d6 酶固定化蛋白質(zhì)工程

1、退出退出退出退出退出退出退出退出退出退出退出Understanding enzyme immobilisation nEnzymes are versatile catalysts in the laboratory and on an industrial scale. To broaden their applicability in the laboratory and to ensure their (re)use in manufacturing the stability of enzymes can often require improvement. Immobilisatio

2、n can address the issue of enzymatic instability. Immobilisation can also help to enable the employment of enzymes in different solvents, at extremes of pH and temperature and exceptionally high substrate concentrations. At the same time substrate-specificity, enantioselectivity and reactivity can b

3、e modified. However, most often the molecular and physical-chemical bases of these phenomena have not been elucidated yet. Chem Soc Rev. 2009 Feb;38(2):453-68. Hanefeld U, Gardossi L, Magner E.退出Recent advances in immobilized enzymatic reactors and their applications in proteome analysisnImmobilized

4、 enzymatic reactors recently have drawn much attention because of the striking advantages, such as high substrate turnover rate and ease in coupling with the separation and detection systems. Carrier materials, which have great effects on the development of the immobilized enzymatic reactors, have a

5、lways being the focus of study. In this paper, the contributions, mainly in the last 5 years, on the enzymatic reactors and their applications in proteome study are reviewed, with some newly developed inorganic and organic carriers for enzyme immobilization described in details. Moreover, the hyphen

6、ation of immobilized enzymatic reactors with the separation and identification systems is also summarized. By reviewing these achievements, it could be seen that enzymatic reactors have very bright future, especially in proteome analysis Anal Chim Acta. 2009 Jan 19;632(1):1-8. Ma J, Zhang L, Liang Z

7、, Zhang W, Zhang Y. 退出固定化酶的研究?jī)?nèi)容固定化酶的研究?jī)?nèi)容固定化方法載體酶學(xué)性質(zhì)固定化酶的特性穩(wěn)定性研究、改進(jìn)最適溫度最適pH底物特異性退出固定化酶的制備方法固定化酶的制備方法（一）（一） 吸附法吸附法n1 物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。n 選擇載體的原則 （1）要有巨大的比表面積 （2） 要有活潑的表面（3） 便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。退出優(yōu)點(diǎn)：固定化時(shí)酶分子的構(gòu)象很少或基本不發(fā)生變化。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。載體：纖維素、瓊脂糖、活性炭、沸石及硅膠等。退出（二）結(jié)合法（二）結(jié)合法n1 離子鍵結(jié)合法q酶分子 含有離子交換基團(tuán)的固相載體n常用載體

8、:DEAE-纖維素， DEAE-葡聚糖凝膠n使用注意：pH、離子強(qiáng)度、溫度退出2 共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法n（1）酶分子中可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)： 游離氨基， 游離羧基， 巰基， 咪唑基， 酚基， 羥基， 甲硫基， 吲哚基，二硫鍵n（2）常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無(wú)機(jī)載體退出共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式通式”n首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)n 關(guān)鍵 n 然后活化該活潑基團(tuán)n 最后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵退出（4）載體活化的方法）載體活化的方法nA重氮法nB疊氮法nC烷基化反應(yīng)法nD硅烷化法nE溴化氰法退出A重氮法重氮法n目前用的較多的載體是對(duì)氨

9、基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等退出A重氮法重氮法n反應(yīng)式及原理退出B 疊氮法疊氮法n例n用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下：n 酯化n 肼解n 疊氮化n(4) 偶聯(lián)退出B 疊氮法疊氮法n對(duì)含有羧基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后于酶偶聯(lián) 退出C烷基化反應(yīng)法烷基化反應(yīng)法n含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。退出D硅烷化法硅烷化法n一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。n多孔玻璃特點(diǎn)：n機(jī)械強(qiáng)度好，表面積大。n耐有機(jī)溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長(zhǎng)等。 退出D硅烷化法

10、硅烷化法退出D硅烷化法硅烷化法退出D硅烷化法硅烷化法退出E 溴化氰法溴化氰法n主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類(lèi)物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。n用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。退出E 溴化氰法溴化氰法退出（三）交聯(lián)法（三）交聯(lián)法n借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱(chēng)為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。退出（三）交聯(lián)法常用試劑（三）交聯(lián)法常用試劑n常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、N，N乙烯馬來(lái)亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。n應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個(gè)醛基都可以與

