生物除磷污泥胞外多聚物含磷形態(tài)的核磁共振分析_張志超

1、Vol 29, No 2, pp53 6 539February, 2009第29卷，第2期2 0 0 9年2月光譜學(xué)與光譜分析Spectroscopy and Spectral Analysis生物除磷污泥胞外多聚物含磷形態(tài)的核磁共振分析張志超1,黃霞1* ,楊海軍2,肖康1,羅小2,沙恒1,陳奕名1清華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系，環(huán)境模擬與污染控制國家重點聯(lián)合實驗室，北京 1000842清華大學(xué)化學(xué)系，北京 100084摘 要 利用31 P- NM R研究了生物除磷污泥胞外多聚 物(EPS)的含磷形態(tài)，并對檢測方法中的影響因素進 行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，測定的三種污泥 EPS中磷的形態(tài)有五種，磷酸鹽

2、、磷單脂、DNA磷、聚磷末端、焦磷 酸鹽和聚磷。具有除磷能力的 A/A/O和A/A/OMBR污泥其EPS中主要含的是聚磷，證明了 EPS中含磷 不僅是依靠吸附磷酸鹽或生物聚磷過程磷酸鹽的滯留，而且EPS本身可能也參與了生物聚磷過程。同時實驗證明，EPS提取過程會對EPS含磷形態(tài)產(chǎn)生影響，但提取時間在1h內(nèi)時影響較?。籈PS在儲存前需 要進 行中和，從而避免儲存過程不同磷形態(tài)之間的轉(zhuǎn) 化。EPS含磷形態(tài)的31PNMR測定過程中，EPS樣品的pH 值對峰的分離和各峰化學(xué)位移的穩(wěn)定性有較大影響，需要控制樣品pH> 13 0以確保測定過程的準確性。關(guān)鍵詞 胞外多聚物；核磁共振磷譜；生物除磷；磷形

3、態(tài)中圖分類號：0434 1文獻標識碼：A DOI: 10 3964/j issn 1000 0593(2009)020536 04Vol 29, No 2, pp53 6 539February, 2009Vol 29, No 2, pp53 6 539February, 2009引言污水中的氮和磷是引 起水體富營養(yǎng)化的主要物質(zhì)，其中 磷元素被認為是最主要的限制因素 1。由于生物方法除磷不 會導(dǎo)致大量化學(xué)沉淀、 便于磷的回收利用，因此在污水處理 過程中得到了廣泛關(guān)注。但 是現(xiàn)有對生物除磷機理的研究, 主要集中在對污泥絮體整體的除磷特點、或者聚磷微生物種群特性的研究上，而對于組成污泥絮體大 部分

4、結(jié)構(gòu)的胞外多 聚物研究較少2。而研究生物除磷污泥 的胞外多聚物(extra cellular poly meric substances,簡稱 EPS)含磷 形態(tài)是進一步 研究胞外多聚物在生物除磷過程中作用的關(guān)鍵。利用核磁共振磷譜(31 P N M R)對磷形態(tài)進行分析和定量 在土壤、底泥等環(huán)境樣品的分析中已得到了應(yīng)用，如Khoshmanesh3, Reitzel等利用核磁共振分析底泥中磷的形態(tài)變 化；Lehmann等5利用核磁共振分析土壤中磷的形態(tài)及遷移規(guī)律。但據(jù)作者所知還沒有利用31 P NM R對于提取的生物 污泥胞外多聚物含磷形態(tài)研究的相關(guān)報道。本文的主要目的是 利用31 P- N M

5、 R方法考察三種污泥的 EPS中磷的形態(tài)及相關(guān)比例，從而進一步探討在生物除磷過 程中EPS的作用。同時考察了 EPS提取、儲存過程以及測定 前的pH值調(diào)節(jié)對測定的影響。收稿日期：200710-12,修訂日期：2008 0-18基金項目：國家杰出青年基金項目 (50725827)資助作者簡介：張志超，1979年生，清華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系博士研究生1材料和方法11試驗樣品使用了三種好氧污泥樣品，兩種污泥取自具備除磷能力 的工藝，分別為厭氧/缺氧/好氧工藝(A/ A/ O)和厭氧/缺氧/ 好氧結(jié)合膜-生物反應(yīng)器 工藝(A/A/OMBR)工藝，另外一種 污泥取自不具備除磷能 力的普通活性污泥工藝(C

