流程——永諾生物

1、6張膠1. 蛋白質(zhì)樣品的CyDye熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記使用CyDye DIGE Flour（minimal Dye）Labelling Kit進(jìn)行，所有涉及Dye的操作在避光條件下進(jìn)行。1） 取出20保存的CyDye試劑盒，室溫放置58分鐘以防開蓋時凝露，12000g離心1分鐘；2） 按照試劑盒說明：每個原始包裝管中各有5nmol的粉狀Dye，加入5l無水DMF后震蕩30秒、12000g離心30秒，即成1nmol/l的dye stock solution；3） 按照CyDye最小標(biāo)記法原則，即400pmol的Dye可以標(biāo)記50g的蛋白，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)計(jì)算出所需各種Dye的總量（Cy2、Cy3、Cy5

2、各需2.4nmol）；4） 以dye stock solution : 無水DMF2 : 3的比例，將dye stock solution稀釋成working dye solution (400pmol/l)，即working dye solution 2.4ul加入無水DMF 3.6l，震蕩30秒、12000g離心30秒；（注意：各種dye的stock solution和working solution未用完者必須密封后儲存于20，stock solution最多可保存兩個月，working solution配制好后必須在兩周內(nèi)用完。）；5） 在每個準(zhǔn)備進(jìn)行標(biāo)記的樣品管中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入1

3、l Cy3或Cy5的working dye solution，在pool管中加入6l的Cy2 working dye solution，將所有樣品管震蕩30秒、12000g離心30秒；6） 熒光標(biāo)記反應(yīng)在冰浴、避光條件下進(jìn)行30分鐘；7） 在每個樣品管中加入1l Lysine solution，在pool管中加入6l Lysine solution，震蕩30秒、12000g離心30秒后，在冰浴中避光靜置10分鐘以終止標(biāo)記反應(yīng)；8） 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，先將標(biāo)記好的各個樣品混合，然后在每個混合的樣品中加入50g Cy2標(biāo)記的pool樣品，震蕩30秒、12000g離心30秒后80凍存或直接進(jìn)行雙向電泳；

4、 2-DE和2D-DIGE的第一向等電聚焦電泳（IEF）準(zhǔn)備1） IPG膠條的選擇：根據(jù)先期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇pH47，24cm的IPG膠條對樣品的蛋白質(zhì)進(jìn)行等電聚焦分離；2） 準(zhǔn)備各種用于不同檢測手段的足量蛋白質(zhì)樣品：Deep purple染色：500g/樣品（按前述熒光標(biāo)記準(zhǔn)備中的pool樣品）2D-DIGE熒光檢測：150g/樣品（Cy2、Cy3、Cy5標(biāo)記的混合樣品）3） 配制Rehydration buffer：每100ul的Rehydration stock buffer中加入DTT 2.8mg、IPG buffer（pH4-7）2.3l、Bromophenol blue so

5、lution (1%) 0.92l（用于2D-DIGE時IPG buffer用量為4.6l）；4） 在每個樣品管中加入Rehydration buffer 100l；5） 使用Rehydration stock buffer將每個樣品的體積補(bǔ)足至460l，這樣每460ul樣品中就含有DTT 2.8mg、IPG buffer 0.5%（用于2D-DIGE時為1%）、Bromophenol blue 0.002%，達(dá)到進(jìn)行IEF的要求；6） 所有樣品管使用12000g離心8分鐘以沉淀可能存在的不溶物，取450l準(zhǔn)備IEF上樣。 第一向IEF（使用再水化上樣法）1） 檢查等電聚焦儀狀況，準(zhǔn)備潔凈的膠

6、條槽（IPG strip holder）以及膠條覆蓋液（IPG strip cover fluid）；2） 將上述制備的含蛋白質(zhì)樣品的450l Rehydration buffer均勻的涂布在膠條槽兩電極之間，避免產(chǎn)生間斷和氣泡；3） 取出20保存的IPG干膠條（IPG strip pH4-7），使用鑷子從正極（酸性端）開始小心的撕掉保護(hù)膜，將IPG膠條的膠面向下，并將其正極端頂至膠條槽正極端，緩緩的把整個膠條放入膠條槽中，檢查樣品溶液在膠下是否均勻及有無氣泡；4） 每個IPG膠條上均勻覆蓋1ml左右的IPG strip cover fluid以防電泳時水分蒸發(fā)；5） 蓋上膠條槽蓋，再次檢查上