11、酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿(shiff)退出雙功能試劑：雙功能試劑：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶 得到一種分子間得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶交聯(lián)的固定化酶退出圖 酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián) 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶退出表 常用于固定化酶的交聯(lián)劑 交聯(lián)劑 參考文獻(xiàn)戊二醛1316二重氮聯(lián)苯胺2，2二磺酸17，184，4二氟3，3二硝基二苯砜 19二苯基4，4二硫氰

12、酸2，2二磺酸 201，5二氟2，4二硝基苯 21酚2，4二磺酰氯 223甲氧基二苯基甲烷4，4二異氰酸鹽 23退出（三）交聯(lián)法的形式（三）交聯(lián)法的形式n交聯(lián)法有2種形式：酶直接交聯(lián)法n 酶輔助蛋白交聯(lián)n雙重固定法 （1） 吸附交聯(lián)法n（2） 交聯(lián)包埋法退出酶直接交聯(lián)法酶直接交聯(lián)法n在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。n固定化依賴(lài)酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。退出酶輔助蛋白交聯(lián)酶輔助蛋白交聯(lián)n為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過(guò)程中因化學(xué)修飾而引起酶失活，n可使用第二個(gè)“載體”蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來(lái)增加蛋白質(zhì)濃度，n使酶與惰性蛋

13、白質(zhì)共交聯(lián)。退出（1） 吸附交聯(lián)法吸附交聯(lián)法n先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹(shù)脂或其他大孔型離子交換樹(shù)脂上，n再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。n用此法所得固定化酶也可稱(chēng)為殼狀固定化酶。退出（2）交聯(lián)包埋法）交聯(lián)包埋法n把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細(xì)的集合體，n然后用高分子或多糖一類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行包埋成顆粒。n這樣制得的固定化酶穩(wěn)定性好。退出（四）（四） 包埋法（包埋法（entrapping method） n定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱(chēng)為包埋法。n包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型n1網(wǎng)格型n2微囊型退出1網(wǎng)格型網(wǎng)格型n(1) 概念 將酶或含酶菌體包埋在凝膠細(xì)

14、微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱(chēng)為網(wǎng)格型包埋法。也稱(chēng)為凝膠包埋法退出2微囊型包埋法微囊型包埋法n是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱(chēng)為微囊化法。 退出微囊化法制備固定化酶有兩種方法微囊化法制備固定化酶有兩種方法n 界面沉淀法n界面聚合法退出 界面沉淀法界面沉淀法n這是一種簡(jiǎn)單的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。退出界面聚合法界面聚合法n是用化學(xué)手段制備微囊的方法。利用油水界面上發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚合體而將酶包裹起來(lái)。退出各類(lèi)固定化方法的特點(diǎn)比較各類(lèi)固定化方法的特點(diǎn)比較

15、: 比較項(xiàng)目吸附法結(jié)合法 交聯(lián)法包埋法物理吸附.共價(jià)鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合 制備難易易難易 較難較難固定化程度弱強(qiáng)中等 強(qiáng)強(qiáng)活力回收率較高低高 中等高載體再生可能不可能可能 不可能不可能費(fèi)用低高低 中等低底物專(zhuān)一性不變可變不變 可變不變適用性酶源多較廣廣泛 較廣小分子底物、藥用酶退出化學(xué)偶聯(lián)酶酶固定化固定化間歇間歇可溶可溶交聯(lián)包埋吸附間歇間歇連續(xù)連續(xù)退出選擇方法依據(jù)：選擇方法依據(jù)： n（1） 酶的性質(zhì)n（2） 載體的性質(zhì)n（3） 制備方法的選擇退出固定化后酶的考察項(xiàng)目：固定化后酶的考察項(xiàng)目：n（1） 測(cè)定固定化酶的活力，以確定固定化過(guò)程的活力回收率。n（2） 考察固定化酶穩(wěn)定性n（3） 考察固定化酶

