生物強(qiáng)化技術(shù)及其在廢水生物處理中的應(yīng)用

1、第1卷第9期王建芳趙慶良113林佶侃金文標(biāo)23(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院,哈爾濱150090;2.金迪生物科技集團(tuán),東莞523581;3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院,深圳518055)摘要生物強(qiáng)化技術(shù)廣泛應(yīng)用于廢水生物處理中,而競爭力和適應(yīng)性強(qiáng)的高效菌株篩選是生物強(qiáng)化技術(shù)的決定性因素。論述了利用具有代謝性能的可移動基因片段強(qiáng)化、基因工程菌強(qiáng)化和常規(guī)微生物學(xué)手段分離菌株的生物強(qiáng)化技術(shù),并闡述了生物強(qiáng)化技術(shù)在廢水生物處理過程中去除難降解有機(jī)物,去除過量的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì),維持生物系統(tǒng)穩(wěn)定性中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞高效菌篩選基因工程可移動基因組分廢水生物處理中圖分類號X703.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編

2、號16732()092BioaugmentationbiiltingliangLinJikanJinWenbiao2.GoldenBio2TreatTechnologyLimited,Dongguan523581;3.HarbinInstituteofTechnologyCampusofShenzhenUniversityTown,Shenzhen518055)123(palandEnvironmentalEngineering,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090;Keywordsscreenofeffectiveandefficientbacte

3、ria;geneengineering;mobilegeneticelements;biologi2calwastewatertreatment自然環(huán)境或生物處理體系中,微生物通過自身物強(qiáng)化技術(shù)融入到傳統(tǒng)的生物修復(fù),并結(jié)合現(xiàn)代分手段進(jìn)行的生命活動降解污染物、將有害物質(zhì)分解為穩(wěn)定無子生物學(xué)技術(shù)和分析化學(xué)提供的新方法、評價,已成為土壤、地下水等生物修復(fù)發(fā)展的害的小分子物質(zhì),如CO2和H2O。隨著工業(yè)的發(fā)監(jiān)測、展,一些有毒有害物質(zhì)的排放會對環(huán)境微生物產(chǎn)生一種趨勢。在廢水生物處理技術(shù)中,由于某些污難降解性及對微生物體系的抑制性,一定的毒害作用,使得生物降解體系中缺乏足夠的染物的復(fù)雜性、微生物降解相應(yīng)的

4、污染物,或抑制具有降解復(fù)雜污用常規(guī)的處理方法很難有效去除。向生物反應(yīng)器中染物性能的微生物生長,需要很長一段時間才能通投加特種微生物的生物強(qiáng)化技術(shù)成為有效的輔助過酶的誘導(dǎo)、遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移等方式使微生物逐漸適手段。應(yīng)。有效微生物的數(shù)量和濃度是生物處理的決定性影響因素。因此,生物強(qiáng)化技術(shù)受到人們的青睞。生物強(qiáng)化技術(shù)是向傳統(tǒng)的生物處理系統(tǒng)中引入具有特定功能的微生物,提高有效微生物的濃度,增強(qiáng)對難降解污染物的降解能力,提高其降解速率,并改善第9期王建芳等:生物強(qiáng)化技術(shù)及其在廢水生物處理中的應(yīng)用41停留在實驗室階段。1環(huán)境微生物學(xué)中的生物強(qiáng)化技術(shù)1.2利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效微生物的生物以生物強(qiáng)化為基礎(chǔ)的生

5、物修復(fù)理念非常簡單,強(qiáng)化通過具有降解功能的微生物強(qiáng)化受污染體系,能加運用微生物遺傳學(xué)的手段去改造生物反應(yīng)器中速生物修復(fù),核心是投加高效降解微生物。其效果的微生物特性,使之獲得高耐毒性、高降解活性以及由微生物本身的降解性能和各種生態(tài)因素綜合作用決定。高競爭力和適應(yīng)性強(qiáng)的高效菌株篩選是生物強(qiáng)化技術(shù)成敗的關(guān)鍵。根據(jù)用于生物強(qiáng)化的菌株篩選或構(gòu)建途徑不同,生物強(qiáng)化技術(shù)主要可分為以下3種:(1)含有代謝功能的可移動基因組分的菌株強(qiáng)化;(2)通過基因工程手段改造得到具有特定功能的微生物強(qiáng)化;(3)利用常規(guī)的微生物學(xué)手段,通過特異或廣譜降解污染物等優(yōu)良遺傳性狀,從而創(chuàng)造7出新的高效生物處理工藝。Dai等通過三

