比色法測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)含量

1、一、方法的特點(diǎn)一、方法的特點(diǎn)與凱氏定氮法相比，用比色法測(cè)定生物材料中的蛋與凱氏定氮法相比，用比色法測(cè)定生物材料中的蛋白質(zhì)的含量，具有測(cè)定周期短、方便快捷的特點(diǎn)。此類(lèi)白質(zhì)的含量，具有測(cè)定周期短、方便快捷的特點(diǎn)。此類(lèi)方法是目前蛋白質(zhì)含量測(cè)定的發(fā)展的必然趨勢(shì)，但其測(cè)方法是目前蛋白質(zhì)含量測(cè)定的發(fā)展的必然趨勢(shì)，但其測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性比凱氏法要差些。定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性比凱氏法要差些。此外，本方法因?qū)Φ鞍踪|(zhì)在溶解性的要求而使其不此外，本方法因?qū)Φ鞍踪|(zhì)在溶解性的要求而使其不具有通用性（具有通用性（“見(jiàn)方法的基本要求見(jiàn)方法的基本要求”）。）。（一）方法的基本原理和依據(jù)（一）方法的基本原理和依據(jù)從生物遺

2、傳學(xué)角度看，同源蛋白質(zhì)具有相同比例（或份從生物遺傳學(xué)角度看，同源蛋白質(zhì)具有相同比例（或份額）的特征性基團(tuán)，它們包括構(gòu)成肽鏈的酰氨鍵、非額）的特征性基團(tuán)，它們包括構(gòu)成肽鏈的酰氨鍵、非-氨基氨基（堿性基團(tuán)）、非末端竣基（酸性基團(tuán)）和芳香族氨基酸等。（堿性基團(tuán)）、非末端竣基（酸性基團(tuán)）和芳香族氨基酸等。隨著蛋白質(zhì)的含量的增加，其特征性基團(tuán)的表現(xiàn)能力也隨之隨著蛋白質(zhì)的含量的增加，其特征性基團(tuán)的表現(xiàn)能力也隨之呈現(xiàn)正相關(guān)的變化。因此，可以用通過(guò)凱氏定氮法已測(cè)定蛋呈現(xiàn)正相關(guān)的變化。因此，可以用通過(guò)凱氏定氮法已測(cè)定蛋白質(zhì)含量的食品為標(biāo)準(zhǔn)樣（稱(chēng)之與待測(cè)樣具有同源蛋白質(zhì)的白質(zhì)含量的食品為標(biāo)準(zhǔn)樣（稱(chēng)之與待測(cè)樣具有同

3、源蛋白質(zhì)的標(biāo)樣），在其適合的條件下測(cè)定吸光度并制備標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線。標(biāo)樣），在其適合的條件下測(cè)定吸光度并制備標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線。在相同條件下測(cè)同源的待測(cè)樣品的光密度，然后從標(biāo)準(zhǔn)吸收在相同條件下測(cè)同源的待測(cè)樣品的光密度，然后從標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線上查蛋白質(zhì)的含量。曲線上查蛋白質(zhì)的含量。比色法包括：比色法包括：雙縮脲法雙縮脲法紫外分光光度法紫外分光光度法色素結(jié)合法色素結(jié)合法由于是用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，而比色法由于是用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，而比色法的測(cè)定液必須是真溶液，故要求采用此類(lèi)方法的樣的測(cè)定液必須是真溶液，故要求采用此類(lèi)方法的樣品，其蛋白質(zhì)是可溶的（對(duì)測(cè)試時(shí)使用的溶劑而品，其蛋白質(zhì)是可溶的（對(duì)測(cè)試時(shí)使用的

4、溶劑而言）。言）。在一般情況下，蛋白質(zhì)的溶解是速度是比較低在一般情況下，蛋白質(zhì)的溶解是速度是比較低的，所以在進(jìn)行樣品預(yù)處理時(shí)應(yīng)做劇烈振蕩，從而的，所以在進(jìn)行樣品預(yù)處理時(shí)應(yīng)做劇烈振蕩，從而使蛋白質(zhì)充分地溶液于溶劑中。使蛋白質(zhì)充分地溶液于溶劑中。要求用與待測(cè)樣品具有同源蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)制作要求用與待測(cè)樣品具有同源蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線！標(biāo)準(zhǔn)曲線！雙縮脲在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合成紅紫色的絡(luò)合雙縮脲在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合成紅紫色的絡(luò)合物，此反應(yīng)稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵，與雙物，此反應(yīng)稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故能呈此反應(yīng)?？梢园汛朔磻?yīng)看作是蛋白質(zhì)縮脲結(jié)