16、最適反應(yīng)條件退出一一 影響固定化酶性質(zhì)的因素影響固定化酶性質(zhì)的因素1 酶本身的變化發(fā)生了變化n活性中心的氨基酸殘基n高級(jí)結(jié)構(gòu)n電荷狀態(tài)等退出一一 影響固定化酶性質(zhì)的因素影響固定化酶性質(zhì)的因素2 載體的影響n(yōu)（1）擴(kuò)散限制效應(yīng)n（2） 空間障礙效應(yīng)退出二二固定化后酶性質(zhì)的變化固定化后酶性質(zhì)的變化1 固定化對(duì)酶活性的影響：n酶活性下降，反應(yīng)速度下降n原因？退出二二 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)2 固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響n(yōu)（1） 操作穩(wěn)定性提高n（2） 貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。n (3 ) 對(duì)熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。n (4 ) 對(duì)分解酶的穩(wěn)定性提高。n（5） 對(duì)變性劑的耐受力升高

17、退出2 固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：na. 固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接。nb.抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。退出3 pH的變化的變化nPH對(duì)酶活性的影響：n（1） 改變酶的空間構(gòu)象n（2）影響酶的催化基團(tuán)的解離n（3）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離n（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。退出4 最適溫度變化最適溫度變化n一般與游離酶差不多，但有些會(huì)有較明顯的變化。n5 底物特異性變化n作用于低分子底物的酶 特異性沒(méi)有明顯變化n既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特異性往往會(huì)變化。退出6 米氏常數(shù)米氏常數(shù)Km的變化，的變化，Km值隨載體值隨

18、載體性質(zhì)變化性質(zhì)變化n（1） 載體與底物帶相同電荷，KmKm固定化酶降低了酶的親和力。n（2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，KmKm退出三、評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：三、評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：n1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。n 或：?jiǎn)挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。n2. 操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。 連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間（t1/2）退出三、評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：三、評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：n3. n4. n或稱(chēng)偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)。n5.相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱(chēng)

19、為相對(duì)酶活力n 退出細(xì)胞固定化細(xì)胞固定化n固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞稱(chēng)為固定化細(xì)胞.n該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，又稱(chēng)固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。退出固定化細(xì)胞的特點(diǎn)固定化細(xì)胞的特點(diǎn)n類(lèi)型：微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞n生理狀態(tài)：死細(xì)胞（完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器）n 活細(xì)胞（增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、完整細(xì)胞）n形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。n 最多使用：顆粒狀珠體n使用周期：理論上講，固定化增殖細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部活性，只要載體不解體，不污染就可以長(zhǎng)期使用。退出固定化培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)固定化培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn) n細(xì)胞可維持在較小體積培養(yǎng)液中生長(zhǎng)； n細(xì)胞損

20、傷程度低； n易于更換培養(yǎng)液； n細(xì)胞和培養(yǎng)液易于分離； n培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度高，簡(jiǎn)化了產(chǎn)品分離純化操作。 退出退出細(xì)胞固定化培養(yǎng)法細(xì)胞固定化培養(yǎng)法 n動(dòng)物細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)謂之細(xì)胞固定化培養(yǎng)法。動(dòng)物細(xì)胞幾乎都可采用固定化方法培養(yǎng)。固定化方法有：q吸附法（所用載體有陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒 ）q包埋法 （將細(xì)胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中）退出吸附法吸附法n它主要通過(guò)載體與細(xì)胞間的靜電引力，即細(xì)胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細(xì)胞固定在載體上的。 退出影響吸附法的主要因素影響吸附法的主要因素 n（1）Z-電位： Z-電位能近似地代表表

21、面電荷密度的大小n（2）細(xì)胞的性質(zhì)和細(xì)胞壁的組成：細(xì)胞壁的電荷性質(zhì)n（3）載體的性質(zhì)：特別是玻璃、陶瓷等無(wú)機(jī)材料退出包埋固定法包埋固定法 n包埋法是在細(xì)胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學(xué)鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內(nèi)的一種固定化方法。n包埋法的最大優(yōu)點(diǎn)是能較好的保持細(xì)胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細(xì)胞那樣進(jìn)行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。 退出包埋法分類(lèi)包埋法分類(lèi)n常用載體：瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺n常用凝膠包埋法退出舉例海藻酸鈣包埋法舉例海藻酸鈣包埋法n基本原理是：稱(chēng)取一定量的海藻酸鈉配成水溶液，經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細(xì)胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器或滴管將冷懸液滴入

