生物化學實驗復習總結(jié)資料(全)

1、生化實驗五大技術(shù).分光光度技術(shù)1定義：根據(jù)物質(zhì)對不同波長的光線具有選擇性吸收，每種物質(zhì)都具有其特異 的吸收光譜，而建立起來的一種定量、定性分析的技術(shù)。2. 根本原理:透光度T=lt /Io吸光度 A=l g(lo/ It)朗伯-比爾(1ambert-Beer)定律:A = KLc【K為吸光率，L為溶液厚度cm，c為溶液濃度mol/L】時,，-在某光吸收定波長下 圖摩爾吸光系數(shù)1摩爾濃度的溶液在厚度為1cm 的吸光度。c=A/ £3. 定量分析:1標準曲線(工作曲線)法2比照法3計算法：c=A/ £4差示分析法適用于濃度過濃或過稀5多組分混合物測定分子吸收法&原子吸收

2、法；可見光400760 nm&紫外光200400 nm&紅外光大于760 nm分光 光度法；5應(yīng)用方向有機物成分分析&結(jié)構(gòu)分析紅外分光光度法測定人體內(nèi)的微量元素一一原子吸收分光光度法二電泳技術(shù)1定義：帶電荷的供試品在惰性支持介質(zhì)中，在電場的作用下，向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分別離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法 記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。2.根本原理： 球形質(zhì)點的遷移率與所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。 v =Q/6 n r n3. 影響電泳遷移率的因素：電場強度： 電場強度大，帶電質(zhì)點的遷移率加速溶液的pH值：溶液的pH離pl

3、越遠，質(zhì)點所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大溶液的離子強度 ：電泳液中的離子濃度增加時會引起質(zhì)點遷移率的降低 電滲： 在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲4. 技術(shù)分類：自由電泳無支持體 區(qū)帶電泳有支持體：濾紙電泳常壓及高壓、薄層電泳薄膜及薄板 、凝 膠電泳瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠等5. 電泳分析常用方法及其特點：小分子物質(zhì)濾紙、纖維素、硅膠薄膜電泳復雜大分子物質(zhì)凝膠電泳 1醋酸纖維素薄膜電泳 這種薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸附性小，消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾現(xiàn)象 別離速度快，電泳時間短 樣品用量少 經(jīng)過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化， 有利于對電泳圖譜的 光吸收掃描測定

4、和膜的長期保存一特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測胰島素、溶菌酶、胎兒甲種球 蛋白(2) 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠孔徑較大，對一般蛋白質(zhì)不起分子篩作用 瓊脂糖凝膠彈性差，不適合管狀電泳-用于等電聚焦、免疫電泳、血清脂蛋白等蛋白質(zhì)電泳，以及DNA、RNA、核苷酸的分析(3) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 可調(diào)節(jié)孔徑大小 機械強度好，有彈性 分辨率高，用途廣 無電滲-用于不同分子量蛋白質(zhì)的電泳別離(4) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳該種電泳使蛋白分子相對遷移率(Rf)的大小完全取決于分子量的上下，因此可從 分子量的標準蛋白的對數(shù)和相對遷移率所作的標準曲線中求出供試品的分 子量-最常用定性分析蛋白質(zhì)的電泳方

5、法，特別用于蛋白質(zhì)純度檢測 &分子量測定(5) 等電聚焦電泳技術(shù)利用有pH梯度的介質(zhì)別離等電點不同的蛋白質(zhì)f由于其分辨率可達O.OIpH單位，因此特別適合于別離分子量相近而等電點不 同的蛋白質(zhì)組分，適合研究蛋白質(zhì)的微觀不均一性(6) 毛細管電泳 高靈敏度 高分辨率 高效快速 樣品少 本錢低一符合對多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等生物大分子的別離條件三. 層析技術(shù)固定相：固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；流動相：可以流動的物質(zhì)，如水和各種溶媒1原理：當待別離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組份的理化性質(zhì)存 在差異，與兩相發(fā)生相互作用吸附、溶解、結(jié)合等的能力不同，在兩相中的 分配含量比