6、輪基因重組將Sphingobilumchlorophenolicum對劇毒殺蟲劑五氯酚的耐受濃度提高了10倍以上,并可將培養(yǎng)基中所含的3mmol/L五氯酚完全降解。通過基因重組將多種有益的突變組合在一起,其中包括提高菌體生長速率長期馴化得到具有一定降解能力的微生物菌群或從8特定環(huán)境中分離純化得到某些具有特定降解性能的等微生物強(qiáng)化。testosteroniR5中選擇數(shù)量上1.1t的編碼酚羥化酶基因phc,整合到Co2mobilegeneticmamonassp.rN7,得到轉(zhuǎn)化菌株rN7,其中特定酚氧代謝基因,能加速自然基因的交換和代謝途徑的構(gòu)建,可作為受污染土壤和水體生物強(qiáng)化的有效手2段。接種

7、含有可移動基因組分可為微生物引入特定特征的代謝基因。這些具有代謝功能的可移動組分包括質(zhì)粒、可交換組分和可利用類抗菌素整合3,4酶的組分等,大部分都存在于經(jīng)選擇性分離的異型生物降解菌株。一旦代謝活性的基因組分在土著微生物中轉(zhuǎn)移、表達(dá),就不再需要供體。Springael等向活性污泥和活性污泥2膜生物反應(yīng)器中引入P.putidaBN210菌株,這種微生物攜帶能降解32氯苯甲酸(3CBA)的clc基因。利用PCR2DGGE分析表明,盡管2個反應(yīng)器中BN210菌株消失,反應(yīng)器仍具有降解3CBA性能,活性污泥2膜生物反應(yīng)器的5化活性比原菌株R5活性高出3倍多。35d后,定量PCR結(jié)果表明,phc基因仍留在

8、轉(zhuǎn)化株中,每毫升8液體中含有10個拷貝,而沒有監(jiān)測到phc基因供體R5。而且,接種含有轉(zhuǎn)化株的活性污泥,提高了酚氧化活性和抗酚沖擊負(fù)荷能力。顯而易見,酚處理能力的提高是由已適應(yīng)自然生態(tài)系統(tǒng)的外源代謝基因引起的。利用這種含有外源代謝基因的土著微生物強(qiáng)化,可避免與土著微生物競爭資源和空間、面對原生、后生動物的捕食和不利的生長條件。就廢水生物處理而言,通過遺傳學(xué)手段創(chuàng)造的基因工程菌在處理有毒、生物難降解廢水中,已顯示出誘人的應(yīng)用前景。目前基因工程菌生物強(qiáng)化,實驗室研究偏多,實際應(yīng)用較少。造成這種情況的原因主要有:(1)進(jìn)行系統(tǒng)的遺傳工程育種尚缺乏一降解速率是活性污泥系統(tǒng)的3倍多,表明clc基因個生物

9、有效降解菌種資源庫;(2)對于污染物降解組分已轉(zhuǎn)移到土著微生物中。基因在各種有效降解菌體內(nèi)的定位尚需做大量的研生物處理系統(tǒng)中通過基因組分轉(zhuǎn)移進(jìn)行生物強(qiáng)究工作;(3)由于人們對基因工程菌釋放到環(huán)境后化的主要條件是細(xì)胞密度,因為供體和感受態(tài)菌株的生態(tài)影響尚缺乏充分的認(rèn)識,目前除細(xì)胞融合技6由于很難尋找含有難降解污染物降解基因的供在長期馴化或受污染環(huán)境中,通過選擇性培養(yǎng)體,分離純化相關(guān)的降解基因,并快速靈敏探測基因基分離具有特定降解性能的微生物,再通過富集培轉(zhuǎn)移,以質(zhì)粒為中介的生物強(qiáng)化技術(shù)大部分研究都養(yǎng)、多次分離純化得到高效微生物用于生物強(qiáng)化,具42環(huán)境工程學(xué)報第1卷?；钚砸约氨贿x菌株相適宜的環(huán)境參

