高級生物化學(xué)實驗指導(dǎo)

1、高級生物化學(xué)實驗指導(dǎo)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生化研究室 二零一二年十月目錄實驗一 豬血中超氧化物歧化酶(sod)的分離純化及活力測定、 同工酶電泳.1實驗二 蛋白質(zhì)分子量測定-凝膠層析法8實驗三 納米磁珠法小規(guī)模提取質(zhì)粒DNA及純化鑒定18實驗四 DNA的瓊脂糖凝膠電泳21實驗一 豬血中超氧化物歧化酶(sod)的分離純化及活力測定、 同工酶電泳 一、原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是一種能專一地清除超氧離子自由基（O2-）的金屬酶,他具有抗衰老.抗輻射、抗炎和抗癌等作用，因而在醫(yī)藥化妝品、食品工業(yè)等方面具有了廣泛地應(yīng)用前景。 SOD是一種酸性蛋白，對熱、PH和蛋白酶

2、的水解較一般酶穩(wěn)定。按照它所含金屬離子的不同，可分為Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三種。Cu-Zn-SOD為二聚體，呈藍綠色；Mn-SOD呈紫紅色；Fe-SOD呈褐色。SOD催化下述反應(yīng)：2H+2O2-H2O2+O2。機構(gòu)內(nèi)0-的過量和不足均對集體不利，SOD對過量的02-的及時清理保證了集體內(nèi)02-的含量相對平衡。集體內(nèi)的O2-的形成可病理性和生理性兩方面。在一些正常的生理過程中形成一些02-。例如：呼吸鏈中電子傳遞結(jié)果可以產(chǎn)生一些O2-。在某些疾病的過程產(chǎn)生大量02-如不及時清理，會對細胞損傷。SOD將02-，歧化為H202，而過氧化酶、股胖肝泰過氧化酶可以催化過氧化氫分

3、解，在集體內(nèi)形成一套解毒系統(tǒng)，對集體起防護作用。本實驗采用郵寄溶劑沉淀方法以新鮮豬血為原料，從中提取SOD并驚醒純化。酶活力測定可用以下方法；鄰苯三分自氧化法、黃嘌呤氧化酶法、NBT光還原法、化學(xué)發(fā)光法、腎上腺自氧化法、亞硝酸法等。該實驗sod酶活性采用鄰苯三分自氧化法測定，酶活性單位定義為：每毫升反應(yīng)中，每分鐘抑制鄰苯三分氧化速率達50%的酶含量定義為一個酶的單位。樣品中的蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍G-250法測定?？捡R斯藍G-250Coomassic brilliant blue G-250）在在游離狀態(tài)下呈紫色，與蛋白質(zhì)結(jié)合呈現(xiàn)藍色。在一定范圍內(nèi)，溶液在595nm波長下的光密度與蛋白質(zhì)含量成

4、正比，可用比色法測定，測定范圍1-1000ug。SOD同工酶鑒定采用不連續(xù)聚丙烯酰酰胺凝膠電泳技術(shù)分離鑒定。用“負”顯色法，核黃素經(jīng)光照所產(chǎn)生的活性氧O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮嗟藍（NBT）由黃色的氧化型轉(zhuǎn)化為藍色的還原型。由于SOD能夠抑制O2-的作用，因此，電泳分離SOD后，凝膠上無SOD處應(yīng)顯示為藍色，而有SOD處則無色透明，由此可鑒定SOD同工酶的酶譜（即同工酶的數(shù)量、分布及活性大小）。2、 實驗試劑與器材試劑1. SOD的提取ABC抗凝劑：檸檬酸10g，檸檬酸鈉30g，葡萄糖25g，用適量蒸餾水溶解并稀釋至1000ml.0.9%NaCl0.9g，溶于100ml蒸餾水中。丙酮9

5、5%乙醇氯仿2. SOD活力測定50mmol/L pH8.3磷酸緩沖液10mmol/L EDTA鈉鹽溶液3mmol/L 領(lǐng)苯三酚溶液（用10mmol/L鹽酸配制）3. 考馬斯亮藍G-250法測蛋白質(zhì)考馬斯亮藍G-250試劑：稱取100mg考馬斯亮藍G250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，蒸餾水定容至1000ml。此試劑常溫下可保存30天。標準蛋白質(zhì)溶液：精確稱取結(jié)晶牛血清白蛋白25mg，加蒸餾水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸餾水稀釋至100ml，即為100ug/ml的標準蛋白質(zhì)溶液。4. SOD同工酶鑒定40%蔗糖w/v：稱取40g蔗糖加重

6、蒸水100ml。10%過硫酸銨Ap：稱過硫酸銨10g，溶于100ml重蒸水中。用時現(xiàn)配。電極緩沖液：稱取三時配羥甲基氨基甲烷6g，甘氨酸28.8g。用蒸餾水溶解并定容至1000ml，過濾后裝入棕色瓶，4保存。30%的AcrBis溶液：稱Acr30g，Bis0.8g，加重蒸餾水溶解，定容至100ml，過濾后裝入棕色瓶，4保存。Tris-HCL，ph6.7緩沖溶液：Tris6.0g，加入1mol/L HCL 48ml，TEMED0.4ml,用濃鹽酸調(diào)PH8.9后，再用蒸餾水定容至100ml。Tris-HCI，PH6.7緩沖溶液：Tris6.0g,加1mol/L HCL 48ml,TEMED0.4m