6、照不同，而且隨流動相向前移動，各組份不斷地在兩相中進行再 分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小， 向前移動的速度快。2. 技術(shù)分類：按層析原理分類：名稱別離原理吸附層析法組份在吸附劑外表吸附，固定相是固體吸附劑，各能力不同分配層析法各組份在流動相和靜止液相固相中的分配系數(shù)不同離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑結(jié)和力不冋凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不冋，因而在凝膠上受阻滯的程度不冋親和層析法固定相只能與一種待別離組份專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組份別離按操作形式不同分類:名稱操作形式柱層析法固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個方向前移而

7、達別離薄層層析法將適當粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣后用流動相展開，使各組份 別離紙層析法用濾紙作液體的載體，點樣后用流動相展開，使各組份別離薄膜層析法將適當?shù)母叻肿佑袡C吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進行物質(zhì)的別離3. 層析法的特點與應(yīng)用 根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積，可以定性及定量； 析法與光學、電學或電化學儀器連用，可檢測出層析后各組份的濃度或質(zhì)量， 同時繪出層析圖； 層析儀與電子電腦聯(lián)用，可使操作及數(shù)據(jù)處理自動化，大大縮短分析時間； 分辨率高、靈敏度高、選擇性好、速度快-適用于雜質(zhì)多、含量少的復雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的別離分析4. 應(yīng)用方向柱層析、薄膜層析以硅膠/氧化鋁為

8、吸附劑一一別離非極性或極性不強的有 機物離子交換層析一一分子量相對較小的球狀蛋白的別離純化紙層析氨基酸、糖類、肽類、抗生素的別離排阻層析一一別離純化、分析生物大分子尤其是蛋白質(zhì)親和層析法一一適用于蛋白質(zhì)的別離純化氣象層析 氨基酸、脂肪酸、單糖、雙糖、固醇類物質(zhì)的別離，多肽、蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)的測定四離心技術(shù)1. 定義：利用旋轉(zhuǎn)運動的離心力，以及物質(zhì)的 沉降系數(shù)或浮力密度的差異進行 別離、濃縮和提純的一項操作。2. 根本原理：利用轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時所產(chǎn)生的強大離心力， 加快顆粒的沉降速度， 把樣品中不同沉降系數(shù)或浮力密度差的物質(zhì)別離開。顆粒在離心力場下的沉降情況都與沉降速度和沉降時間相關(guān)，沉降時間和速度取

9、決于：(1) 離心力；顆粒的大小、形狀和密度； 沉降介質(zhì)的密度和粘度。3. 離心形式：(1) 離心過濾：在有孔轉(zhuǎn)鼓的離心機中通過過濾介質(zhì)別離懸浮液的過程為離心過 濾。(2) 離心沉降(或澄清)：利用固液兩相比重的差異在離心機無孔轉(zhuǎn)鼓或管子中進行懸浮液沉降別離者為離心沉降(如用于凈制含少量固體的液體時也稱離心澄清 );(3) 離心別離：利用不同溶質(zhì)顆粒在液體各局部分布的差異，別離不同比重液體 的過程為離心別離?！倦x心過濾、離心沉降同屬固-液別離，離心別離那么屬液-液別離】4. 應(yīng)用方向普通離心機一一物質(zhì)的別離&提取高速離心機一一對樣品中的懸浮物質(zhì)進行高純度的別離、 濃縮、精制、提取，多用

10、于血液、細胞、蛋白質(zhì)、病毒、激素等的別離制備超速離心機既可以別離細胞的亞細胞器，也可以別離生物大分子五.酶學技術(shù)1酶活性:即酶促反響速度，指在規(guī)定條件下單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量注：在實際測定酶促反響速度時，以測定單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量為 好2.影響酶活性的因素：酶濃度、底物濃度、溫度、PH、抑制劑、激活劑、時 間3. Km值的應(yīng)用 鑒定酶的種類 反映酶與底物的親合力Km值越大，酶與底物親合力越小 選擇酶的最適底物 計算不同底物濃度時酶促反響速度相當于最大反響速度的比率 設(shè)計適宜的底物濃度4. V max值的應(yīng)用用來計算酶的轉(zhuǎn)化率TN即單位時間內(nèi)每分子酶可使底物發(fā)生化學反響的分 子數(shù)