22、一定濃度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球狀固定化細(xì)胞退出通過(guò)改變載體溶液參數(shù)包埋細(xì)胞通過(guò)改變載體溶液參數(shù)包埋細(xì)胞 n改變載體溶液、操作溫度、鹽濃度、pH值和溶劑等參數(shù)時(shí)，亦可使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，將細(xì)胞包埋其中。退出研究熱點(diǎn)研究熱點(diǎn)光交聯(lián)樹(shù)脂包埋法光交聯(lián)樹(shù)脂包埋法 n例：相對(duì)分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50，然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得退出固定化培養(yǎng)裝置固定化培養(yǎng)裝置n多層平板裝置n螺旋卷膜培養(yǎng)器n多層托盤(pán)式培養(yǎng)器n卷帶式培養(yǎng)器n中空纖維及流化床式培養(yǎng)器 退出中空

23、纖維培養(yǎng)器優(yōu)點(diǎn)中空纖維培養(yǎng)器優(yōu)點(diǎn) n細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，可達(dá)l08個(gè)毫升以上，細(xì)胞處于接近生理狀態(tài)的理化梯度中；n營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可有效分布，代謝廢物可及時(shí)排除；n細(xì)胞培養(yǎng)可達(dá)數(shù)月，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)；n細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)濃度高。產(chǎn)品純度可高達(dá)60一90；利于降低成本；n反應(yīng)器體積小并可用于培養(yǎng)多種細(xì)胞。 退出微載體培養(yǎng)方法微載體培養(yǎng)方法 n將動(dòng)物細(xì)胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面長(zhǎng)成單層的培養(yǎng)方法稱(chēng)為微載體培養(yǎng)法或微珠培養(yǎng)法。 n制備微載體的材料主要有：q葡聚糖（DEAESephadex A50及A25 ） q塑料q明膠q玻璃q纖維素 退出微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn) n兼具單

24、層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，且是均相培養(yǎng)。n細(xì)胞所處環(huán)境均一，放大容易。n培養(yǎng)操作可系統(tǒng)化、自動(dòng)化，障低了污染發(fā)生的機(jī)會(huì)。退出退出退出固定化原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體n何為原生質(zhì)體？n有何優(yōu)點(diǎn)？退出退出一一 原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備n將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中加入水解酶分離得到原生質(zhì)體退出高滲緩沖液高滲緩沖液n高滲緩沖液處理指對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)，即受體組織或細(xì)胞在適當(dāng)濃度的高滲液進(jìn)行一定時(shí)間的浸泡處理。n靶體經(jīng)過(guò)高滲液一定時(shí)間的處理，體積縮小到原來(lái)的80%左右，細(xì)胞膜內(nèi)外形成一個(gè)滲透壓梯度。退出n滲透壓調(diào)節(jié)能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，阻止細(xì)胞質(zhì)外滲，減少細(xì)胞的損

25、傷，提高細(xì)胞的活性，在基因槍法、電擊穿孔法、微注射法等直接轉(zhuǎn)化方法都有應(yīng)用。退出n首先必須消除細(xì)胞壁，它是微生物細(xì)胞之間進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換的主要障礙。通常采用蝸牛酶除去細(xì)胞壁，n緩沖液(1) 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸緩沖液。(2) 高滲緩沖液，于上述緩沖液中加入0.8 mol/L 甘露醇。退出n原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM)0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 順丁烯二酸，調(diào)pH 6.5。n(一) 原生質(zhì)體的制備1活化菌體將單倍體釀酒酵母菌Y-1 和Y-4 活化分別轉(zhuǎn)接新鮮斜面。自新鮮斜面分別挑取一環(huán)接入裝有25 mL 完全培養(yǎng)基的錐形瓶中，30培

26、養(yǎng)16 h 至對(duì)數(shù)期。退出n2離心洗滌、收集細(xì)胞分別取5 mL 上述培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，3000 r/min 離心 10 min，棄上清液，向沉淀的菌體中加入5 mL 緩沖液，用無(wú)菌接種環(huán)，攪散菌體，振蕩均勻后離心洗滌一次，再用5 mL 高滲緩沖液離心洗滌一次。n將菌體分別懸浮于5 mL 高滲緩沖液中，振蕩均勻，分別取樣0.5 mL，用生理鹽水稀釋至10-6，分別各取0.1 mL 10-4、10-5、10-6 稀釋液。n于相應(yīng)編號(hào)的完全培養(yǎng)基平板上(每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平板)，用刮棒涂布，30培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行總菌數(shù)測(cè)定。退出n3. 酶解脫壁各取3 mL 菌液于無(wú)菌小試管中，300

27、0 r/min 離心10 min，棄上清液，加入3 mL 含2.0 mg 蝸牛酶的高滲緩沖液(此高滲緩沖液含有0.1EDTA 和0.3SH-OH）于30振蕩保溫，定時(shí)取樣鏡檢觀察至細(xì)胞變成球狀原生質(zhì)體為止，此時(shí)原生質(zhì)體形成。退出n(二) 原生質(zhì)體再生及剩余菌數(shù)的測(cè)定1再生分別吸取0.5 mL 原生質(zhì)體(經(jīng)酶處理)加入裝有4.5 mL 高滲緩沖液及4.5 mL 無(wú)菌水試管中。經(jīng)高滲緩沖液稀釋至10-5；分別吸取0.1 mL 10-3、10-4、10-5。稀釋液于相應(yīng)編號(hào)的再生培養(yǎng)基平板上，30培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)行再生菌數(shù)測(cè)定(用雙層再生培養(yǎng)基)。退出n2. 未脫壁菌數(shù)測(cè)定分別取0.5 mL 原

28、生質(zhì)體至裝有無(wú)菌水試管中，稀釋到10-4；各取0.1 mL 10-2、10-3、10-4 的稀釋液于相應(yīng)編號(hào)的完全培養(yǎng)基平板上，30培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)行未脫壁菌數(shù)測(cè)定。退出二二 原生質(zhì)體固定化的方法原生質(zhì)體固定化的方法n將原生質(zhì)替制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體。退出四四 輔酶固定化輔酶固定化n1 原因n有機(jī)輔因子中具有某些特殊的化學(xué)基團(tuán)，參與酶的催化反應(yīng)n有機(jī)輔因子在使用過(guò)程中要流失，并且不能自行再生n有機(jī)輔因子價(jià)格昂貴n工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機(jī)輔因子的保留和再生退出輔酶固定化的方法：輔酶

29、固定化的方法：n2 固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后固定在超濾器中。n3 輔酶固定化必須解決輔酶在多個(gè)酶之間傳遞的障礙。 退出輔酶的固定化輔酶的固定化退出輔酶固定化的形式：輔酶固定化的形式：退出生物催化劑細(xì)胞酶非生長(zhǎng)生長(zhǎng)可溶固定化懸浮固定化連續(xù)間歇吸附包埋交聯(lián)化學(xué)連續(xù)材料膜固定酶液凝膠吸附化學(xué)連接物固定化再循環(huán)系統(tǒng)凝膠吸附連續(xù)半連續(xù)分批間歇 連續(xù)活塞模式攪拌連續(xù)反應(yīng)器間歇連續(xù)活塞模式攪拌連續(xù)反應(yīng)器圖 生物催化劑作用方式示意退出固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用 n固定化酶和細(xì)胞的應(yīng)用（工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、分析化學(xué)、酶電極、

30、親和色譜、環(huán)境保護(hù)、能源開(kāi)發(fā)、基礎(chǔ)理論研究）退出退出二固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用二固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用n1. 固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用n2 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用n3 固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用n4 固定化酶和親和色譜n5 固定化酶與環(huán)境保護(hù)n6 新能源開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用n7 固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用退出1 固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用n葡萄糖異構(gòu)酶世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。n利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶n固定化酵母細(xì)胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類(lèi)n熱點(diǎn)：固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用退出固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用乙酰乙酰 -DL Al

31、a L Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D AlaAminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶退出泵泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)離心機(jī)消消旋旋反反應(yīng)應(yīng)器器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala退出2 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用n例1n固定化青霉素?；?，只要改變pH值等條件，就可以生成不同的產(chǎn)物。退出酶促合成頭孢類(lèi)抗生素酶促合成頭孢類(lèi)抗生素n - Reversible reaction n - Hydrolysis of substrate or product by biocatalystn - Difficulty of separation of product from reactantsCHCOOCH3NH2CH