7、l,用濃鹽酸調(diào)至PH6.7后，再用蒸餾水定容至100mlNBT溶液：核黃素嗎（0.01%），氯化硝基四氮嗟藍（NBT）（25mol/L），磷酸緩沖液（0.05mol/L）、PH7.8），EDTA-Na2（1.0mol/L）。2.8×10（3）mol/L的EDTA-Na2（用PH7.8/,3.6×10（3）moL/L磷酸緩沖液配制）器材752分光光度計；分析天平；具塞試管；刻度吸管；（1ml，5ml）；離心機；燒杯（50ml）電泳裝置一套；微量進樣器；注射器。 三、操作步驟1. SOD的提取 1取新鮮豬血20ml（預(yù)先0.15:1（v/v）的比例加入ACD抗凝劑），4000r

8、/m，10min，去上層血漿，取下層紅血球粘稠液，并量其體積，然后加入2倍體積的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min，棄上層清液，再加入2倍體積的0.9%Nacl溶液重復(fù)清洗一次，4000r/m，10min,得洗凈的紅血球濃稠液。2向洗凈的紅血球中加入等體積的蒸餾水，劇烈攪拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中緩慢加入預(yù)冷的0.25倍體積的95%乙醇溶液和0.15倍體積的氯仿，勻漿呈暗紅色，再繼續(xù)攪拌15min，4000r/m，10min，去變性蛋白沉淀物，得上層液，留樣2ml。將上層液用多層紗布進行粗濾，以除去上層液中的漂浮物，然后將清夜在65-70恒溫水浴中進行熱處理，1

9、5min后取出迅速冷卻至室溫，4000r/m，15min除沉淀，得淺黃色粗酶液，留樣2ml。3向粗酶液中加入等體積的丙酮溶液，冰箱中靜置過液，4000r/m，10min棄上清液，得沉淀。將沉淀物用等體積預(yù)冷的丙酮溶液洗二次，離心收集沉淀，自然干燥即得淡綠色成品，按1mg/ml溶于蒸餾水，備用。2.SOD活力測定 1鄰苯三酚自氧化率的測定 取405ml50mol/L pH8.3的磷酸緩沖液，4.2ml蒸餾水和1ml10mol/LEDTA-Na2溶液，混勻后在25水浴保溫20min，取出后立即加入25預(yù)熱過的鄰苯三酚溶液0.3ml，迅速搖勻，倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，用10mol/L HCI作空白

10、，325nm波長下每隔30秒測光密度值一次，整個操作在4min內(nèi)完成，計算出每分鐘A325的增值，此即為鄰苯三酚自氧化率。要求自氧化氯控制在0.070/min左右。 2酶活力測定 操作與1一致，加入鄰苯三酚前，先加入0.1ml的SOD樣液，蒸餾水則減少相應(yīng)的體積，同理測其光密度值，計算加酸后鄰苯三酚自氧化氯。 3酶活性單位的計算 根據(jù)酶活性單位的定義，按下列公式計算酶活性： (A0-Am)/A0*100% 樣液稀釋倍數(shù)單位活性（U/ml）=-*反應(yīng)液總體積數(shù)*- 50% 樣液體積 其中，A0為鄰苯三酚自氧化氯；Am為加酶后鄰苯三酚自氧化氯。 總結(jié)性（U）=單位活性*酶原液總體積 4蛋白質(zhì)含量測

11、定（考馬斯亮藍G-250法） 標準曲線的制作：取6支具塞試管，編號，按下表加入試劑： 管 號 試 劑 1 2 3 4 5 6 蛋白質(zhì)標準液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸餾水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考馬斯亮藍G-250(ml) 5 5 5 5 5 5蛋白質(zhì)含量（ug） 0 20 40 60 80 100 塞上蓋子，搖勻。注意各管振蕩程度盡量一致。在595nm波長下比色測定光密度值，比色應(yīng)在1h內(nèi)完成。以牛血清蛋白質(zhì)含量（ug）為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪出標注曲線。 樣品中蛋白質(zhì)含量的測定 將待測的SOD溶解并解釋到一定濃度，取1支具塞試管，

12、準確加入0.1ml樣品提取液，加入0.9ml蒸餾水和5ml考馬斯亮藍G-250試劑，其余操作與標準曲線制作相同。 蛋白質(zhì)含量計算 根據(jù)所測樣品提取液的光密度，在標準曲線上查到相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，計算其濃度。 5結(jié)果處理 利用考馬斯亮藍G-250法測定每毫升酶原液蛋白質(zhì)毫克數(shù)。 單位活力（U/ml） 總活力 比活力（U/mg）=- = - 單位蛋白質(zhì)濃度（mg/ml） 總蛋白質(zhì)（mg） 將測定的數(shù)據(jù)或計算結(jié)果填入下表：提純步驟 酶液總體積 蛋白質(zhì) 酶活性 總活性 比活性 回收率 純化倍數(shù) ml mg/ml U/ml U U/mg % 除血蛋白血清熱變性后上清丙酮沉淀后的3.SOD同工酶鑒定（PAG

13、E） 1樣品制備 取一定濃度（約SOD0.5mg/ml）酶液，按酶液：40%蔗糖=1：1（V: V）的比例配成樣品液，備用。 2上樣及電泳 組成電泳槽：將四只固定螺桿插入一只貯槽的相應(yīng)空洞中，然后將貯槽框放在桌上。左手拿凹形帶槽橡膠?？?，右手的拇指與中指握住短玻璃板的兩側(cè)邊緣插到橡膠模框的短槽內(nèi)，然后以同樣方式將長玻璃極插到相應(yīng)的長槽內(nèi)，將帶有長、短玻璃板的橡膠?？蚱椒旁谘龇诺馁A槽框架上，其下緣必須對齊貯槽框下緣。雙手拿另一只貯槽框仰放在桌上的貯框相會，并使橡膠?？蛏系耐钩鼍€位于貯槽的有機玻璃框的中央。裝上四只螺母。擰緊螺絲。最好用雙手按斜角位置雙雙逐漸擰緊。將電泳槽垂直置起，放在桌上，帶短玻

