漢防己生物堿的提取

1、漢防己生物堿的提取、分離與鑒定漢防己為防己科千金藤屬物StephaniatetrandraS.Mcore的根，是祛風(fēng)解熱鎮(zhèn)痛藥物，其有效成分為生物堿。主要是漢防己甲素和漢防已乙素。臨床上除用作治療高血壓、神經(jīng)性疼痛、抗阿米巴原蟲(chóng)外，還將粉防已生物堿的碘甲基、或澳甲基化合物作為肌肉松弛劑應(yīng)用，此外漢防已甲素在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有抗癌和擴(kuò)張血管的作用。一、目的要求通過(guò)漢防己中幾種生物堿的提取分離和鑒定，要求掌握下列知識(shí)和技能。1 .生物堿的一般提取方法。2 .純化單體的方法及薄層層析鑒定二、已知生物堿的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)漢防已根中總生物堿含量為1.52.3%,主要為漢防已甲素，含量約1%,漢防已乙素，含量約0.5

2、%;輪環(huán)藤酚堿，含量為0.2%;以及其它數(shù)種微量生物堿。1 .漢防已甲素（Tetrandrine,漢防已堿，粉防已堿）無(wú)色針晶，不溶于水和石油醍，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醍和氯仿等有機(jī)溶劑及稀酸水中，可溶于苯，mp216C,有雙熔點(diǎn)現(xiàn)象，自丙酮中結(jié)晶者，150c左右熔后加熱又固化，至213c復(fù)熔。CH3R=CH3漢防己甲素R=H漢防己乙素2 .漢防已乙素（Fangchinoline,又稱防已諾林堿，去甲粉防已堿）溶解行為與漢防已甲素相似，因有一個(gè)酚羥基，故極性較漢防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于漢防已甲素而在乙醇中又大于漢防已甲素。籍此可以相互分離，用不同溶劑重結(jié)昌時(shí)，其晶形和溶點(diǎn)不同:

3、乙醇細(xì)棒狀結(jié)晶mp24540c甲醇細(xì)棒狀結(jié)晶mp1779c丙酮六面粒狀晶mp134c口比咤-甲醇mp1212c環(huán)已烷-EtocAcmp156c3 .輪環(huán)藤酚堿(Cylanoline)為水溶性季俊生物堿，不溶于極性溶劑，氯化物為無(wú)色，八面體狀結(jié)昌，mp2146C,碘化物為無(wú)色絹絲狀結(jié)晶，mp185C；苦味酸鹽為黃色結(jié)晶，mp1546Co實(shí)驗(yàn)原理：漢防已根中總生物堿含量為1.52.3%,主要為漢防已甲素，含量約1%,漢防已乙素，含量約0.5%;輪環(huán)藤酚堿，含量為0.2%;以及其它數(shù)種微量生物堿。漢防已甲素(Tetrandrine,漢防已堿，粉防已堿)無(wú)色針晶，不溶于水和石油醒，易溶于乙醇、丙酮、乙

4、酸乙酯、乙醛和氯仿等有機(jī)溶劑及稀酸水中，可溶于苯。漢防已乙素(Fangchinoline,又稱防已諾林堿，去甲粉防已堿)因有一個(gè)酚羥基，故極性較漢防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于漢防已甲素而在乙醇中又大于漢防已甲素。籍此可以相互分離。輪環(huán)藤酚堿(Cylanoline)為水溶性季俊生物堿，不溶于極性溶劑，氯化物為無(wú)色，八面體狀結(jié)進(jìn)晶，mp2146C,碘化物為無(wú)色絹絲狀結(jié)晶，mp185C；苦味酸鹽為黃色結(jié)晶，mp1546C。據(jù)這些堿溶解度差異即可進(jìn)行分離。漢防己生物堿的提取、分離與鑒定實(shí)驗(yàn)四生物堿的預(yù)試實(shí)驗(yàn)及總堿的提取實(shí)驗(yàn)五漢防己甲素、乙素分離實(shí)驗(yàn)六漢防已甲素、乙素的鑒定實(shí)驗(yàn)四生物堿的預(yù)試實(shí)驗(yàn)及總