5、構(gòu)相似，故能呈此反應(yīng)?？梢园汛朔磻?yīng)看作是蛋白質(zhì)所特有反應(yīng)。所特有反應(yīng)。本方法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度常用的方法之一，操作簡(jiǎn)便迅本方法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度常用的方法之一，操作簡(jiǎn)便迅速。但此法靈敏度較差。速。但此法靈敏度較差。本方法可用于牛乳、豆類(lèi)、油料、谷類(lèi)種子制品（如小本方法可用于牛乳、豆類(lèi)、油料、谷類(lèi)種子制品（如小麥粉）蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。對(duì)于其它種類(lèi)食品，應(yīng)用范圍較麥粉）蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。對(duì)于其它種類(lèi)食品，應(yīng)用范圍較小。小。在蛋白質(zhì)的側(cè)鏈中，有許多酸性基團(tuán)或堿性基團(tuán)，它在蛋白質(zhì)的側(cè)鏈中，有許多酸性基團(tuán)或堿性基團(tuán)，它們可以使蛋白質(zhì)的溶液呈現(xiàn)堿性或酸性；而且，它們還有們可以使蛋白質(zhì)的溶液呈現(xiàn)堿性或酸性；而且

6、，它們還有吸附堿性色素或酸性色素能力，并與對(duì)應(yīng)的色素生成吸附堿性色素或酸性色素能力，并與對(duì)應(yīng)的色素生成“蛋蛋白質(zhì)色素白質(zhì)色素”的沉淀。據(jù)此，可用色素結(jié)合法對(duì)蛋白質(zhì)用的沉淀。據(jù)此，可用色素結(jié)合法對(duì)蛋白質(zhì)用比色法作定量分析。比色法作定量分析。此法是近年來(lái)發(fā)展比較快的蛋白質(zhì)定量分析方法，在此法是近年來(lái)發(fā)展比較快的蛋白質(zhì)定量分析方法，在日本用于色素結(jié)合法的染料（色素）已用日本用于色素結(jié)合法的染料（色素）已用5050余種。余種。有的色素與蛋白質(zhì)生成可溶性有色有的色素與蛋白質(zhì)生成可溶性有色“色素蛋白質(zhì)結(jié)色素蛋白質(zhì)結(jié)合物，如合物，如考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250色素結(jié)合法。色素結(jié)合法。紫外線吸收光譜法是直接

7、測(cè)定芳香族氨基酸對(duì)紅外紫外線吸收光譜法是直接測(cè)定芳香族氨基酸對(duì)紅外線吸收光譜（酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰為線吸收光譜（酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰為280280納米）納米）及肽鍵對(duì)紅外線吸收光譜（肽鍵的最大吸收峰為及肽鍵對(duì)紅外線吸收光譜（肽鍵的最大吸收峰為190190納米）納米）來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的一種方法。來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的一種方法。應(yīng)用應(yīng)用可用于測(cè)定牛乳、小麥面粉、豆類(lèi)、蛋黃及肉制品中的可用于測(cè)定牛乳、小麥面粉、豆類(lèi)、蛋黃及肉制品中的蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量。1 1試劑試劑959597%97%醋酸溶液。醋酸溶液。2 2樣品測(cè)定操作樣品測(cè)定操作準(zhǔn)確吸取牛乳準(zhǔn)確吸取牛乳0.3ml0.3ml置于置于2

8、5ml25ml比色管中，以比色管中，以959597%97%醋酸醋酸溶液定容。搖動(dòng)溶液定容。搖動(dòng)1 1分鐘，于分鐘，于280280納米處測(cè)定其光密度。納米處測(cè)定其光密度。3 3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備準(zhǔn)確吸?。ㄒ延脛P氏定氮法測(cè)得蛋白質(zhì)含量的）標(biāo)準(zhǔn)牛準(zhǔn)確吸?。ㄒ延脛P氏定氮法測(cè)得蛋白質(zhì)含量的）標(biāo)準(zhǔn)牛乳乳0.10.1、0.20.2、0.30.3、0.40.4、0.5ml0.5ml分別置于分別置于25ml25ml比色管中，以比色管中，以97%97%醋酸溶液定容，其余同樣品測(cè)定操作。醋酸溶液定容，其余同樣品測(cè)定操作。以標(biāo)準(zhǔn)樣的加入量為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的光密度為縱坐標(biāo)繪以標(biāo)準(zhǔn)樣的加入量為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的光密度

9、為縱坐標(biāo)繪制曲線。制曲線。某種牛奶某種牛奶其單位重量的蛋白質(zhì)有芳香族氨基酸其單位重量的蛋白質(zhì)有芳香族氨基酸1010個(gè)，含有個(gè)，含有1%1%蛋白質(zhì)的奶液蛋白質(zhì)的奶液對(duì)其特征性的紫外光的吸收強(qiáng)度為對(duì)其特征性的紫外光的吸收強(qiáng)度為0.20.2。那么，含有。那么，含有X%X%蛋白質(zhì)的奶液蛋白質(zhì)的奶液對(duì)特征性的對(duì)特征性的UVUV的吸收強(qiáng)度為：的吸收強(qiáng)度為：A AX X牛牛 = K= K牛牛C C牛牛= 0.2X= 0.2X某種羊奶某種羊奶其單位重量的蛋白質(zhì)有芳香族氨基酸其單位重量的蛋白質(zhì)有芳香族氨基酸2020個(gè)，含有個(gè)，含有1%1%蛋白質(zhì)的奶液蛋白質(zhì)的奶液對(duì)其特征性的紫外光的吸收強(qiáng)度為對(duì)其特征性的紫外光的吸收強(qiáng)度為0.40.4。那么，含有。那么，含有X%X%蛋白質(zhì)的奶液蛋白質(zhì)的奶液對(duì)特征性