14、璃板的貯槽稱上槽，帶長玻璃板的貯槽稱下槽，在長玻璃板與膠模框間有一縫隙。此縫隙可用已溶化的1%瓊脂沿長玻璃板下端灌入，以防止產(chǎn)生氣泡。待瓊脂完全凝固后才能灌膠。1凝膠的制備 取兩只潔凈的小燒杯標號，按下述試劑配方：試劑 燒杯編號 分離膠 濃縮膠 30%Acr-Bis 4.0ml 0.8mlTris-HCL Ph8.9緩沖液 3.0ml -Tris-HCL Ph6.7緩沖液 - 1.0mlH2O 9.0ml 3.0ml10%AP 0.3ml 0.15m組裝好的電泳槽，先制分離膠，再在其上制濃縮膠，灌濃縮膠時將梳子插入，待膠凝后就可形成凹形加樣槽。2加樣及電泳先將電泳槽注滿電極緩沖液，分別在各樣品

15、管中加入20-30ml樣品液。電流調(diào)至200V電泳，待樣品全部進膠后，調(diào)電壓至250V,電泳至示蹤染料下行距膠底1cm處停止電泳，取出玻璃板（含凝膠）。3取出膠板顯帶用扁平藥匙輕輕揭去一塊玻璃板，另一板上的凝膠膠面朝下，再啟膠一角注水，使膠緩緩落入培養(yǎng)皿中。將電泳后的凝膠在嚴格避光的NBT溶液內(nèi)浸泡20min，再放在2.8mol/L的EDTA-Na2溶液中，40w日光燈下直射，至藍色背景下出現(xiàn)多條透明酶帶為止，觀察結(jié)果，拍照繪制模式圖。4干膠制備在浸泡的兩張玻璃紙u（比膠大）中夾入凝膠，平置子一塊玻璃板上，趕除期間的氣泡，將玻璃紙四周邊緣折向玻璃板底，用另一塊同樣大小的玻璃板壓住，再用鐵夾將兩

16、塊板夾緊，室溫下放置至干，修剪后保存。倍體積的0.9%Nacl溶液重復(fù)清洗一次，4000r/m，10min,得洗凈的紅血球濃稠液。2向洗凈的紅血球中加入等體積的蒸餾水，劇烈攪拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中緩慢加入預(yù)冷的0.25倍體積的95%乙醇溶液和0.15倍體積的氯仿，勻漿呈暗紅色，再繼續(xù)攪拌15min，4000r/m，10min，去變性蛋白沉淀物，得上層液，留樣2ml。將上層液用多層紗布進行粗濾，以除去上層液中的漂浮物，然后將清夜在65-70恒溫水浴中進行熱處理，15min后取出迅速冷卻至室溫，4000r/m，15min除沉淀，得淺黃色粗酶液，留樣2ml。3向粗酶液中加入等體積的

17、丙酮溶液，冰箱中靜置過液，4000r/m，10min棄上清液，得沉淀。將沉淀物用等體積預(yù)冷的丙酮溶液洗二次，離心收集沉淀，自然干燥即得淡綠色成品，按1mg/ml溶于蒸餾水，備用。2.SOD活力測定 1鄰苯三酚自氧化率的測定 取405ml50mol/L pH8.3的磷酸緩沖液，4.2ml蒸餾水和1ml10mol/LEDTA-Na2溶液，混勻后在25水浴保溫20min，取出后立即加入25預(yù)熱過的鄰苯三酚溶液0.3ml，迅速搖勻，倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，用10mol/L HCI作空白，325nm波長下每隔30秒測光密度值一次，整個操作在4min內(nèi)完成，計算出每分鐘A325的增值，此即為鄰苯三酚自氧

18、化率。要求自氧化氯控制在0.070/min左右。 2酶活力測定 操作與1一致，加入鄰苯三酚前，先加入0.1ml的SOD樣液，蒸餾水則減少相應(yīng)的體積，同理測其光密度值，計算加酸后鄰苯三酚自氧化氯。 3酶活性單位的計算 根據(jù)酶活性單位的定義，按下列公式計算酶活性： (A0-Am)/A0*100% 樣液稀釋倍數(shù)單位活性（U/ml）=-*反應(yīng)液總體積數(shù)*- 50% 樣液體積 其中，A0為鄰苯三酚自氧化氯；Am為加酶后鄰苯三酚自氧化氯。 總結(jié)性（U）=單位活性*酶原液總體積 4蛋白質(zhì)含量測定（考馬斯亮藍G-250法） 標準曲線的制作：取6支具塞試管，編號，按下表加入試劑： 管 號 試 劑 1 2 3 4

19、 5 6 蛋白質(zhì)標準液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸餾水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考馬斯亮藍G-250(ml) 5 5 5 5 5 5蛋白質(zhì)含量（ug） 0 20 40 60 80 100 塞上蓋子，搖勻。注意各管振蕩程度盡量一致。在595nm波長下比色測定光密度值，比色應(yīng)在1h內(nèi)完成。以牛血清蛋白質(zhì)含量（ug）為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪出標注曲線。 樣品中蛋白質(zhì)含量的測定 將待測的SOD溶解并解釋到一定濃度，取1支具塞試管，準確加入0.1ml樣品提取液，加入0.9ml蒸餾水和5ml考馬斯亮藍G-250試劑，其余操作與標準曲線制作相同。 蛋

20、白質(zhì)含量計算 根據(jù)所測樣品提取液的光密度，在標準曲線上查到相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，計算其濃度。 5結(jié)果處理 利用考馬斯亮藍G-250法測定每毫升酶原液蛋白質(zhì)毫克數(shù)。 單位活力（U/ml） 總活力 比活力（U/mg）=- = - 單位蛋白質(zhì)濃度（mg/ml） 總蛋白質(zhì)（mg） 將測定的數(shù)據(jù)或計算結(jié)果填入下表：提純步驟 酶液總體積 蛋白質(zhì) 酶活性 總活性 比活性 回收率 純化倍數(shù) ml mg/ml U/ml U U/mg % 除血蛋白血清熱變性后上清丙酮沉淀后的3.SOD同工酶鑒定（PAGE） 1樣品制備 取一定濃度（約SOD0.5mg/ml）酶液，按酶液：40%蔗糖=1：1（V: V）的比例配成樣品液