5、堿的提取實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握生物堿的一般提取方法；2、掌握從總生物堿中分離、純化親脂性總堿的方法；3、鞏固硅膠TLC板的制備方法。實(shí)驗(yàn)原理利用生物堿及其鹽的溶解性提取親脂性生物堿，再利用其極性大小同進(jìn)行分離。本次實(shí)驗(yàn)所需儀器：電子分析天平；研缽；燒杯；漏斗；恒溫水浴箱；PH試紙；250ml圓底燒瓶；球行（回流）、直行冷凝管（蒸儲(chǔ)）；空心塞；空心玻管；橡皮套；蒸儲(chǔ)頭；真空接受管；彎玻管；緩沖瓶（抽濾瓶）；真空泵；耐壓橡皮管；蒸發(fā)皿。試劑：漢防己；10涮酸；碘化汞鉀；碘化鈾鉀；碘化碘鉀；硅鴇酸；85*醇實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 .系統(tǒng)預(yù)試1 .記錄待預(yù)試藥物的學(xué)名、植物來(lái)源、藥用部分及其特征（熔點(diǎn)、沸點(diǎn)和折光率）。

6、2 .檢品溶液的制備：將檢品先剪切成碎塊然后用研缽研成粉末。取檢品粉末2g,加蒸儲(chǔ)水20ml,加10%鹽酸至pH<3,在60c左右的水浴上加熱15分鐘，冷卻過(guò)濾，濾液供作以下實(shí)驗(yàn)。3 .初步鑒別：碘化汞鉀試劑取檢品液1ml,滴加2滴碘化汞鉀試劑，觀察有無(wú)白色沉淀產(chǎn)生。碘化鈿鉀試劑取檢品液1ml,滴加2滴碘化鈿鉀試劑，觀察有無(wú)橘紅色或紅棕色沉淀產(chǎn)生。碘化碘鉀試劑取檢品液1ml,滴加2滴碘化碘鉀試劑，觀察有無(wú)棕色沉淀產(chǎn)生。硅鴇酸試劑取檢品液1ml,滴加2滴硅鴇酸試劑，觀察有無(wú)淡黃色或白色沉淀產(chǎn)生。2 .漢防己總生物堿的提?。海ㄝ腿》ǎ┓Q取50g漢防己粗粉置于250ml圓底燒瓶中，分別用85%

7、乙醇150ml、100ml、100ml回流提取，分別提取1.5、1、1小時(shí)（或每次2小時(shí)），每次提取后，傾斜倒出乙醇提取液，合并乙醇提取液，過(guò)濾，得乙醇提取液。將濾液減壓濃縮至小體積移至蒸發(fā)皿水浴濃縮至無(wú)醇味，得總提取物（糖漿狀）。3、薄層板制備除另有規(guī)定外，將吸附劑1份和水3份在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布器進(jìn)行涂布（厚度為0.250.5mm），取下涂好薄層的玻板，于室溫下，置水平臺(tái)上晾干，在反射光及透射光下檢視，表面應(yīng)均勻，平整，無(wú)麻點(diǎn)、無(wú)氣泡、無(wú)破損及污染，于110c烘30分鐘，冷卻后立即使用或置干燥箱中備用。注意：1.藥材的量為燒瓶容量

8、的1/31/2,再加溶劑使其浸過(guò)藥面12cm。2.欲蒸儲(chǔ)液裝至燒瓶體積的1/22/3,應(yīng)加入沸石。減壓蒸儲(chǔ)操作注意事項(xiàng)見(jiàn)書(shū)。實(shí)驗(yàn)五漢防己甲素、乙素分離實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握生物堿的一般提取方法；2、掌握從總生物堿中分離、純化親脂性總堿的方法；實(shí)驗(yàn)原理1、利用生物堿及其鹽的溶解性提取親脂性生物堿，再利用其極性大小同進(jìn)行分離。2、利用甲素、乙素極性不同，在不同溶劑中溶解度不同進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)所需儀器：大燒杯；抽濾瓶；布氏漏斗；250ml分液漏斗；鐵架臺(tái)；鐵圈；減壓回收溶劑一整套裝置；錐形瓶。實(shí)驗(yàn)所需試劑：1%鹽酸；濃氨水；氯仿；1%氫氧化鈉水溶液；無(wú)水硫酸鈉；甲苯；丙酮。1 .親脂性叔胺生物堿和水溶性季胺

9、生物堿的分離：將乙醇提取物轉(zhuǎn)移至大燒杯中，后逐漸加入80ml1%鹽酸分三次溶解，在攪拌下50c水浴中攪拌促溶，（生物堿成鹽溶于水，酸性不溶物下沉，加酸至溶液不再產(chǎn)生沉淀且溶液呈明顯的酸性為止）抽濾除去樹(shù)脂物，沉淀以1%鹽酸少量洗滌數(shù)次，棄去沉淀。方法一：合并濾液和洗滌液，用濃氨水調(diào)至pH9,這時(shí)難溶的游離親脂性叔胺堿析出，將此溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用環(huán)己烷-乙酸乙酯（25:75）30ml萃取，再以每次10ml同樣的萃取劑萃取，直至取1ml萃取液，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水，蒸干，用1ml5%鹽酸溶解殘留物，加12滴碘化鈿鉀試劑無(wú)明顯沉淀為止。合并萃取液，以適量無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸儲(chǔ)回收溶劑，即得親

10、脂性叔胺總堿方法二：合并濾液和洗滌液，轉(zhuǎn)移至250ml的分液漏斗中，再加入30ml氯仿，滴加濃氨水至pH值9-10后輕輕振搖萃取，分取氯仿層，再以每次10ml氯仿萃取，合并氯仿液，氯仿液即含有親脂性叔胺總堿。2 .漢防己甲素、乙素分離：（冷甲苯法）將親脂性總堿稱重后，置25ml錐形瓶中，加5倍量甲苯，攪拌促溶至不溶物量不再減少，過(guò)濾，用少量甲苯洗滌不溶物后，合并甲苯溶液，并蒸儲(chǔ)濃縮至干，殘留物用丙酮重結(jié)晶，得細(xì)棒狀晶體I（漢防己甲素），甲苯不溶物用丙酮重結(jié)晶后，得顆粒狀晶體R（漢防己乙素）實(shí)驗(yàn)六：漢防已甲素、乙素的鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握TLC在生物堿鑒定中的應(yīng)用；2、掌握從總生物堿中分離、純化親

11、脂性總堿的方法；實(shí)驗(yàn)原理利用漢防已甲素、乙素在TLC中的色譜行為不同時(shí)行分離鑒定。實(shí)驗(yàn)所需儀器：b形管；溫度計(jì)；橡皮圈；塞子；毛細(xì)管；酒精燈；玻板；涂布器；點(diǎn)樣器；薄層缸；顯色噴霧器實(shí)驗(yàn)所需試劑：硅油；硅膠G;0.45CMC;環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺；改良的碘化鈿鉀試劑實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：（一）測(cè)定熔點(diǎn)（選做）漢防己甲素的熔點(diǎn)：216217漢防己乙素的熔點(diǎn)：134136取供試品適量，研成細(xì)粉，除另有規(guī)定外，應(yīng)按照各藥品項(xiàng)下干燥失重的條件進(jìn)行干燥。若該藥品為不檢查干燥失重、熔點(diǎn)范圍低限在135c以上、受熱不分解的供試品，可采用105c干燥；熔點(diǎn)在135c以下或受熱分解的供試品，可在五氧化二磷干燥器中干燥過(guò)

12、夜或用其他適宜的干燥方法干燥，如恒溫減壓干燥。調(diào)節(jié)升溫速率為每分鐘上升1.01.5C,加熱時(shí)須不斷攪拌使傳溫液溫度保持均勻，記錄供試品在初熔至全熔時(shí)的溫度，重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值，即得?！俺跞邸毕抵腹┰嚻吩诿?xì)管內(nèi)開(kāi)始局部液化出現(xiàn)明顯液滴時(shí)的溫度。“全熔”系指供試品全部液化時(shí)的溫度。測(cè)定熔融同時(shí)分解的供試品時(shí)，方法如上述，但調(diào)節(jié)升溫速率使每分鐘上升2.53.0C；供試品開(kāi)始局部液化時(shí)（或開(kāi)始產(chǎn)生氣泡時(shí)）的溫度作為初熔溫度；供試品固相消失全部液化時(shí)的溫度作為全熔溫度。遇有固相消失不明顯時(shí)，應(yīng)以供試品分解物開(kāi)始膨脹上升時(shí)溫度作為全熔溫度。某些藥品無(wú)法分辨其初熔、全熔時(shí)，可以其發(fā)生突變時(shí)的溫度作為

13、熔點(diǎn)。（二）薄層層析1、吸附劑：硅膠G-CMC展開(kāi)劑：環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺（6:2:1）顯色劑：改良的碘化鈿鉀試劑（在噴顯色劑之前在80c左右完全揮干展開(kāi)劑，以免二乙胺干擾。甲素顯色后呈淡棕色，且顏色2小時(shí)左右褪掉，而乙素呈深棕色，久置不褪色。）樣品：漢防己甲素、漢防己乙素標(biāo)準(zhǔn)品，自制的漢防己甲素和漢防己乙素。薄層色譜法，系將適宜的吸附劑或載體涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點(diǎn)樣、展開(kāi)后，與適宜的對(duì)照物按同法在同板上所得的色譜圖對(duì)比，用以進(jìn)行藥品的鑒別。2、儀器與材料(1)玻板除另有規(guī)定外，用10cmx10cm、10cmx15cm、20cmX10cm或20cmx20cm的規(guī)格

14、，要求光滑、平整，洗凈后不附水珠，晾干。(2)吸附劑或載體最常用的有硅膠G、硅膠GF、硅膠H、硅膠HF,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F等。其顆粒大小一般要求直徑為1040仙m。薄層涂布，除另有規(guī)定外，一般可分無(wú)黏合劑和含黏合劑兩種；前者系將吸附劑或載體用水適量調(diào)成糊狀，均勻涂布于玻璃板上，后者系在吸附劑或載體中加入一定量的黏合劑，一般常用10%15%煨石膏(CaSQ-2H2O在140c加熱4小時(shí))，混勻后加水適量使用，或用竣甲基纖維素鈉水溶液(0.2%0.5%)適量調(diào)成糊狀，均勻涂布于玻璃板上。(3)涂布器應(yīng)能使吸附劑或載體在玻璃板上手工或自動(dòng)涂成一層符合厚

15、度要求的均勻薄層。(4)點(diǎn)樣器一般采用微升毛細(xì)管或與之相應(yīng)的點(diǎn)樣器材。(5)展開(kāi)室可用適合薄層板大小的專用玻璃缸，底部平底或有雙槽，蓋子須密閉。3、操作方法(1)薄層板制備除另有規(guī)定外，將吸附劑1份和水3份在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布器進(jìn)行涂布(厚度為0.250.5mm),取下涂好薄層的玻板，于室溫下，置水平臺(tái)上晾干，在反射光及透射光下檢視，表面應(yīng)均勻，平整，無(wú)麻點(diǎn)、無(wú)氣泡、無(wú)破損及污染，于110c烘30分鐘，冷卻后立即使用或置干燥箱中備用。(2)點(diǎn)樣除另有規(guī)定外，用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊1.5cm,樣點(diǎn)直徑一般不大

16、于3mm,點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜，一般為1cm。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。(3)展開(kāi)將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開(kāi)缸的展開(kāi)劑中，浸入展開(kāi)劑的深度為距原點(diǎn)5mm為宜，5cmx15cm玻板展開(kāi)劑用量約10ml,密封，待展開(kāi)距離除另有規(guī)定外，一般為815cm,取出薄層板，晾干。展開(kāi)缸如需預(yù)先用展開(kāi)劑預(yù)平衡，可在缸中加入適量的展開(kāi)劑，必要時(shí)并在壁上貼二條與缸一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開(kāi)劑中，蓋嚴(yán)，使展開(kāi)缸平衡或按正文規(guī)定操作。(4)顯色(三)衍生物的制備(選做)取漢防已甲素0.2g,溶于2ml(丙酮中，滴加苦味酸飽和水溶液至不再析出黃色沉淀為止，抽濾收集沉淀，順次以少量水乙醴洗滌

17、，乙醇重結(jié)晶，得漢防已甲素苦味酸鹽，mp235242c(dc)。附錄中草藥化學(xué)成分檢由試劑配制法一、生物堿沉淀試劑：1 .碘化鈾鉀（Dragendorff）試劑：取次硝酸鈾3g溶于30%硝酸（比重1.18）17ml中,在攪拌下慢慢加碘化鉀濃水溶液（27克碘化鉀溶于20ml水），靜置一夜，取上層清液，加蒸儲(chǔ)水稀釋至100ml。附：改良的碘化鈾鉀試劑：甲液：0.85g次硝酸鈾溶于10ml冰醋酸，加水40ml。乙液：8g碘化鉀溶于20ml水中。溶液甲和乙等量混合，于棕色瓶中可以保存較長(zhǎng)時(shí)間，可作沉淀試劑用，如作層析顯色劑用，則取上述混合液1ml與醋酸2ml,混合即得。目前市場(chǎng)上碘化鈉鉀試劑可直接供配

18、制：7.3g碘化鈾鉀，冰醋酸10ml,加蒸儲(chǔ)水60ml。2 .碘化汞鉀（Mayer）試劑：氯化汞1.36g和碘化鉀5g各溶于20ml水中，混合后加水稀釋至100ml。3 .碘一碘化鉀（Wagner）：試劑：1g碘化鉀液于50ml,加熱，力口2ml醋酸，再用水稀釋至100ml。4 .硅鴇酸試劑：5g硅鴇酸溶于100ml水中，加鹽酸少量至pH2左右。5 .苦味酸試劑：1g苦味酸溶于100ml水中。6 .糅酸試劑：糅酸1g加乙醇1ml溶解后再加水至10ml。7 .堿酸鈾一一硫酸試劑：0.1g硫酸鈾混懸于4ml水中，加入1g三氯醋酸，加熱至沸，逐滴加入濃硫酸至澄清。二、昔類檢出試劑：（一）糖的檢出試劑

19、：1. 堿性酒石酸銅（Fehiling）試劑：本口分甲液與乙液，應(yīng)用時(shí)取等量混合。甲液：結(jié)晶硫酸酮6.23g,加水至100ml。乙液：酒石酸鉀鈉34.6g,及氫氧化鈉10g,加水至100ml。2. a-蔡酚（Molisch）試齊1J。甲液：a-蔡酚1g,加75%乙醇至10ml。乙液：濃硫酸3. 氨性硝酸銀試劑：硝酸銀1g,加水20ml溶解，注意滴加適量的氨水，隨加隨攪拌，至開(kāi)始產(chǎn)生的沉淀將近全溶為止，過(guò)濾。4. a-去氧糖顯色試劑（1）三氯化鐵冰醋酸（Keller-Kiliani）試劑甲液：1%三氯化鐵溶液0.5ml,加冰醋酸至100ml。乙液：濃硫酸。（2）占噸氫醇冰醋酸（Xanthydro

20、l）試齊1J:10mg占噸氫醇溶于100ml冰醋酸（含1%的鹽酸中）（二）酚類1 .三氯化鐵試劑：5%三氯化鐵的水溶液或醇溶液。2 .三氯化鐵一鐵氧化鉀試劑：甲液：2%三氯化鐵水溶液乙液：1%鐵氧化鉀水溶液應(yīng)用時(shí)甲液、乙液等體積混合或分別滴加。3、4一氨基氨替比林一氨氧化鉀（Emerscn）試劑：甲液：2%4-氨基安替比林乙醇液乙液：3%鐵氧化鉀水溶液，（或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%鐵氧化鉀水溶液）。4 .重氮化試劑：本試劑系由對(duì)硝基苯胺和亞硝酸鈉在強(qiáng)酸下經(jīng)重氮化作用而成，由于重氮鹽不穩(wěn)定很易分解，所本試劑應(yīng)臨用時(shí)配制。甲液：對(duì)硝基苯胺0.35g,溶于濃鹽酸5ml,加水至50ml。乙

21、液：亞硝酸鈉5g,加水至50ml應(yīng)用時(shí)取甲、乙液等量在冰水浴中混合后，方可使用。5. Gibb試齊1J:甲液：0.5%2,6-二氯苯醍-4氯亞胺的乙醇溶液。乙液：硼酸一氯化鉀一氫氧化鉀緩沖液（pH9.4）。注試劑配制法中：1.水是指蒸儲(chǔ)水；2.不指出溶劑的即為水溶液；3.醇指95%;4.試劑配制后應(yīng)澄清，如不澄清可過(guò)濾。（三）內(nèi)酯、香豆素類1 .異羥的酸鐵試劑甲液：新鮮配制的1N羥胺鹽酸鹽（M=69.5）的甲醇液。乙液：1.1N氫氧化鉀（M=56.1）的甲醇液丙液：三氯化鐵溶于1%鹽酸中的濃度為1%的溶液。應(yīng)用時(shí)甲、乙、丙三液體按次序滴加，或甲、乙兩液混合滴加后再加丙液。2 .4-氨基安替比林

22、一鐵氧化鉀t劑（見(jiàn)二一（二）-3）。3 .重氮化試劑：（見(jiàn)二一（二）-4）。進(jìn)彳T2、3試驗(yàn)時(shí)樣品應(yīng)先加3%碳酸鈉溶液加熱處理，再分別滴加試劑。4 .開(kāi)環(huán)一閉環(huán)試劑甲液：1%氫氧化鈉溶液。乙液：2%鹽酸溶液。（四）黃酮類：1 .鹽酸鎂粉試劑：濃鹽鎂和鎂粉2 .三氯化鋁試劑：2%三氯化鋁甲醇溶液3 .醋酸鎂試劑：1%醋酸鎂甲醇溶液4 .堿式醋酸鉛試劑：飽和堿式醋酸鉛（或飽和醋酸鉛）水溶液。5 .氫氧化鉀試劑：10%氫氧化鉀水溶液。6 .氧氯化錯(cuò)試劑：10%氧氯化錯(cuò)甲醇溶液。7 .錯(cuò)一枸檬酸試劑：甲液：2%氧氯化錯(cuò)甲醇液。乙液：2%枸檬酸甲醇液。（五）蔥醍類：1 .氫氧化鉀試劑：10%氫氧化鉀水溶

23、液。2 .醋酸鎂試劑：105醋酸鎂甲醇溶液。3 .1%硼酸試劑：1%硼酸水溶液。4 .濃硫酸試劑：濃硫酸。5 .堿式醋酸鉛試劑：（見(jiàn)二一（四）一4）。（六）強(qiáng)心昔類1 .3,5-二硝基苯甲酸（Kedde）試劑。甲液：2%3,5-二硝基苯甲酸甲醇液。乙液：1N氫氧化鉀甲醇溶液：應(yīng)用前甲、乙兩液等量混合。2 .堿性苦味酸（Baljet）試劑：甲液：1%苦味酸水溶液。乙液：10%氫氧化鈉溶液。3 .亞硝基鐵氧化鈉一氫氧化鈉的（Legal）試劑：甲液：口比咤乙液：0.5%亞硝基鐵氧化鈉溶液。丙液：10%氫氧化鈉溶液（七）皂昔類：1 .溶血試驗(yàn)：2%血球生理鹽水混懸液：新鮮兔血（由心臟或耳靜脈取血），適

24、量，用潔凈小毛刷迅速攪拌，除去纖維蛋白并用生理鹽水反復(fù)離心洗滌至上清液無(wú)色后，量取沉降紅血球用生理鹽水配成2%混懸液，貯冰箱內(nèi)備用（貯存期23天）。2 .醋酊一濃堿酸（Liebermann）試劑：甲液：醋酊。乙液：硫酸。3 .濃硫酸試劑，濃硫酸。（八）含氧昔類：1 .苦味酸鈉試劑：適當(dāng)大小的濾紙條，浸入苦味酸飽和水溶液；浸透后取出晾干，再浸入10%碳酸鈉水溶液內(nèi)，迅速取出晾干即得。2.亞鐵氧化鐵（普魯士蘭）試劑：甲液：10%氫氧化鈉液。乙液：10%硫酸亞鐵水溶液，用前配制。丙液：10%鹽酸。丁液：5%三氯化鐵液。三、菇類、管體類檢出試劑1.香草醛一濃硫酸試劑：5%香草醋濃硫酸液（或0.5g香草醛溶于100ml硫酸一乙醇（4:1）中）。2 .三氯化睇（Carr-Price）試劑：25g三氯化睇溶于15g氯仿中（亦可用氯仿或四氯化碳的飽和溶液）。3 .五氯化睇試劑：五氯化睇一氯