11、5. 酶學分析在臨床診斷上的應(yīng)用1在肝臟疾病診斷中的應(yīng)用2在急性心肌梗死診斷中的應(yīng)用3在急性胰腺炎診斷中的應(yīng)用4在骨骼疾病診斷中的應(yīng)用5在肌肉疾病診斷中的應(yīng)用7在前列腺疾病診斷中的應(yīng)用8在腫瘤診斷中的應(yīng)用生化經(jīng)典驗證性實驗?胰酶對蛋白質(zhì)的消化和影響酶作用的因素?1. 實驗原理：白明膠膠片上蛋白質(zhì)，黑色 胰酶 肽或氨基酸無色以底片上白明膠的水解程度說明胰酶活性的上下】酶的活性受到酶濃度、底物濃度、溫度、pH、抑制劑、激活劑、時間等影響2. 實驗操作：取試管4支，標上序號-按順序參加所需試劑-混勻、水浴預熱 -放入底片全部浸沒-水浴間歇搖動試管-立即記錄褪色時 間完全或局部 酶濃度對酶活性的影響以

12、酶濃度作為變量：在其他條件不變的情況下，當 S?E時,V與E成正比關(guān)系。 溫度對酶活性的影響 先置于溫度 100°、40°、0°、0°- 13號管放回 40° 保溫：在其他條件不變的情況下，一定范圍內(nèi)增加溫度，酶反響速度升高；超 過一定的溫度范圍以后再增加溫度， 酶反響速度下降 【最適溫度不是酶的特征性 常數(shù)】 pH對酶活性的影響pH分別為5.0、7.0、10.0： pH通過影響酶或底物的電 離狀態(tài)，可影響酶的催化活性。 【最適 pH 不是酶的特征性常數(shù)】 抑制劑對酶活性的影響分別參加 NaCI、HgCI2、空白試劑：胰蛋白酶的抑 制劑有重金屬

13、離子Hg2+，其與酶結(jié)合使酶活性降低或失活。3. 考前須知： 在研究一種因素對酶的活性的時，需要嚴格的控制反響中其他因素保持不變， 只能改變要研究的某一種因素。 掌握好水解程度是本實驗的關(guān)鍵之一。 HgCI2有毒，操作時要格外小心，嚴防中毒。二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳1. 實驗原理： 以醋酸纖維素醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣 品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點為電泳支持物，在pH8.6的巴比妥緩沖液中，血清 蛋白全部帶負電荷，在直流電場中向正極移動，移動速度與蛋白質(zhì)所帶電荷成正 比，與顆粒大小成反比。120V電泳45min后，用氨基黑10B染色，可將血清依 次分為清蛋白最遠、

14、a 1-球蛋白、a 2-球蛋白、B -球蛋白、丫 -球蛋白 洗脫法定量：血清蛋白組分的相對百分數(shù)=Ax十A總X 100%清蛋白：球蛋白=A清*( A a 1+A a 2+A b +A 丫)2. 實驗操作:準備一標記粗糙面、鉛筆劃線一點樣粗糙面一電泳點樣面向下，點樣 端置于負極一染色多條薄膜時應(yīng)逐條浸入一漂洗注意控制染色和漂洗的 時間，防止背景過深或某些區(qū)帶太淺 一洗脫定量法定量剪下各蛋白區(qū)帶 將洗脫液用分光光度計比色3. 考前須知： 點樣時，應(yīng)將薄膜外表多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。 點樣應(yīng)點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。 電泳時應(yīng)將薄膜的點樣端置于電泳槽的負極

15、端，且點樣面向下。 應(yīng)控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區(qū)分，或 造成條帶染色不均勻，必要時可進行復染。三.丙二酸對琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制作用1. 實驗原理： 琥珀酸脫氫酶是一種重要的脫氫酶，其輔基為 FAD，在缺氧的情況下，可使 琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下之氫可將藍色的甲烯藍復原成無色的甲烯白。珈顒+甲烯藍聃瞰脫誦延曲黠斗彌白無氧條件 丙二酸的化學結(jié)構(gòu)與琥珀酸相似，它能與琥珀酸競爭而和琥珀酸脫氫酶結(jié)合。假 設(shè)琥珀酸脫氫酶已與丙二酸結(jié)合，那么不能再催化琥珀酸脫氫，即無法使甲烯藍變 為無色甲烯白。 競爭抑制劑使酶的Km T, Vmax不變，抑制程度取決于酶與抑制劑的相

16、對親2. 實驗操作:酶提取液的制備一取試管6支，編號-按圖步驟操作酶提取液ml磷酸緩沖液ml0.2mol/L琥珀酸滴0.02mol/L琥珀酸滴0.2mol/L丙二酸溶液滴0.02mol /L丙二 酸溶液滴蒸餾水滴甲烯藍滴試管12-8-83試管22-8-8-3試管32-8-8-3試管42-88-3試管5-28-83試管62-8-83試管6,在酶提取液先在100C的水浴加熱煮沸5min一各管溶液立即混均勻，沿試管壁參加液體石蠟一各管置于37C的水浴中保溫,切勿搖動試管，隨時觀察比擬各試管顏色的變化，記錄褪色時間3. 考前須知： 酶提取液的制備應(yīng)操作迅速，以防止酶活性降低。 參加液體石蠟的作用是隔絕

17、空氣，以防止空氣中的氧氣對實驗造成影響， 因此 加石蠟時試管壁要傾斜，注意不要產(chǎn)生氣泡。 37C水浴保溫過程中，不能搖動試管，防止空氣中的氧氣接觸反響溶液， 使得 復原型的甲烯白重新氧化成藍色。 實驗結(jié)果結(jié)束后，一定要洗干凈試管內(nèi)的液體石蠟。四. 豬肝中核酸的提取與鑒定1. 實驗原理：核蛋白的提取:三氯醋酸肝組織勻漿一L核蛋白沉淀原因：三氯醋酸可沉淀蛋白質(zhì)從核蛋白中提取核酸：10%NaCI核蛋白 1核樹 +蛋白質(zhì)沉淀原因：憶的NmCI潯港抽fit跚»t墨白農(nóng)的誨髯度低10%N»CI核蛋白 -核酸鈉4蛋白質(zhì)沉淀9S%Zlff垓瞬沉淙核酸DNA、RNA丨成分的鑒定相酸鍍氮基蔡酚

18、磺酸 1 1磷相酸鉗藍藍色濃硫酸3,卜二輕基甲垛糠薛1f綠色化合物濃酸1苯讓1氧核精 一，«-輕基-酮基戊薛-1藍色化合釧2. 實驗操作： 勻漿制備 別離抽提：將肝勻漿倒入離心管內(nèi)f參加 2%三氯醋酸4ml，攪拌后靜置3分鐘f 3000轉(zhuǎn)離心5分鐘f傾去上清液，向沉淀中參加95%乙醇，攪勻后置于沸水中加熱 2minf冷卻后離心5minf傾去上層酒精液，在沉淀中參加10% NaCl溶液4ml攪勻f置于 沸水 中加熱8分鐘并不斷攪拌f冷卻后 離心3000轉(zhuǎn)每分鐘，5分鐘f將上清液倒入小燒 杯內(nèi)f取等量的95%乙醇，逐步滴加小燒杯內(nèi)，邊加邊搖勻 f白色沉淀逐漸出現(xiàn)后， 靜置10分鐘f將小燒

19、杯內(nèi)容物倒入離心管，離心3000轉(zhuǎn)每分鐘，5分鐘f傾倒上清液即得到核酸鈉的白色沉淀 RNA與DNA的成分的鑒定3. 考前須知： 在離心管平衡后，對稱放入離心機，切忌將沒加管套的離心管放入離心機， 離 心完后取出離心管 防止液體灑在離心機上面或鉆頭上 啟動離心機后，離心機如有不正常反響或噪音，應(yīng)立即停止離心，并分析原因五. 雙縮脲法測定血清蛋白質(zhì)含量1. 實驗原理： 血清中蛋白質(zhì)的多肽的肽鍵-CO-NH-在堿性溶液中能與2價銅離子作用生 成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。蛋白質(zhì)+CuSO+O4紫紅色絡(luò)合物這種紫紅色絡(luò)合物在540nm處有明顯吸收峰，吸光度在一定范圍內(nèi)與血清蛋白含 量呈正比關(guān)系，經(jīng)與同樣處理的

20、蛋白質(zhì)標準液比擬，即可求得蛋白質(zhì)含量。 利用吸收光譜對蛋白質(zhì)進行定量分析最大波長位于 540nm處1標準曲線法2標準管法G/Ax=C/As, 測定As、Ac,可求得CX2.實驗操作：取7支試管，編號，按照圖1操作并記錄。空白管標準管測定管12345蛋白質(zhì)標準液-1.0-待測血清樣本-1.0氯化鈉溶液1.0-雙鎖脲試劑4.04.04.0P 4.04.04.04.0入光吸收值0混勻各管，室溫放置10min，以空白管調(diào)零，在波長540nm比色，讀取 各管光吸收值。3.考前須知：須于顯色后30min內(nèi)測定，且各管由顯色到比色時間應(yīng)盡可能一致。 樣品蛋白質(zhì)含量應(yīng)在標準曲線范圍內(nèi)。 用分光光度計要注意：取

21、吸收池時， 應(yīng)拿毛玻璃兩面，切忌用手拿捏透光面， 以免粘上油污；液體的體積為比色杯的2/3-3/4;不要將比色杯放在分光光度計上； 試驗完成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿。六. 紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用1. 實驗原理： 氨基酸的轉(zhuǎn)氨基作用溶質(zhì)層祈點中程到原點中心的距離 m國=溶劑前緣到原點中心的距離實驗組發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反響，最后體系中有兩種氨基酸；對照組不發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反響，體系中只有一種氨基酸； 紙層析法分配層析：濾紙一一支持物固定相一一水 流動相一一乙醇有機溶劑由于混合物中的各成分的分配系數(shù)不同，別離受固定相的阻力和受流動相的推力 影響不同，各組分移動速度不同，有效成分和雜質(zhì)在這兩個相中連續(xù)屢次地進行 分

22、配、吸附和交換作用，最終結(jié)果是使混合物得到別離。 在固定相中分配趨勢較大的組分，隨流動相移動的速率較慢，不同組分在紙上 移動的速率不同，用Rf表示：Rf=溶質(zhì)中心到原點中心的距離/溶劑前緣到原點中心的距離物質(zhì)在一定的溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故比移值Rf可用來鑒別被別離的物質(zhì)。2. 實驗操作： 肝勻漿的制備 轉(zhuǎn)氨基反響：取干凈試管2支，分別標明測定管與對照管，按下表操作試劑 d測定管對照管肝勻漿101037 C 水浴 10mi n沸水浴 10min丙氨酸1010a酮戊二酸1010點樣 注意點樣斑點不可太大，直徑應(yīng)小于0.5cm 層析：在濾紙圓心處打一小孔，另取同類濾紙卷成圓筒如燈芯插入小孔； 將濾紙放在培養(yǎng)皿上，燈芯下端浸入層析液中 , 待溶劑前沿距濾紙邊緣約 1/3 處， 取出濾紙。 顯色 /染色：將上述濾紙平放在培養(yǎng)皿