6、AS)作為對 照。CAS工藝對總磷的 平均去除率為5 3%, A/ A/O工藝和 A/A/ O MBR工藝對總磷的平均 去除率在85 0%以上。12實驗儀器及測定方法胞外多聚物的提取采用甲醛NaOH法6。其中為盡量 避免可能出現(xiàn)的聚磷的 降解，NaOH的提取時間縮短 到1h, 根據(jù)文獻報道1h內(nèi)EPS的提取可基本完成7。磷形態(tài)的核磁共振磷譜測定。首先對提取的EPS樣品進 行HCI(1mol L-1)中和，然后將EPS樣品在-50 下真 空冷凍干燥48 h,之后在-20 下保持12 h。在測定過程 中，將EPS樣品溶于1 mL的D2O中，加入0 05 mL的 NaOH( 1 mol L- 1)使

7、pH值> 13,從而實現(xiàn)化學(xué)位移不受 pH值的影響。核磁共振波譜儀為 日本電子公司(JOEL)的JNM ECA- 600型譜儀，其31 P的共振 頻率為242 95 M Hz,使用5 mmemail: zzc99 mails tsingh ua edu cnVol 29, No 2, pp53 6 539February, 2009* 通訊聯(lián)系人e mail: xhuang tsinghua edu cn© 1994-2011 China AcadEmic Journal Electronic Publishing Hcusgl All rights vd. http/A第2期

8、光譜學(xué)與光譜分析537的探頭，測定溫度為25,脈沖序列采用標準的單脈沖，90脈沖寬度為10 4 s,馳豫時間為2 s,樣品的旋轉(zhuǎn)速度為 15 Hz。測試時間從212 h,根據(jù)S/ N> 3來選擇 合適的測 試時間。2結(jié)果與討論2 1 EPS的含磷形態(tài)分析如圖1所示，根據(jù)文獻8對不同磷形 態(tài)峰的鑒定方法, 測定的三種污泥EPS中的磷的形態(tài)共包括五種，自左向右分 別是：磷酸鹽(orthoP)、磷單脂(monoP)、DNA磷、聚磷末 端(End polyP)、焦磷酸鹽(pyroP)和聚磷中部(polyP),其中 聚磷末端磷(End polyP)和聚磷中部磷(Middle polyP)的總和 是

9、聚磷(polyP)。EPS中不同形態(tài)磷的比例見表 1。磷酸鹽的表征峰為單峰,位置在6 55 5。一般認為 磷酸鹽是通過吸附或者與金屬離子結(jié)合的形式存在于EPSEPS . .中9。磷酸鹽在CAS污泥EPS中占58 97%,是CAS污泥 EPS含磷的主要形態(tài)，但在具有除磷能力的A/A/ O和A/ A/ Q MBR污泥EPS中含量較少。磷單脂一般認為是來源于 細胞壁，其表征峰為單峰，位 置在 5 0 4 0o而DNA的表征峰也為單峰，在 0 50 5。 一般認為EPS中的少量磷單脂和DNA是細胞代謝過程中死 細胞在EPS中停留造成的，這與污泥所處的狀態(tài)有關(guān)。而在 本實驗中，三種污泥EPS樣品中磷單脂

10、和 DNA或者檢出量 比較少，或者低于檢測限，因此在計算中忽略不計。焦磷酸鹽存在于所有的樣 品中，其表征峰為單 峰，位置 在-3 5-4 5。在三種污泥中均有一定比例的存在，且 三種樣品之間 差異不大。部分的焦磷酸鹽可能是來源于在 EPS提取過程中聚磷在NaQH中的水解10。但是焦磷在 EPS中的形成和變化還需要進一步的研究證實。聚磷包括了聚磷末 端和聚磷中部，其中聚磷末端的 表征 峰為一簇峰，包含7個以上峰，其位置在-17 5 - 20 5, 而聚磷中部的峰也為一簇峰，包含2 3個峰，其位置緊靠焦 磷酸鹽峰的左邊在 -3 0 - 4 0。這進一步證實了 EPS中 含有聚磷的事實9, 11。在

11、兩種具有除磷能力的污泥EPS中 聚磷均占EPS含磷的50%以上，同時部分聚 磷以聚磷中部 為主，說明在具有除 磷能力的污泥EPS中聚磷是主要的成 分，且聚磷鏈比較長。相比之下，CAS污泥EPS中聚磷的含 量較低，且大部分為聚磷末端，說明CAS污泥中存在少量聚 磷，聚磷鏈較短。通過以上分析 認為，相比于沒有除磷能力的CAS污泥 來看，具有除磷能力的 A/ A/ Q和A/ A/ Q M BR污泥其EPS 中主要含有的是聚磷，證明了 EPS中含磷不僅是依靠吸附磷 酸鹽或者生物 聚磷過程磷酸鹽在EPS中的滯留，而且EPS 中可能本身就存在生物聚磷過程，從而造成了 EPS污泥中聚 磷的積累。第2期光譜學(xué)

12、與光譜分析#第2期光譜學(xué)與光譜分析#Table 1 Relative composition of the identified P forms in three EPS samples磷形態(tài)CAS污泥 EPSA/ A/ Q污泥 EPSA/ A/ QM BR污泥 EPSOrthophos phate/ %589712117851491789121Pyrophos phate/ %233813129392022729239End grou ps of Polyphosphate/ %1498097745035808024Middle gr oups of Poly phosphate/ %267

13、27545312224674143Note: The values reported are the average of three samples, given with one standard deviation ()第2期光譜學(xué)與光譜分析#第2期光譜學(xué)與光譜分析#2 2 EPS的提取與保存 過程對1050-10時亠30 Chemical shift Fig 1 Typical PNMR spectra from the investigatedEPS of three sludge samples PNMR 測定的影響不同形態(tài)的磷 之間普遍存在著相互轉(zhuǎn)化12,因此為了 保證提取的EP

14、S中各種形態(tài)磷的相對含量和原位EPS的情 況保持一致，必須對樣品的提取 和保存過程進行研究，以避 免可能發(fā)生的不同形態(tài)磷相互之間的轉(zhuǎn) 化。圖2a, b, c顯示 從A/A/C- MBR污泥提取的EPS在NaQH溶液中的 降解情 況。試驗通過在EPS提取液(05 mL)中加入NaQH ( 0 05 mL, 1 mol L-1),分別放置0, 1和24 h來模擬EPS的提取 過程(pH> 13 0)下EPS中各種形態(tài)磷 的轉(zhuǎn)化情景。其中o- tho P的變化比較小，從Oh的17 1%,到1 h之后的16 7% 和24 h之后的16 7%。在此過程中orthoP幾乎沒有太大變化。相對而言，聚磷

15、中部和末端的含量變化比較大，聚磷中 部持續(xù)下降從44 7%到43 2%再到39 2% ;而聚磷末端 相 反地持續(xù)上 升，從31 0%到31 6%再到33 4%。另外從圖 中可見聚磷中部的 峰中，化學(xué)位移較大的峰有明顯的減弱， 而化學(xué)位移較小的反而增強。這說明在NaOH的作用下聚磷 鏈被打斷。而從聚磷整體來看在NaOH的作用下聚磷含量是 在逐漸減少，從0 h的75 7%到1 h的74 8%再到24 h的 72 6%。而焦磷則有所增加，從7 2%到8 5%再到10 7%。 由于整個過程中orthoP基本沒有變化，因此認為在NaOH 的作用下部分的聚磷轉(zhuǎn) 化為焦磷，而不會轉(zhuǎn)化為磷酸鹽。對比圖2a和圖