21、，備用。 2上樣及電泳 組成電泳槽：將四只固定螺桿插入一只貯槽的相應(yīng)空洞中，然后將貯槽框放在桌上。左手拿凹形帶槽橡膠?？?，右手的拇指與中指握住短玻璃板的兩側(cè)邊緣插到橡膠模框的短槽內(nèi)，然后以同樣方式將長玻璃極插到相應(yīng)的長槽內(nèi)，將帶有長、短玻璃板的橡膠?？蚱椒旁谘龇诺馁A槽框架上，其下緣必須對齊貯槽框下緣。雙手拿另一只貯槽框仰放在桌上的貯框相會，并使橡膠?？蛏系耐钩鼍€位于貯槽的有機玻璃框的中央。裝上四只螺母。擰緊螺絲。最好用雙手按斜角位置雙雙逐漸擰緊。將電泳槽垂直置起，放在桌上，帶短玻璃板的貯槽稱上槽，帶長玻璃板的貯槽稱下槽，在長玻璃板與膠?？蜷g有一縫隙。此縫隙可用已溶化的1%瓊脂沿長玻璃板下端灌入

22、，以防止產(chǎn)生氣泡。待瓊脂完全凝固后才能灌膠。1凝膠的制備 取兩只潔凈的小燒杯標號，按下述試劑配方：試劑 燒杯編號 分離膠 濃縮膠 30%Acr-Bis 4.0ml 0.8mlTris-HCL Ph8.9緩沖液 3.0ml -Tris-HCL Ph6.7緩沖液 - 1.0mlH2O 9.0ml 3.0ml10%AP 0.3ml 0.15m組裝好的電泳槽，先制分離膠，再在其上制濃縮膠，灌濃縮膠時將梳子插入，待膠凝后就可形成凹形加樣槽。2加樣及電泳先將電泳槽注滿電極緩沖液，分別在各樣品管中加入20-30ml樣品液。電流調(diào)至200V電泳，待樣品全部進膠后，調(diào)電壓至250V,電泳至示蹤染料下行距膠底1c

23、m處停止電泳，取出玻璃板（含凝膠）。3取出膠板顯帶用扁平藥匙輕輕揭去一塊玻璃板，另一板上的凝膠膠面朝下，再啟膠一角注水，使膠緩緩落入培養(yǎng)皿中。將電泳后的凝膠在嚴格避光的NBT溶液內(nèi)浸泡20min，再放在2.8mol/L的EDTA-Na2溶液中，40w日光燈下直射，至藍色背景下出現(xiàn)多條透明酶帶為止，觀察結(jié)果，拍照繪制模式圖。4干膠制備在浸泡的兩張玻璃紙u（比膠大）中夾入凝膠，平置子一塊玻璃板上，趕除期間的氣泡，將玻璃紙四周邊緣折向玻璃板底，用另一塊同樣大小的玻璃板壓住，再用鐵夾將兩塊板夾緊，室溫下放置至干，修剪后保存。實驗二 蛋白質(zhì)分子量的測定凝膠層析法一、原理 凝膠層析法是利用凝膠把分子大小不

24、同的物質(zhì)分離開的一種方法，又叫分子篩層析法，排阻層析法。凝膠本身是一種分子篩，它可以把分子按大小不同的進行分離，如同過篩可以把大顆粒與小顆粒分開來一樣。但是這種“過篩”與普通過篩不一樣。將凝膠顆粒在適宜溶劑中浸，使充分洗液膨脹，然后裝入層析柱中，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫，在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內(nèi)部而言凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進入凝膠內(nèi)部，流速緩慢，以致最后流出柱外，而使樣品分子不同的分子得到分離。凝膠室友叫退溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，不論是天然還是人工合成凝膠，他們的內(nèi)部都具有很多和微細的多孔網(wǎng)狀機構(gòu)，凝膠層析法常用天然凝膠是瓊脂凝膠，人工合成的凝膠是聚

25、丙烯酰胺凝膠，和葡萄糖凝膠，具有不同孔隙度的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，不溶于水。這種聚合物的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，起孔隙代銷與被分離物質(zhì)分子的大小有相似的數(shù)量級，在凝膠充分溶脹后，交聯(lián)度高的，孔隙小，只能有相應(yīng)的小分子可以通過，適用于分離小物質(zhì)。相反，交聯(lián)度低的孔隙大，適用于分離大分子的物質(zhì)。利用這種性質(zhì)可分離不同分子量的物質(zhì)。一下進一步來說明凝膠層析的原理。將凝膠裝在柱子里，柱床體積稱為總體積，以Vt表示。實質(zhì)上Vt是由Vo、Vi與Vg三部分組成，既Vt=Vi+Vg+Vo。Vo稱為孔隙體積或者外體積，又稱為外水體積，即存在于柱床內(nèi)凝膠克里外面孔隙之間的水相體積，相應(yīng)于一般層析法中柱內(nèi)部流動相的體積；Vi為

