楊恪鑒超氧化物歧化酶SOD的生產(chǎn)

1、項目四項目四:超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)的生產(chǎn)的生產(chǎn)任務(wù)一：任務(wù)一：SOD制備方案的制定制備方案的制定生藥1121 第五組 2011423242一一.SOD的概況二.SOD的運用三.SOD的生產(chǎn)四.SOD的活力測定 1.SOD的概念 超氧物歧化酶（Superoxide Dismutase簡稱SOD）是一種新型酶制劑。它在生物界的分布極廣，幾乎從動物到植物，甚至從人到單細(xì)胞生物，都有它的存在。SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶、人體內(nèi)的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敵，是機體內(nèi)氧自由基的頭號殺手，是生命健康之本。全球118位科學(xué)家發(fā)表聯(lián)合聲明：自由基是百病之源，SOD是健康

2、之本。體內(nèi)的SOD活性越高，壽命就越長。 基本原理 SOD屬于金屬蛋白酶，按照結(jié)合金屬離子種類不同，該酶有以下三種：含銅與鋅超氧化物歧化酶（ Cu-ZnSOD ）、含錳超氧化物歧化酶（ Mn-SOD ）和含鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD ）。三種SOD都催化超氧化物陰離子自由基，將之歧化為過氧化氫與氧氣。 在細(xì)胞由于自由基非常活潑，化學(xué)反應(yīng)性極強，參與一系列的連鎖反應(yīng)，能引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化，破壞了膜的結(jié)構(gòu)和功能。它能引起蛋白質(zhì)變性和交聯(lián)，使體內(nèi)的許多酶及激素失去生物活性，機體的免疫能力、神經(jīng)反射能力、運動能力等系統(tǒng)活力降低，同時還能破壞核酸結(jié)構(gòu)和導(dǎo)致整個機體代謝失常等，最終使機體發(fā)生

3、病變。 4 4.SOD的理化性質(zhì) 3.1 SOD對氰化物和H2O2的敏感性 3.2 SOD的吸收光譜特性 3.3 SOD穩(wěn)定性及影響因素 它催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2的反應(yīng)， 即催化超氧陰離子自由基O2-發(fā)生歧化反應(yīng)， 從而清除O2-，2O2-+2H+H2O2+O2， 在生命體的自我保護(hù)系統(tǒng)中起著極為重要的作用， 在免疫系統(tǒng)中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增強機體抗輻射損傷能力，防衰老。 超氧化物歧化酶（SOD）的催化底物是O2 ，一般多以一定時間內(nèi)產(chǎn)物生成量或底物的消耗量作為酶活性單位。由于O2 自身很不穩(wěn)定，且不易制備，測定SOD的方法除少數(shù)采用直接法外，一般多為間接法。 常用

4、的有： 鄰苯三酚自氧化法 細(xì)胞色素C還原法（McCord法） 化學(xué)發(fā)光法 免疫學(xué)方法 電泳法 長時間用過氧化氫處理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影響 CuZn-SOD具有獨特的紫外吸收光譜。由于色氨酸和酪氨酸的含量較低，它在280 nm處并沒有最大吸收峰。 CuZn-SOD的可見光最大吸收波長都在680 nm左右， 這反映了酶分子中Cu2+的光學(xué)特性。 PH、熱、蛋白酶的影響：SOD在pH5.39.6間催化性能良好，在pH4.5pH11間能穩(wěn)定存在。pH3.6時， CuZn-SOD中95%的Zn要脫落，在pH12.2時，SOD的構(gòu)象會發(fā)生不可逆的轉(zhuǎn)變而使酶失活。 S

5、OD對熱的穩(wěn)定性與溶液中離子強度有關(guān)。當(dāng)離子強度很低時,即使加熱到95, 其活性損失也很少其他因素：SOD活性受飲料的色澤、成分、酸堿度、乙醇含量等多種因素的影響，只有在無色、近中性、無乙醇飲料中SOD活性較穩(wěn)定。另外還發(fā)現(xiàn)有機溶劑和Cl對SOD的活性具抑制作用1.藥物SOD是一種新型的抗炎癥藥， 根據(jù)SOD作用機制和毒性試驗 ，它對治療因O2-引起的各種 疾病都有一定的療效。為此， SOD可作為抗衰老、抗炎癥、自身免疫疾病患者廣泛應(yīng)用的醫(yī)藥品。此外，SOD對治療貝切特氏癥、心肌梗塞等血虛性心臟病、膠原病、新生兒呼吸困難綜合癥、防御放射性傷害等也可望有效。 2.添加劑 國外不少高級化妝品都添加