10、數(shù)。在排除致病菌的基礎(chǔ)上,按照降解效能與維持微生物持久性和活性相結(jié)合的原則篩選高效微生物。首先,了解微生物在原菌群生態(tài)系統(tǒng)中的特征,以微生物獨特性、種群動力學(xué)、時空分布為基礎(chǔ),確定優(yōu)勢的微生物種群;在確定優(yōu)勢微生物種群的基礎(chǔ)上,鑒別能夠降解目標(biāo)污染物的菌株。vander1214Gast等利用三重標(biāo)準(zhǔn)選擇處理金屬車間廢液的高效菌株:;()的。用這種方法篩,在處理金屬車間廢,處理效率要比接種從污水中分離到的不明確圖1Fig.1flowchartofscreenofeffectivemicroorganisms菌團(tuán)高出85%?；瘜W(xué)分析方法和特定的探針分析,陌生的生態(tài)環(huán)境也是生物強(qiáng)化技術(shù)成功的一個主要

11、障礙。有時生物強(qiáng)化技術(shù)的失敗并不是由于缺乏相關(guān)的、具有代謝功能的微生物,而是由于缺乏維持微生物正常代謝功能和活性的環(huán)境條件。15Bouchez等在具有硝化功能的SBR反應(yīng)器運行中,多次大量使用好氧反硝化菌進(jìn)行生物強(qiáng)化。結(jié)到目前為止,菌株的篩選一般都以降解能力作為惟一標(biāo)準(zhǔn)。但這種標(biāo)準(zhǔn)篩選得到的菌株應(yīng)用于生物強(qiáng)化可能存在2個方面的問題:缺乏對微生物的原位擴(kuò)增潛力和活性的了解;有可能所得到的高效菌是致病菌,會對社會造成不利影響。在特定的條件下,通過選擇性富集,得到具有相對高效降解能力的菌株,在目標(biāo)污染源土著微生物果不僅硝化能力沒有提高,而且外源微生物快速消失,這主要是由于在生態(tài)系統(tǒng)中,原生、后生動物

12、占中不一定具有典型性或代表性,或者有可能只是一優(yōu)勢,細(xì)菌被廣泛捕食所致。盡管各種單一的或混些暫時存在的微生物。而且富集過程不可能提高菌合菌株加入生態(tài)系統(tǒng)中能夠提高該生態(tài)系統(tǒng)中生物后生動物的株在實際環(huán)境中與土著微生物的競爭力。因此由于降解潛能,但效果經(jīng)常是短暫的。原生、電子受體,濕度、缺乏對原微生物菌群及在目標(biāo)污染地微生物種群構(gòu)捕食,與土著微生物競爭營養(yǎng)物質(zhì)、pH、DO、污染物濃度、毒性和微量元素等多種成及動力學(xué)變化的了解,容易使優(yōu)勢菌株選擇失敗。溫度、9Simon等將2種商業(yè)生物強(qiáng)化菌劑用于提高濕地因素共同影響生物強(qiáng)化的效果。因此,為了給外源石油污染生物修復(fù),結(jié)果表明,這2種菌劑在濕地生微生物

13、創(chuàng)造良好的生態(tài)環(huán)境,一方面,可通過生物刺10物修復(fù)中沒有明顯作用。Oerther等在SBR系統(tǒng)激與生物強(qiáng)化相結(jié)合,提高外源微生物的競爭力,如微量元素等,另一方面,通過各種中加入純培養(yǎng)Acinetobactersp.菌株,對系統(tǒng)的啟動提供充足的營養(yǎng)、固定化手段防止接種微生物流失,減少直接捕食并沒有重要影響。16,17。此外,以降解能力作為惟一標(biāo)準(zhǔn)篩選得到的一等些菌株,有可能是致病菌,應(yīng)用于環(huán)境工程會造成負(fù)2生物強(qiáng)化在廢水生物處理中的應(yīng)用面社會影響。例如,假單胞P.aeruginosa菌株是多去除難降解有機(jī)物功能革蘭氏陰性細(xì)菌,但可能會引起肺炎和嚴(yán)重的2.111研究者們利用各種手段分離到具有特定降