26、內(nèi)部體積，濟寧叫顆粒內(nèi)部所含水相的體積，因此Vt-Vo=Vi+Vg脫洗體積與Vo及Vi之間的關(guān)系可用下式表示Ve=Vo+KdVi式子中的Ve為脫水體積，自加入樣品時算起，到祖墳最大濃度出現(xiàn)時候流出的體積，Kd為樣品組分在二相間的分配系數(shù)。它只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮》植加嘘P(guān)，與柱的長短粗細無關(guān)，也就是說他對每一個物質(zhì)為常數(shù)。與柱的物理條件無關(guān)。Kd可以通過實驗室求得。上式子可改寫成：Kd=（Ve-Vo)/Vi Vo表示外體積；Vi內(nèi)體積；VeII、VeIII分別代表組分II和III的洗脫體積。Kd可以有下列幾種情況：1、當Kd=0時，則Ve=Vo。即對于根本不能進入凝膠內(nèi)部的

27、大分子物質(zhì)（全排阻），洗脫體積等于空隙體積（圖4-1組分I）2、當Kd=1時，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時，洗脫體積應(yīng)為空隙體積與內(nèi)體積之和（圖4-1組分III）?？梢钥闯?，對某一凝膠介質(zhì)，兩種全排出的分子即Kd都等于零，雖然分子大小有差別，但不能有分離效果。同樣兩種分子如都能進入內(nèi)部空隙，即Kd都等于1，它們即使分子大小有不同，也沒有分離效果。因此不同型號的凝膠介質(zhì)，有它一定的使用范圍。3、當0<Kd<1時，Ve=Vo+KdVi。表示內(nèi)體積只有一部分可被組分利用，擴散滲入，Vo即在Vo與Vo+Vi之間變化（圖4-1組分II）。4、有時Kd>1時，表示凝膠對

28、組分有吸附作用，此時Ve>Vo+Vi。例如一些芳香族化合物的洗脫體積遠超出理論計算的最大值，這些化合物的Kd>1。如苯丙氨酸，絡(luò)氨酸和色氨酸在Sephadx G-25中德Kd值分別為1.2，1.4和2.2。在實際工作中，對小分子物質(zhì)也得不到Kd=1的數(shù)值，特別是交聯(lián)度大的凝膠差別更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。這是由于一部分水相與凝膠結(jié)合較牢固，成為凝膠本身的一部分，因而不起作用，小分子不能擴散入內(nèi)所致。此時Vi即不能以g·WR計算，為此也常有直接用小分子物質(zhì)D2O，NaCl等通過凝膠柱而由實驗計算出Vi值的。另一個解決的辦法是不使用V

29、i與Kd，而用Kav（有效分配系數(shù)）代替Kd，其定義如下：已知 Kd= Ve-VoVi， Vt-Vo代替Vi，則：Kav=Ve-VoVt-Vo即 Va=Vo+Kav(Vt-Vo)在這里實際上將原來以水作為固定相（Vi）改為水與凝膠顆粒Vt-Vo作為固定相，而洗脫劑（Ve-Vo）作為流動相。Kav與Kd對交聯(lián)度小的凝膠差別較小，而對交聯(lián)度大的凝膠差別大。在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用時，當流動相流動Vt體積后，所有的組分都應(yīng)該被洗出來，只一點為凝膠層析法的特點，與一般層析方法不同。Ve與分子量的關(guān)系：對同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關(guān)，流過凝膠柱是，按分子量大小順序流出，分子量

30、大的走在前面。Ve與分子量的關(guān)系可用下式表示： Ve=K1-K2logMK1與K2為常數(shù)，M為分子數(shù)，Ve也可用Ve-Vo（分離體積）,Ve/Vo相對保留體積，Ve/Vt（簡化的洗脫體積,它受柱的填充情況的影響較?。┗騅av代替，與分子量的關(guān)系同上式，只是常數(shù)不同。通常多以Kav對分子量的對數(shù)作圖得一曲線，稱為“選擇曲線”如圖4-2所示。曲線的斜率是說明凝膠性質(zhì)的一個很重要的特征。在允許的工作范圍內(nèi)，曲線越陡，則分級愈好，而工作范圍愈窄。凝膠層析主要決定與溶質(zhì)分子的大小，每一類型的化合物如球蛋白類，右旋糖酐類等都有它自己的特殊的選擇曲線，可用以測定未知物的的分子量，測定時以便用曲線的直線部分為

31、宜。用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)的分子量，方法簡單，技術(shù)易掌握，樣品用量少，而且有時不需要純物質(zhì)，用一粗制品即可。例如在一粗酶制劑中，為了測定某一酶組分的分子量，只要測定脫洗液中具有該酶最大活性的部分，然后確定其洗脫體積，即可從標準曲線中查出其分子量。凝膠層析法測定分子量也有一定的局限性，在pH6-8的范圍內(nèi)，線性關(guān)系比較好，但在極端pH時，一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量超過5%時，測得分子量比真實的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等會與葡聚糖膠形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物與酶底物絡(luò)合物相似，因此在葡聚糖凝膠上層析時表現(xiàn)異常，用凝膠層析法所測分子量的結(jié)果，要和其他方法的測定相對照，由

32、此才可作出可靠的結(jié)論。圖4-2 球蛋白分子量“選擇曲線”凝膠層析技術(shù)操作方便，設(shè)備簡單，周期短，重復(fù)性能好，而且條件溫和，一般不引起生物活性物質(zhì)的變化，目前以得到相當廣泛的應(yīng)用，例如可用于脫鹽，濃縮高分子物質(zhì)的分子量。下面實驗是利用葡聚糖凝膠層析法測定蛋白質(zhì)的分子量。二、試劑和器材【試劑】1、 1、標準蛋白質(zhì)：藍色葡聚糖-2000（200KD），牛血清血蛋白（67KD），胃蛋白酶（36KD），CytC(13.7KD)等，均為分析純。2、 2、洗脫液：0.2mol/LTris-HCl-KCl，pH7.5取0.5M KCl 20ml，0.2M Tris 25ml，0.1M HCl 40.3ml，再

