電泳槽兩極之間的膜長度為8cm10cm，則需電壓25V/cm膜長，電流強度為0.4mA/cm0.5mA/cm膜寬。當電泳達不到或超過這個值時，則應增加緩沖液濃度或進行稀釋。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快，并由于擴散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶

46、分布過于集中不易分辨。3.加樣量加樣品的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關。作為一般原則，檢測方法越靈敏，加樣量則越少，對分離更有利。如加樣量過大，則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至互相干擾，染色也較費時。如電泳后用洗脫法定量時，每厘米加樣線上需加樣品0.1l0.5l約相當于5g1000g蛋白。血清蛋白常規(guī)電泳分離時，每厘米加樣線加樣量不超過1l，相當于60g80g的蛋白質(zhì)。但糖蛋白和脂蛋白電泳時，加樣量則應多些。對每種樣品加樣量均應先作預實驗加以選擇。點樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時，動作應輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄壞或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。4.電量的選擇電泳過程應選擇合適的電流強度，一般電流強度為0.4mA/cm0.5mA/cm寬膜為宜。電流強度高，尤其在溫度較高的環(huán)境中，可引起蛋白質(zhì)變性或由于熱效應引起緩沖液中水分蒸發(fā)，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸。電流過低，則樣品泳動速度慢且易擴散。5.染色液的選擇對醋酸纖維素薄膜電泳后染色應根據(jù)樣品的特點加以選擇。其原則是染料對被分離樣品有較強的著色力，背景易脫色；應盡量采用水溶性染料，不宜