6、SOD， 國內(nèi)也有數(shù)家工廠或公司在開發(fā)和生產(chǎn)SOD化妝品， 如大寶SOD密，康妮SOD、SOD康舒達(dá)霜劑等。SOD作為化妝品添加劑主要有3個優(yōu)點： （1）有明顯的防曬效果 （2）可防皮膚衰老，阻止紫褐質(zhì)（老年斑）的形成 （3）有明顯的抗炎效果，對防治皮膚病有一定效果。 國外把SOD作為食品添加劑的例子是加在口香糖和飲料中。我國貴州農(nóng)學(xué)院已開發(fā)出刺梨SOD飲料。SOD及修飾過的SOD還可作為外用藥膏、眼藥及牙膏等的添加劑 3. 生化試劑 國外已有數(shù)家公司如Sigma公司等出售SOD試劑，國內(nèi)也有廠家批量生產(chǎn)SOD試劑， 如中科院上海生化所東風(fēng)試劑廠、南京建成生物工程研究所等。此外，SOD有可能作

7、為某些疾病的探針， 如郭彥等人認(rèn)為腦瘤組織線粒體Mn-SOD降低是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的可靠生化指標(biāo)之一， 并可作為評估腦瘤分化程度的參考。 綜上所述，隨著人們對SOD更廣泛深入的研究，不同類型SOD、SOD修飾物及人工有機合成SOD模擬酶將在醫(yī)療、保健、食品、農(nóng)業(yè)增產(chǎn)等方面發(fā)揮出更大的作用。 1.SOD酶的提取 稱取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎細(xì)胞后，加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸緩沖液（pH7.8）15ml，繼續(xù)研磨20min,使SOD酶充分溶解到緩沖液中，然后6000r/min冰凍離心15min，放棄沉淀，取上清液。 2.去除雜蛋白 上清液中加入0.25倍體積的氯仿乙醇混合液攪拌15m

8、in,6000r/min離心15min，放棄沉淀，得到的上清液即是粗酶液 3.SOD酶的沉淀分離 粗酶液在攪拌下緩慢加入固體硫酸銨至飽和濃度60%，持續(xù)攪拌15min，6000r/min離心15min，得到SOD酶沉淀 4.將沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸緩沖液5mL中，然后6000r/min離心15min，放棄沉淀，取上清液，用凝膠sephacylS-200進(jìn)行純化，然后超濾濃縮。 5.用紫外分光光度計測定濃液的蛋白含量 6.將濃縮冷凍干燥后即得成品。 原理 連苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-,生成帶色的中間產(chǎn)物。在自氧化過程的初始階段，黃色中間產(chǎn)物的積累在滯后3

9、0-45s后就與時間呈現(xiàn)性關(guān)系。中間產(chǎn)物在325nm處有強烈的光吸收，在有SOD存在時能催化生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，通過計算就可以求出SOD的活力。 儀器 紫外分光光度計、pH計,離心機 試劑 0.05mol/L連苯三酚溶液：稱取3.15g連苯三酚用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定容至500ml pH=8.3 Tris-HCl緩沖溶液 0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液: NH2C(CH2OH)3 121.14 取12.114g,溶解，定容至100ml 0.1mol/L鹽酸: 取8.6(9)ml濃鹽酸，稀釋至1000ml 5 0毫升0.1mol/L三羥甲基

10、氨基甲烷（Tris）溶液 19.9_毫升0.1mol/L鹽酸混勻并稀釋至100毫升。 (保存溫度: 常溫密封避光保存) 酶液的制備 稱取6g樣品，加于現(xiàn)在冰箱中放置的緩沖液60ml(樣品的10倍，視情況定)，在冰浴中研磨成勻漿，四層紗布過濾，濾液經(jīng)4000r/min 離心20min,取上清液用于酶活測定。 連苯三酚自氧化速率的測定 取4.5ml緩沖液，在25水浴中保溫15min,加入10 連苯三酚液，迅速搖勻 空白：取4.5ml緩沖液，在25水浴中保溫15min, 加入10 緩沖液，迅速搖勻 倒入光徑1cm的比色杯中，在325nm波長下于恒溫池中每隔30s測A值一次 計算線形范圍內(nèi)，每1minA的增值，此即連苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min 酶活測定 測定方法與測連苯三酚自氧化速率相同， 取1.5ml緩沖液，在25水浴中保溫15min,加入3ml酶液，加入10 連苯三酚液，迅速搖勻 空白：取1.5ml緩沖液，在25水浴中保溫15min, 加入3ml酶液，加入10 緩沖液，迅速搖勻 計算加酶后連苯三酚自氧化速率 樣品酶活單位表示，SOD酶活單位（U）/g鮮重 樣品酶活單位= 式中酶樣品在325nm處每分鐘光密度變化值 V反應(yīng)液體積 n酶液稀釋倍數(shù)（若酶液足夠多，可不稀釋即n為1） 1.SOD的安全性 大量試驗和臨