33、加H2O定容至100ml3、 3、Sephadex G-75（或G-100）?！酒鞑摹?、 1、層析柱：柱管1.2*50cm。2、 2、核酸蛋白檢測儀（或紫外分光光度計）。3、 3、部分收集器。4、 4、刻度試管。三、操作方法（一）凝膠柱的準備1、凝膠的選擇和處理1凝膠的選擇：凝膠型號很多。型號不同，篩分范圍亦不同。市售的Sephadex的分離范圍，常用高聚糖或球蛋白測定。Sephadex G型一般適宜于分離蛋白質(zhì)。如果用于分離核糖時，則限于其空間結(jié)構(gòu)和所帶基團的影響，選用高于它們分子量范圍的型號，或者選用適當型號的生物膠和Sephacryl。在去除蛋白質(zhì)溶液中的鹽類時，可選用凝膠Sephad

34、ex G-25.當溶液通過G-25柱時，蛋白質(zhì)被排阻在凝膠外面先流出來，而鹽類則擴散到凝膠網(wǎng)孔里后流出來，這樣就使蛋白質(zhì)得到純化。一般說來，在規(guī)定的篩分范圍內(nèi)，混合物之間量差別越大，分離效果越好。2凝膠的處理：葡聚糖凝膠是以干粉保存的，因此使用前必須將干凝膠浸泡于將要做洗脫劑的相同液體中，充分溶脹，然后才能使用。根據(jù)層析柱的體積和所選用的凝膠，膨脹后床體積，計算所需凝膠干粉的重量，將稱好的干粉傾入過量的洗脫液中，一般為水、鹽溶或緩沖液，放置在室溫，使之充分吸水溶脹。注意不要過分攪拌，以防顆粒破碎。浸泡時間根據(jù)凝膠交聯(lián)度不同而異。為了縮短溶脹時間，可以在沸水浴上加熱至將近100，這樣可大大縮短溶

35、脹時間至幾小時，而且還可殺死細菌和霉菌和排除凝膠內(nèi)部包藏著的氣泡。但是，必須避免置于酸或堿溶液中加熱。 凝膠顆粒最好大小比較均勻，這樣流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。如果顆粒大小不勻，可以在浸泡時用傾瀉法將不易沉下的較細的顆粒傾去。裝柱前最好將處理好的凝膠置真空干燥器中抽真空，以除盡凝膠中的空氣。2、凝膠柱的制備1柱的選擇：層析柱是所有層析方法的主要組成部分。因此，對層析柱（包括體積和長度等）選擇的合理與否，將直接影響分離效果。當用同樣直徑的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時，長層析柱比短的分辨率高；當用同樣長度的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時，層析柱直徑大的比小的分辨率高；當用同樣體積的層析柱分離兩種以上物質(zhì)時，仍

36、時層析柱長的比短的分辨率高。一般理想的層析柱之直徑和長度之比是1：25100。層析柱最好有架套，這樣溫度可以控制，得到的結(jié)果可以重復(fù)。2裝柱：層析柱必須粗細均勻，柱管大小可根據(jù)實際需要選擇。一般柱直徑（半徑）為1cm，如果樣品樣比較多，最好用直徑23cm柱。但若直徑太小時會發(fā)生“壁管效應(yīng)”，即在柱管中心部分組分移動較慢，而在管壁周圍移動較快，因而影響分離效果。一般說來，柱越長，分離效果愈好，但柱過長，實驗時間長，而且樣品稀釋度大，易擴散，分離效果反而不好。一般來說，用于脫鹽時，柱高50cm比較合適；在進行分級分離時，100cm高就已足夠。裝柱方法與一般柱層析法相似，柱管可用一般柱層析管，柱的下

37、端縮口，底部目前常用多孔的聚乙烯片做底板。底下用棉花或玻璃纖維填棄。如用燒結(jié)玻璃砂板做底，盡管用細孔的（3號），粗孔的則要在其上鋪一層濾紙或尼龍濾布。先加適量溶劑到柱內(nèi)，排走其中的空氣，然后把預(yù)先用溶劑浸泡好的凝膠攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱內(nèi)，待其自然沉降至柱高的1/41/3時，打開柱下端出口，讓溶劑慢慢流入，使柱上端懸浮液面緩慢下降至需要的高度。要注意顆粒間沒有夾雜氣泡，最好不用分次填裝法或稀的凝膠懸浮液裝柱。凝膠沉集后，將溶劑放出，再通過2-3倍柱床體積的溶劑使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防在加樣時凝膠被沖起來。3凝膠柱的鑒定：紅色葡聚糖或細胞色素C等配成2毫克/

38、毫升的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。如果凝膠是均勻的，沒有“紋路”、裂縫或氣泡，才可以使用，否則就必須重新裝柱。要注意在任何時候不要使液面低于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干，分離效果變壞，并有可能混有氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動。3、 加樣：加樣量與測定方法和層析柱大小有關(guān)。測定樣品含量的方法靈敏或床柱體積小時，加樣量可少。否則反之。例如，一般測定蛋白質(zhì)的含量多用紫外分光光度法。當采用280nm觀察消光讀數(shù)時，加樣量需5mg左右（柱體積2X60cm）；當采用220nm觀察消光讀數(shù)時，加樣量只需要1.2mg左右。加樣量掌握得當，可提高分離效果。一般來說，加樣量越少，或加樣體積越小（樣品濃度高）