16、2d可見，在水中EPS的穩(wěn)定性 比較高，24 h放置前后EPS中的各形態(tài)磷幾乎沒有變化。磷酸鹽從17 1%變?yōu)?7 8%,焦磷從7 2%變?yōu)? 1%,聚磷從 75 7% 到 75 1%。(和嘰4片L| LL-LjjT-i 一 (4) *.K .1066一Tio 15Chmiiful shiftFig 2 Impacts of NaOH and H2O solution on phosphorustransform ation in the EPS extracted from the A/ A/ OMBR sludge經(jīng)過上述分析可以認為，EPS提取過程會對磷形態(tài)有一 定影響，但在1h內(nèi)的影響

17、較??；在對提取后 的EPS儲存時, 需要提前進行中和后再保存，以最大程度避免EPS中不同磷 形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化。2 3 pH值調(diào)節(jié)對31 PNMR 測定的影響在測定過程中發(fā)現(xiàn)，磷譜的化學(xué)位移受樣品pH值的影 響較大13。對調(diào)節(jié)pH 7 0和pH 13 0的同一 EPS樣品進行 31 P NM R分析，結(jié)果如圖3所示。pH 13 0時各種形態(tài)磷的峰清晰，且分辨度較高；而pH 7 0時相應(yīng)化學(xué)位移的峰 出現(xiàn)重疊，不僅無法準確識別相應(yīng) 的磷形態(tài)的代表 峰，而且測定結(jié)果的真實性也大大受到影 響。因此在測定EPS含磷形態(tài)前需要加入N aOH調(diào)節(jié)pH 值達到13 0以上。J1l'(h) EPSfpHG

18、H0&0 站 -10-15-20Uhmira shiftFig 3 31 PNMR spectra from the same EPSsamplewith pH 7 0 and 13 03結(jié)論(1) 測定的三種污泥EPS中有五種磷的形態(tài)，磷酸鹽 (orthoP)、磷單脂(monoP)、DNA 磷、聚磷末端(End polyP )、焦磷酸鹽(pyroP)和聚磷中部(polyP),其中聚磷末 端磷(End polyP)和聚磷中部磷(M iddle polyP)的總和是 聚磷 (polyP)。(2) 具有除磷能力的A/A/ O和A/A/Q MBR污泥其 EPS中主要含有的是 聚磷，證明EPS

19、中含磷不僅是依靠吸 附磷酸鹽或者生 物聚磷過程磷酸鹽在EPS中的滯留，而且 EPS中可能本身就存 在生物聚磷過程，從而造成了 EPS污 泥中聚磷的積累。(3) 提取過程會對EPS含磷的形態(tài)有一定影響，但在1h 內(nèi)的影響較??；在對提取后的EPS儲存時，需要提前進 行中 和再保存，以最大程度避免EPS中不同磷形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化。EPS含磷形態(tài)的31P N MR測定過程中，樣品pH值 對峰的分離和各峰化學(xué)位移的穩(wěn)定性有較大影響，為了保證 測定的準確性，需要調(diào)節(jié)EPS樣品的pH> 13 0。第2期光譜學(xué)與光譜分析#第2期光譜學(xué)與光譜分析5391 Yoon T I, Lee H S, Kim C G.

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25、 ChinaAbstract The present paper investigated phosphorus forms in the extracellular polymeric substances (EPS) using 31 f- NMR spectroscopy, and analyzed the influential parameters for this method. The results showed that in the three investig ated EPS samples fiv e P fo rms were identif ied, includ

26、ing orthophosphate, orthophosphate monoesters, DN A, pyrophosphate and poly ph© sphat e. A nd in the EPS extracted fr om A/A / O sludge and A/A/ O MBR sludg e poly phosphate was the main phosphorus form. This indicated that P is co ntained in the EPS not only owing to the adsorption of orthophosphate, but also because EPS acting like the bacteria cells contr ibutes to enhanced biolog ical phosphorus removal. Further more t he t ransformation of