7、樣情況，并核對樣品與相應(yīng)的IPG膠條編號，（對熒光標(biāo)記樣品的IEF需要加避光罩進(jìn)行）；6） IEF程序設(shè)置： Current: 50A/stripStep 1: 30V, 12h, step-n-holdStep 2: 500V, 1h, step-n-holdStep 3: 1000V, 1h, step-n-holdStep 4: 8000V, 12h, step-n-holdTotal: 85000Vh7） IEF完成后， IPG膠條80凍存或直接進(jìn)行第二向電泳；8） 及時清洗膠條槽以免殘留蛋白質(zhì)附著于槽內(nèi)影響后續(xù)使用。 2-DE和2D-DIGE第二向SDS-PAGE的凝膠制備1） 準(zhǔn)備

8、潔凈的玻璃板（2D-DIGE使用特制的低熒光玻璃板）、灌膠槽、隔板、無塵擦拭紙，Bind-Silane solution等試劑；2） 如需進(jìn)行后續(xù)Spot handling workstation處理的凝膠，其玻璃背板需要進(jìn)行硅烷化處理，使凝膠粘附在玻璃背板上，過程如下： 在玻璃背板內(nèi)面粘貼workstation識別凝膠的圓點(diǎn)內(nèi)標(biāo)（Internal Reference，IR） 使用無塵擦拭紙蘸少許無水乙醇，徹底擦拭玻璃背板； 待乙醇揮發(fā)后，取Bind-Silane solution 3.5ml均勻涂布在背板上； 涂好的背板在通風(fēng)柜中靜置1.5 2小時待其徹底干燥； 使用超純水微微濕潤的無塵擦拭

9、紙，輕輕擦拭玻璃背板以去除可能存在的塵屑等； 待水分徹底干燥后，將背板和前板對齊裝好。3） 將玻璃板、隔板依次放進(jìn)灌膠槽，安裝好堵漏、固定螺絲等以確保不會發(fā)生滲漏，將灌膠槽放置水平面上等待灌膠；4） 進(jìn)行雙向電泳，常規(guī)選擇12.5%的SDS-PAGE膠，按照前述配方首先將Monomer stock solution、Tris-HCl、SDS、Milli-Q水混合，避光條件下在磁力攪拌器上邊攪拌邊使用負(fù)壓抽氣15分鐘，再加入APS和TEMED攪拌混勻；5） 將混合均勻的凝膠溶液緩緩注入灌膠槽，液面高度至玻璃前板上緣，避免產(chǎn)生氣泡；6） 在膠液面上緩緩加入水飽和正丁醇（Water saturate

10、d butanol）將膠面壓平，灌好的凝膠在室溫靜置10 12個小時待其充分聚合；7） 為慎重起見，進(jìn)行第二向電泳前，先觀察凝膠是否聚合均勻、膠面是否平整、有無氣泡等，再開始準(zhǔn)備下一步實(shí)驗(yàn)。 IPG膠條的平衡1） 分別配制每10ml含有DTT 100mg或IAA 250mg的SDS equilibration buffer；2） 第一步平衡，在每個裝IPG膠條的平衡管中加入10ml含DTT的SDS equilibration buffer，在軌道搖床上緩慢搖動平衡15 min；3） 第二步平衡，在每個裝IPG膠條的平衡管中加入10ml含IAA的SDS equilibration buffer，

11、在軌道搖床上緩慢搖動平衡15 min。 2-DE和2D-DIGE的第二向SDS-PAGE1） 配制SDS-PAGE電泳緩沖液：上槽 (cathode)：SDS electrophoresis buffer (10×) 160ml稀釋至800ml，下槽 (anode)：SDS electrophoresis buffer (10×) 455ml稀釋至4550ml；2） 使用上槽電泳緩沖液配制瓊脂糖封膠液（Agarose sealant、Upper chamber agarose sealant）并加熱熔解；3） 用純水清洗掉SDS-PAGE凝膠玻璃板上的碎膠和膠面上的水飽和正

12、丁醇，加入上槽電泳緩沖液以平衡膠面；4） 準(zhǔn)備4mm×8mm大小的濾紙片，在上面滴加標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker 10l和Upper chamber agarose sealant 10l后備用；5） 首先將下槽電泳緩沖液約3500ml倒入電泳槽，打開電泳液循環(huán)泵和水浴循環(huán)泵，將水浴循環(huán)溫度設(shè)置為10。6） 倒去SDS-PAGE凝膠面上的電泳緩沖液，用濾紙徹底吸干，將溫?zé)岬腁garose sealant注入膠面上緣空隙直至填滿；7） 平衡好的IPG膠條在上槽電泳緩沖液中略微漂洗一下，剪去兩端多余的支持膜，在無塵擦拭紙上沾去多余緩沖液后，水平放置在SDS-PAGE凝膠上緣并貼緊玻璃背板，用潔

13、凈的尺子將膠條壓入Agarose sealant，使IPG膠條水平的附在SDS-PAGE凝膠上緣，如有氣泡需擠出；8） 在IPG膠條旁插入帶有標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker的濾紙片后，再次用溫?zé)岬腁garose sealant將膠面上緣因放置IPG膠條而產(chǎn)生的空隙填滿；9） 將放置好IPG膠條的SDS-PAGE凝膠板依次插入電泳槽，待Agarose sealant冷卻凝固后，將上槽（Upper chamber）濕潤后水平的壓進(jìn)電泳槽內(nèi)；10） 用Upper chamber agarose sealant將上槽與凝膠板的接縫處填充，待凝固后即可較好的防止上、下槽間的滲漏；11） 緩緩加入少量上槽電泳緩沖

14、液，確認(rèn)無滲漏后，分別加入剩余的上、下槽緩沖液，使上、下槽緩沖液處于電泳槽標(biāo)定刻度間的同一水平面；12） 接好電泳槽電極，檢查無誤后打開電泳儀電源，SDS-PAGE程序設(shè)置：第一步：2W/gel，50分鐘，第二步：17W/gel，直至膠內(nèi)電泳指示劑（Bromophenol blue）跑出凝膠下緣；（注：2D-DIGE凝膠的電泳在避光條件下進(jìn)行）13） 二向電泳結(jié)束后，小心的從電泳槽中取出凝膠板，標(biāo)記和記錄與IPG條相應(yīng)的二向膠樣品編號，需進(jìn)行染色的凝膠使用專用的尺子將玻璃前板撬開、移去，純水沖洗掉膠面殘留的電泳緩沖液和碎膠后，立即使用染色的固定步驟固定凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)；14） 2D-DIGE

15、結(jié)束后無需撬開玻璃板，僅沖洗掉板表面的電泳緩沖液即可，盡可能馬上進(jìn)行圖像掃描，若無法立即掃描需將玻璃板密封后4儲存以盡量減緩蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在膠內(nèi)的擴(kuò)散。2.4 2-DE凝膠的檢測和圖像獲取 試劑及耗材硝酸銀（AgNO3）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、碳酸鈉（Na2CO3）、碳酸氫鈉（NaHCO3）購自美國Sigma公司，磷酸（H3PO4）、冰醋酸（Glacial acetic acid）購自德國Merck公司，甲醇（Methanol）為美國Fisher公司產(chǎn)品，深紫熒光染料（Deep purple）為瑞典Amersham Bioscience公司產(chǎn)品。 儀器、設(shè)備及軟件Typhoon9400型多

16、功能激光掃描儀及附件，ImageQuant TL V2003.3軟件（瑞典 Amersham Biosciences）；標(biāo)準(zhǔn)灰度尺（美國 Kodak）；其余儀器、設(shè)備同前。 2-DE凝膠的深紫（Deep Purple）熒光染色1） 固定：凝膠在固定液（Methanol 10%，Glacial acetic acid 7.5%）中固定過夜；2） 漂洗：凝膠在漂洗液1（NaHCO3 35mM，Na2CO3 300mM）中漂洗30分鐘；3） 染色：凝膠在染色液（Deep Purple 0.5%）中避光染色1小時；4） 漂洗：凝膠在漂洗液2（Glacial acetic acid 7.5%）中避光漂洗

17、2次，每次15分鐘；5） 凝膠可在漂洗液2中，4條件下避光儲存。1） 圖像旋轉(zhuǎn)：按常規(guī)要求，如圖2-1，雙向電泳圖像的左上方為低pH值、高分子量，右下方為高pH值、低分子量；.4.7 DIGE凝膠、Deep Purple熒光染色凝膠的掃描1） 使用純水、30%乙醇和無塵擦拭紙清潔Typhoon9400型多功能激光掃描儀的掃描平面；2） 將DALT six專用導(dǎo)向支架放入掃描平面，凝膠板固定在兩個支架之間，熒光染色凝膠（去掉玻璃前板）的放置方法同考染圖像掃描的凝膠放置方法；3） 打開掃描儀預(yù)熱30分鐘，啟動掃描控制軟件（Typhoon Scanner Control V5.0）；4） DIGE、

18、Deep Purple熒光染色凝膠的掃描參數(shù)設(shè)置：圖像獲取模式（Acquisition Mode）：熒光（Fluorescence）設(shè)置（Setup ）：Cy2：Blue laser（488nm），Emission Filter：520BPCy3：Green laser（532nm），Emission Filter：580BPCy5：Red laser（633nm），Emission Filter：670BPPurple：Green laser（532nm），Emission Filter：610BP初始光電倍增管電壓（PMT）均設(shè)置為450，Tray：DIGE Ettan DALT，Pixe

19、l Size：預(yù)覽時采用500microns，圖像獲取時采用100microns；5） DIGE凝膠掃描時，須選擇聚焦平面（Focal Plane）+3mm，并選取DIGE file Naming Format；6） 熒光圖像掃描獲取后，使用ImageQuant軟件檢測凝膠圖像的信號最大強(qiáng)度（Max intensity），按照圖像分析要求：信號最大強(qiáng)度值處在60000 90000之間的圖像才能進(jìn)行相對精確的定量分析，因此需不斷調(diào)整PMT值重復(fù)進(jìn)行掃描，直至所有凝膠圖像的檢測值符合該要求為止；7） 圖像的同步裁切：使用ImageQuant軟件的同步裁切功能去掉所有原始掃描圖像中的玻璃板邊框等圖譜

20、分析干擾因素，僅保存凝膠圖譜區(qū)域。2.5 2-DE、DIGE凝膠圖譜的分析 2D-DIGE和Deep purple熒光染色凝膠圖譜的DeCyder V6.0軟件分析1） 啟動DeCyder軟件，首先打開圖像導(dǎo)入（Image Loader）模塊，建立新項(xiàng)目名稱，將所有凝膠圖像導(dǎo)入軟件的內(nèi)建數(shù)據(jù)庫；2） 打開批處理（Batch Processor）模塊，命名新的批處理名稱，將導(dǎo)入的凝膠圖像添加至batch中，設(shè)置估計(jì)斑點(diǎn)數(shù)目（Estimated no. of spots）為3000，并選擇Include in BVA batch list選項(xiàng)；3） 在生物學(xué)變化項(xiàng)目設(shè)置（BVA item sett

21、ings）中，建立Standard、25K和5K三個文件夾，將凝膠圖像分別添加至Standard（Cy2標(biāo)記）、25K（Cy3或Cy5標(biāo)記的25K處理組圖像）和5K（Cy3或Cy5標(biāo)記的5K處理組圖像）文件夾中；4） 運(yùn)行Batch Processor程序，軟件將自動完成對凝膠圖像斑點(diǎn)的識別，并進(jìn)行DIA和BVA的初步分析，保存結(jié)果后退出Batch Processor模塊；5） 啟動膠內(nèi)差異分析（Differential In-gel Analysis, DIA）模塊，對每一個凝膠圖譜的膠內(nèi)差異圖譜進(jìn)行分析，對斑點(diǎn)的Max slope和Area值進(jìn)行排序，分析并排除圖譜內(nèi)由于凝膠制備或電泳過程

22、中產(chǎn)生的干擾因素如顆粒污染等； 6） 打開生物學(xué)變化分析（Biological Variation Analysis, BVA）模塊，首先將所有圖譜與Master gel的圖譜進(jìn)行分析，糾正Batch Processor過程中可能出現(xiàn)的錯誤匹配的斑點(diǎn)；7） 在蛋白質(zhì)統(tǒng)計(jì)（Protein Statistics）選項(xiàng)中設(shè)定比較25K和5K處理組的差異，進(jìn)行Students T-test，使軟件重新計(jì)算所有蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的平均變化比值（Average Ratio）并對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；8） 在Protein table中選取Average Ratio大于1.5倍的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，對統(tǒng)計(jì)分析有意義的斑點(diǎn)進(jìn)行逐一分析并確認(rèn)，對需要進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)標(biāo)記為Pick；9） 在同步匹配的Deep purple染色的制備膠圖譜上標(biāo)明全自動斑點(diǎn)處理工作站識別凝膠斑點(diǎn)坐標(biāo)的Picking Reference（Internal Reference，IR），導(dǎo)出Pick List。2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 蛋白質(zhì)濃度測定1） 先后收集三批培養(yǎng)在10cm培養(yǎng)皿中的神經(jīng)元總蛋白，經(jīng)蛋白質(zhì)純化后進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，根據(jù)對標(biāo)準(zhǔn)蛋白對照的吸光度值測定，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2-2所示。2） 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（ABS = 8.028 × g +