39、，分辨率越高。但用于樣品的制備和脫鹽時，加樣量應(yīng)在不影響分辨率的前提下增大。此外，樣品的粘度也影響層析的分辨率，樣品的粘度大比小分辨率低。因此，一般使用的樣品粘度應(yīng)小于2，或者與洗脫液的粘度相當為宜。 加樣的方法與一般柱層析法相同，將柱中多余的液體放出后，將樣品溶液小心加到凝膠柱上，打開管夾，使樣品溶液流入柱內(nèi)。然后加入溶劑或鹽溶液洗脫。4、 洗脫：所有洗脫液均以能溶解洗脫物質(zhì)和不使其變性或失活為原則。洗脫用的液體應(yīng)與浸泡膨脹凝膠所用的液體相同，否則由于更換溶劑，凝膠體積發(fā)生變化而影響分離效果。洗脫所用的液體有水（多用于分離不帶電荷的中性物質(zhì)）及電解質(zhì)溶液（用于分離帶電基團的樣品），如酸、堿、

40、鹽的溶液及緩沖液等。對于吸附較強的組分，也有使用水與有機溶劑的混合液，中水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，如以此作為洗脫劑，可以減低吸附，將組分分洗下。洗脫時的流速要嚴格控制。否則收集的每一部分洗脫體積就不會恒定，理想的分配系數(shù)就難以測出?？刂屏魉俚淖詈醚b置是恒流泵，它不僅可以使流速恒定，而且還可以使其在較大范圍內(nèi)選擇。若無此裝置，可用控制操作壓的辦法進行。事實上，大多數(shù)實驗室是采用后一種方法進行控制流速的。流速在洗脫液加在柱上的壓力（因液面差造成）有關(guān)。凝膠層析與一般離子交換樹脂不同，加壓超過一個極限值，不僅不能增加速度，反而使流速急劇下降。流速對交聯(lián)度不同的凝膠是不同的。對交聯(lián)度大的凝膠（G

41、-10至G-50型），流速與柱的壓力差成正比，與柱長成反比，與柱的直徑無關(guān)。對交聯(lián)度小的凝膠（G-75至G-200型），流速與柱的直徑有關(guān)，并在一定的適宜操作壓差下有最大的流速。 流速亦受顆粒大小影響，顆粒大時流速較大，但流速大時洗脫峰形狀較寬，顆粒小時流速較慢，分離情況較好。在操作時應(yīng)根據(jù)實際需要，在不影響分離效果的情況下，盡可能使流速不致太慢，以免時間過長。5、 柱的重新填裝：由于在洗脫過程中，所有組分一般可全部自柱上洗下，所以裝好一次柱管之后，可以反復(fù)使用，無須特殊的“再生”處理。但由于在使用過程中，顆?？赡軡u漸沉積壓緊，因此在使用一段時間后，流速可能漸漸減低，使一次分析時間拖長很久，這

42、時需要將凝膠倒出，重新填裝，或者用反沖方法，使凝膠松動沖起，再行降沉。有時流速改變是由于柱頂上有灰塵集聚，則需將表面層除去。由于葡萄糖凝膠為糖類化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止發(fā)霉與生長細菌。一般可用0.02%的疊氮鈉（NaN3）溶液，它極易溶于水，不與蛋白質(zhì)和糖反應(yīng)，也不改變他們的層析效果。也可用0.002%的洗必泰（hibitane）溶液。在弱酸性溶液中可用0.05%（0.01-0.02%）三氯丁醇溶液，但它在強堿性溶液或加熱到60度以上時就要分解。在弱堿性溶液中也有用0.01%乙醇爾溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等為防腐劑，因為它們能引起凝膠顆粒的收縮，同時還能

43、進入層析儀器的塑料部件，使塑料變軟，造成不良后果。6、 凝膠的保存方法：凝膠用完后可用以下方法保存：(1)、膨脹狀態(tài)：即在水相中保存，可加入上述防腐劑，或加熱滅菌后于低溫保存。 （2）、半收縮狀態(tài)：用完后用水洗凈，然后再用60-70%乙醇洗，則凝膠體積縮小，于低溫保存。 （3）、干燥狀態(tài)：用水洗凈后，加入含乙醇的水洗，并逐漸加大含醇量，最后用95%乙醇洗，則凝膠水收縮，再用乙醚洗去乙醇，抽慮至干，于60-80度干燥后保存。這三種方法中，以干燥狀態(tài)保存為最好。（二）用葡萄糖凝膠層分析法測定蛋白質(zhì)的分子量：凝膠層析的操作方法如上所述。測定蛋白質(zhì)的分子量根據(jù)需要可選用Sephadex G-75,G-

44、100或G-150型凝膠凝膠顆粒一般在40-120微米，柱管選用直徑1.0-1.3cm，高90-100cm。1、 標準曲線的制定：層析柱用1.2X100cm，凝膠用Sephadex G-75（或G-100）。 1蛋白質(zhì)標準樣品混合液：分別稱取4mg藍色葡萄糖-2000（分子量200，000）、牛血清蛋白（分子量67，000），胃蛋白酶（分子量36，000），Cytc（分子量：13，700）共同溶于2mlPH7.5 0.025mol/L Tris-HCl緩沖液中。 2上柱和脫洗：將標準樣品混合液上柱，然后用PH7.5 0.025mol/L Tris-HCl溶液洗脫。流速45d/min,2ml/管

45、，用部分收集器收集，紫外檢測儀280nm處檢測?；蚴占笥米贤夥止夤舛扔嬘?80nm處測定每管OD值，以管號（或洗脫體積）為橫坐標，OD值為縱坐標繪出洗脫曲線。根據(jù)洗脫峰位置量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積（Ve）。然后以蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)（1gM）為橫坐標，Ve為縱坐標，作出標準曲線。為了結(jié)果可靠，應(yīng)以同樣條件重復(fù)1-2次，取Ve的平均值作圖。2、 未知數(shù)品分子量的測定：完全按照標準曲線的條件操作，根據(jù)紫外檢測的洗脫峰位置，測出洗脫體積。重復(fù)測定1-2次，取平均值，由標準曲線可查得樣品的分子量。實驗三 納米磁珠法小規(guī)模提取質(zhì)粒DNA及其純度鑒定1、 原理 質(zhì)粒（plasmid）是目前最常見的基因克隆