14、解性呼吸道疾病,不宜用于工程實踐。第9期王建芳等:生物強(qiáng)化技術(shù)及其在廢水生物處理中的應(yīng)用43能的微生物,通過生物強(qiáng)化手段,提高有效微生物的主導(dǎo)地位,成為強(qiáng)化生物除磷工藝(EBPR)。實驗濃度,改善生物系統(tǒng)的處理效果。證實,生物強(qiáng)化14d后能夠?qū)鹘y(tǒng)污水處理廠的活18Wang等以喹啉作為目標(biāo)污染物,在厭氧2缺性污泥轉(zhuǎn)化成為EBPR污泥,能適應(yīng)磷負(fù)荷沖擊。氧2好氧(A/A/O)系統(tǒng)以喹啉降解菌Burkholderia2.3維持生物系統(tǒng)的穩(wěn)定性pickettii強(qiáng)化處理焦化廢水。結(jié)果表明,厭氧、缺氧污染物的化學(xué)性質(zhì)、濃度、環(huán)境的理化特征和好氧反應(yīng)器中COD的去除率分別為25%、16%(pH、氧化還原

15、電位和溫度等)、微生物對污染物的和59%。Shi等在活性污泥反應(yīng)器后設(shè)置以2,42DCP降解菌為生物強(qiáng)化菌劑處理生活污水和多氯酚的混和液的反應(yīng)器,結(jié)果表明,2,42DCP降解菌不僅提高了2,42DCP的處理效率,同時提高其他多氯酚如42氯酚、2,4,52三氯酚的去除率,并改善了系統(tǒng)抗毒性物質(zhì)沖擊負(fù)荷能力。20,21在含有難降解化合物的造紙廢水、制藥廢221723水、染料廢水和農(nóng)藥廢水生物處理中,高效微生物強(qiáng)化,。如一些典型的化學(xué)污染物包括多環(huán)芳烴、鹵化有機(jī)物、多氯聯(lián)苯、多硝基芳烴和有機(jī)磷等農(nóng)藥和殺蟲劑。由于這些物質(zhì)對微生物有毒害作用,相應(yīng)具有代謝功能的19可利用性等多種因素影響微生物的生存及代

16、謝活28性。生物處理系統(tǒng)易受各種因素的影響導(dǎo)致系統(tǒng)不穩(wěn)定,甚至系統(tǒng)崩潰。利用生物強(qiáng)化技術(shù),可提高有效微生物濃度,減輕各種外界因素對系統(tǒng)的沖擊。研究了32、污泥、有機(jī)物去除效。在非生物強(qiáng)化,受32氯苯胺2d的沖擊后,出現(xiàn)氨氮積Boon29累,硝化活性在12d內(nèi)不能恢復(fù),COD的去除率下降36%;而生物強(qiáng)化反應(yīng)器中硝化活性在4d內(nèi)恢復(fù),COD的去除效率沒有下降。結(jié)果表明,接種32氯苯胺降解菌株強(qiáng)化加速了32氯苯胺的降解,保護(hù)硝化菌群,改善反應(yīng)器受毒害物質(zhì)沖擊后的恢復(fù)微生物數(shù)量很少,因此這些物質(zhì)會長期殘留在環(huán)境能力。中,造成污染。用常規(guī)的生物處理方法很難達(dá)到理3結(jié)語想的效果,生物強(qiáng)化技術(shù)成為有效的輔

17、助手段。2.2去除廢水中過量營養(yǎng)物盡管生物強(qiáng)化在生物修復(fù)中的作用在環(huán)境微生由于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)排放大量的無機(jī)鹽,使水體中物學(xué)術(shù)界的評價褒貶不一,而且許多成功的實踐都氮、磷等營養(yǎng)物含量過高,引起富營養(yǎng)化。而生物法處理這些污染物時,相應(yīng)的微生物生長緩慢,或維持高濃度微生物的條件控制困難。如生物硝化工藝主要缺點之一是啟動時間長、污泥流失或遭受沖擊負(fù)荷后很難恢復(fù)。這些問題主要是由于硝化菌生長速率緩慢,硝化菌產(chǎn)率低,因此生物強(qiáng)化技術(shù)被廣泛引入相應(yīng)的生物處理系統(tǒng)中。25Satoh等研究了硝化菌生物強(qiáng)化對轉(zhuǎn)盤生物膜反應(yīng)器啟動的影響,表明硝化菌強(qiáng)化極大地促進(jìn)生物膜中硝化菌群的高密度生長,導(dǎo)致快速啟動和原位硝化活性的

18、提高。接種的微生物能在生物膜中擴(kuò)增或繁殖。硝化菌的加入提高了生物膜表面硝化26菌的豐度,從而導(dǎo)致硝化速率加快。Head等研究了硝化菌生物強(qiáng)化對低溫廢水和短固體停留時間反應(yīng)器脫氮的影響,取得良好的脫氮效果。Belia等2724僅停留在實驗室階段,但存在對微生物有毒性作用的污染物或缺乏一定數(shù)量和質(zhì)量有效微生物的生物處理系統(tǒng)中,生物強(qiáng)化技術(shù)有明顯的優(yōu)勢。對現(xiàn)場生態(tài)特征有全面理解的基礎(chǔ)上,原位生物強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)已成為去除污染物的環(huán)境友好技術(shù)之一。用特定的有效微生物強(qiáng)化,可提高廢水生物處理系統(tǒng)中難降解有機(jī)物的降解效率、改善系統(tǒng)脫氮除磷效率、提高系統(tǒng)穩(wěn)定性等。高效微生物篩選是生物強(qiáng)化技術(shù)成功的決定性因素。改

19、進(jìn)傳統(tǒng)高效菌種篩選時以目標(biāo)污染物的降解為惟一手段,結(jié)合微生物的遺傳特征、污染物可生物降解性和生物修復(fù)速率等多方面因素,可開發(fā)出能夠維持異常代謝特征或?qū)瘜W(xué)污染物或環(huán)境壓力具有更好耐受性的高效菌種。通過分析環(huán)境微生物菌群的組成和結(jié)構(gòu),微生物的生態(tài)環(huán)境、種群結(jié)構(gòu)和利用純培養(yǎng)菌株Acinetobacterlwoffii數(shù)量變化,篩選具有高效降解性能、良好生態(tài)適應(yīng)對傳統(tǒng)活性污泥進(jìn)行強(qiáng)化,使聚磷菌在微生物中占性、能在目標(biāo)污染地維持相當(dāng)持久性和活性的微生44環(huán)境工程學(xué)報第1卷物菌株作為生物強(qiáng)化接種體,是提高生物強(qiáng)化技術(shù)的有效手段。利用基因工程手段構(gòu)建具有高效降解性能的土著微生物,或直接利用具有代謝性能的可

20、移動基因組分進(jìn)行強(qiáng)化,可避免與土著微生物競爭資源和空間,是未來生物強(qiáng)化技術(shù)的發(fā)展方向。分子生物學(xué)技術(shù)對生物強(qiáng)化技術(shù)不僅在構(gòu)建高效微生物中發(fā)揮重大作用,而且是監(jiān)控、探測、分析高效微生物在新的生態(tài)系統(tǒng)中種群結(jié)構(gòu)多樣性及變化的有力工具。以16SrRNA目標(biāo)寡核苷酸探針的29,30熒光定量雜交(FISH)、變性梯度凝膠電泳和溫31度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)等分子生物學(xué)手段與微生物生態(tài)學(xué)相結(jié)合,是評價生物強(qiáng)化和生26物刺激的有效工具,已經(jīng)成為研究給定環(huán)境中微科。模式,并性,確定生物強(qiáng)化技術(shù)工藝工程設(shè)計的關(guān)鍵參數(shù),如何將生物強(qiáng)化技術(shù)與微生物刺激、各種微生物固定化技術(shù)相結(jié)合,提高外源微生物的存活能

21、力和降解活性,這些都是未來生物強(qiáng)化技術(shù)研究的方向。參考文獻(xiàn)umcompositiononthecharacteristicsofadenitrifyingbio2filmformedbyAlcaligenesdenitrificansinafluidizedbedreactor.ProcessBiochem.,2002,37(8):8378452TopE.M.,SpringaelD.,BoonN.Catabolicmobilege23vanderMeerJ.R.,RavatnR.,SentchiloV.Theclcele24TsudaM.,TanH.M.,NishiA.,etal.Mobile

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