46、的載體分子。細菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1Kb至200Kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在與細胞質(zhì)中、獨立于細胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂遺傳到后代。堿裂解法是通常的質(zhì)粒DNA的提取方法。SDS和NaOH是堿裂解法的主要試劑。SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能裂解細菌細胞，又能使細菌蛋白質(zhì)變性。所以，SDS處理細菌細胞后會導(dǎo)致細菌細胞壁破裂，從而使質(zhì)粒DNA及細菌基因組DNA由于分子較大在短時間內(nèi)難以復(fù)性，會跟變性的蛋白質(zhì)及細胞破碎片形成白色的團聚物。經(jīng)

47、離心后，變性蛋白質(zhì)、染色體DNA及細胞破碎片沉淀到離心管的底部，而質(zhì)粒DNA將留在上清液中，通過這種方法即可得到質(zhì)粒DNA的粗提液。含質(zhì)粒DNA的粗提液一般來說不能直接提供酶切、轉(zhuǎn)化、測序和PCR等分子生物學(xué)應(yīng)用，而需經(jīng)進一步純化。傳統(tǒng)的苯酚/氯仿抽提法及當今廣泛應(yīng)用的試劑盒法（DNA可逆吸附到silica上）都可以除去里面大部分殘存的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到相對純度較高的質(zhì)粒DNA。但這些方法往往使用有毒試劑，且對離心機的依賴程度較高，費時，費力且不利于節(jié)約成本?；炯{米磁性粒子的磁性分離技術(shù)與之相比具有較大的優(yōu)勢。通過將SiO2包覆到納米磁球Fe3O4在的表面，得到表面富含羥基的Fe3O4/Si

48、O2復(fù)合納米磁珠，可作為酶固定化、核酸分離純化等生物學(xué)應(yīng)用的載體。在高鹽低PH值條件下，DNA可大量結(jié)合到Fe3O4/SiO2表面，而且低鹽高PH值下DNA又可被洗脫下來，利用外界磁場的控制，可直接將DNA從成分復(fù)雜的混合物中提取出來。該法提取純度高，避免了使用氯仿、苯酚等有毒試劑，從菌體收集到質(zhì)粒DNA的獲得僅需要兩步離心，而且后期操作可在一個離心管中完成，提取過程更加方便快捷。磁性分離技術(shù)近年被廣泛應(yīng)用于各種生物大分子的提取，特別是核酸的高通量、自動化提取方面。為了得到純的DNA制品，可用適量DNase處理提取液，以降解RNA。同時為了防止提取過程中DNA被細胞中釋放的DNase降解，要用

49、EDTA-2Na抑制DNase的活性，同時整個操作盡可能在較低溫度下進行。提取的DNA是否純凈，是否是雙鏈、高分子化合物，一般通過自外吸收、化學(xué)測定和Tm測定等方面的鑒定，本實驗僅采用紫外吸收法。二、材料和試劑菌種：含質(zhì)粒的E.coli DH5。SolutionI:PH=8.0, 50mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L EDTA ,用時補加RNase使其終濃度為1mg/ml。SolutionII:200mmol/L NaOH,1%SDS。SolutionIII:4.0mmol/L鹽酸胍，0.75mol/L KAC,用冰醋酸將PH調(diào)至4.0。洗清液：70%乙醇；洗脫液（TE）：1

50、0mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA, PH=8.0的TE溶液。20mg/mlFe3O4/SiO2納米磁珠。三、試驗器材1、離心機2、八孔磁架3、紫外分光光度計4、DNA電泳裝置5、10ul 200ul 1000ul 移液槍6、1.5ml 離心管4、 操作步驟1、 取1.5ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液于離心管中，1200r/m離心60s。棄上清，將離心管倒置，盡量去除液體。2、 向離心管中加入250ul SolutionI,用移液槍吹打，使菌體分散均勻。3、 向菌懸液中加入250ul SolutionII,蓋緊管口，溫和顛倒4-5次。靜置2min。4、 加入350ul Solu

51、tionIII,快速溫和顛倒數(shù)次，此時可見白色絮狀沉淀出現(xiàn)，靜置2min后，120000r/m離心5min。5、 將上清液轉(zhuǎn)移到另一只離心管中，注意不要將白色絮狀沉淀移走。6、 加入Fe3O4/SiO2磁珠50ul，用移液器吹打混勻，室溫靜置5min。7、 將離心管置于磁性分離架上，磁分離1min，棄上清。8、 向固定于磁性分離架上的離心管緩慢加入800ul清洗液，注意不要觸動磁珠。靜置1min，棄上清。9、 靜置3min，待乙醇揮發(fā)完畢。10、 將離心管從磁架取出，加入50ul TE，并用移液器吹打磁珠混勻，靜置5min。11、 將離心管置于磁架上，磁性分離。將上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，此

52、時所得的無色透明液體即為DNA溶液。12、 取質(zhì)粒DNA溶液20ul，稀釋200倍，用紫外分光光度計測定質(zhì)粒DNA的在260nm和280nm下的吸收OD260，OD280。DNA濃度（ug/ml）=A260 X稀釋倍數(shù)/0.020 X L （L為比色杯厚度，一般為1；0.020為每毫升溶液內(nèi)含1ug DNA鈉鹽時的光密度；A260為260nm波長處光密度讀數(shù)）。13、 取質(zhì)粒DNA溶液5ul加上樣緩沖液，瓊脂糖凝膠電泳。實驗四 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳 1、 原理2、 核酸具有兩性解離物質(zhì)，一般在PH8.0左右條件下電泳時相正極移動。根據(jù)核酸片段所帶電荷多少、片段的大小及構(gòu)型和差異，可以用電泳法進行分離。電泳所用的凝膠主要是聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠兩種